Khóa luận Ứng dụng kỹ thuật RT - PCR để phát hiện virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***00*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT - PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN NHẤT BẢO QUỐC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 - 2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***00*** ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT - PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN Giáo viên hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI PGS.TS TRẦN THỊ DÂN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 - 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN NHẤT BẢO QUỐC LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Các Thầy Cô và anh chị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. Cô Bích Liên, Thầy Ngọc, chị Trang và các Thầy Cô khoa Chăn Nuôi Thú Y đã tận tình giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp Các bạn lớp Công Nghệ Sinh học 27 đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Đặc biệt xin chân thành cảm ơn: TS. Nguyễn Ngọc Hải và PGS.TS Trần Thị Dân đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận. Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, những người đã sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ và luôn bên con trong mọi thời điểm. Thủ Đức, ngày 25 tháng 08 năm 2005 Nguyễn Nhất Bảo Quốc i TÓM TẮT NGUYỄN NHẤT BẢO QUỐC, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Đề tài: “ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN”. Đề tài được thực hiện từ ngày 10/03/2005 đến ngày 15/08/2005 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trường Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh. Hội đồng hướng dẫn: TS. Nguyễn Ngọc Hải PGS.TS. Trần Thị Dân Mục tiêu của đề tài là thăm dò khả năng sử dụng quy trình RT-PCR để phát hiện virus gây bệnh PRRS trên lợn. Nội dung nghiên cứu bao gồm: - Xây dựng quy trình RT-PCR trên mẫu RNA chuẩn của virus gây bệnh PRRS đồng thời kiểm tra khả năng của ba loại Taq dự kiến sử dụng (Taq Beat Hot Start của công ty Promega, Taq polymerase của công ty Biorad, Taq polymersa của công ty ABgene). - Ly trích RNA trên các mẫu phổi bằng quy trình dùng TRIzol và điện di RNA tổng số nhằm kiểm tra khả năng sử dụng quy trình này trong việc ly trích RNA của virus. - Ly trích RNA từ các mẫu huyết thanh và dịch nuôi cấy tế bào từ những lợn nghi ngờ bị nhiễm bệnh PRRS dựa vào kết quả ELISA. Sau đó thực hiện phản ứng RT-PCR để kiểm tra sự hiện diện RNA của virus gây bệnh PRRS trong các mẫu này. Kết quả, đã thành công trong việc xây dựng quy trình phát hiện RNA chuẩn của virus gây bệnh PRRS và đã áp dụng thành công trong việc sử dụng TRIzol để ly trích RNA. Tiến hành RT-PCR với sản phẩm ly trích RNA từ các mẫu thu nhận bằng cả hai quy trình sử dụng bộ kit và sử dụng TRIzol, kết quả thu nhận là tất cả các mẫu xét nghiệm đều không có sự hiện diện của virus tại thời điểm xét nghiệm. ii MỤC LỤC Tên mục Trang LỜI CẢM TẠ .......................................................................................................... iii TÓM TẮT ................................................................................................................. iv MỤC LỤC .................................................................................................................. v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... viii DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ........................................................ ix Phần I: MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1 1.2 Mục đích và yêu cầu ........................................................................................ 2 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 3 2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn .................................................. 3 2.1.1 Giới thiệu................................................................................................... 3 2.1.2 Lịch sử bệnh .............................................................................................. 3 2.1.3 Dịch tễ học ................................................................................................ 4 2.1.4 Các con đường lây nhiễm ......................................................................... 5 2.1.4.1 Sự lây truyền dọc ................................................................................. 5 2.1.4.2 Sự lây truyền ngang ............................................................................. 6 2.1.5 Triệu chứng lâm sàng ................................................................................ 7 2.1.6 Bệnh tích ................................................................................................... 8 2.2 Các phương pháp dùng trong chẩn đóan bệnh do virus PRRS gây ra ............. 8 2.2.1. Phân lập virus sống ................................................................................... 8 2.2.2. Phân lập virus hoặc kháng nguyên virus ................................................... 9 2.2.3. Phương pháp phát hiện kháng thể trong huyết thanh .............................. 10 2.2.4. Phương pháp RT- PCR để phát hiện virus gây bệnh PRRS ................... 12 2.3. Phương pháp PCR .......................................................................................... 13 2.3.1. Nguyên tắc .............................................................................................. 13 2.3.2. Các thành phần tham gia phản ứng PCR ................................................ 13 2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR .............................................................. 14 2.3.4. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR .................................................. 15 iii 2.4 Phương pháp RT-PCR ................................................................................... 16 2.4.1. Nguyên tắc của phản ứng RT-PCR ......................................................... 16 2.4.2. Các enzyme sử dụng cho phiên mã ngược .............................................. 16 2.4.3. Các primer trong phiên mã ngược .......................................................... 18 PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP ..................................................... 20 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................. 20 3.2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 20 3.3. Vật liệu và hóa chất ........................................................................................ 20 3.3.1. Mẫu xét nghiệm ...................................................................................... 20 3.3.2. Cặp primer trong phản ứng RT-PCR ...................................................... 20 3.3.3. Vật liệu và hóa chất cho chiết tách RNA ................................................ 21 3.3.4. Vật liệu và hóa chất cho điện di RNA .................................................... 21 3.3.5. Vật liệu và hóa chất cho RT-PCR ........................................................... 21 3.3.6. Vật liệu và hóa chất cho điện di sản phẩm RT-PCR............................... 22 3.4. Thiết bị và dụng cụ ......................................................................................... 22 3.5. Các phương pháp ........................................................................................... 22 3.5.1. Bảo quản dịch nuôi cấy tế bào ................................................................ 22 3.5.2. Chẩn bị và bảo quản mẫu huyết thanh .................................................... 23 3.5.3. Tách chiết RNA từ dịch nuôi cấy tế bào và huyết thanh theo quy trình sử dụng TRIzol ................................................................................................... 23 3.5.4. Phương pháp điện di RNA trên gel biến tính .......................................... 24 3.5.5. Phương pháp RT-PCR trên RNA virus ................................................... 25 3.5.6. Điện di sản phẩm RT-PCR...................................................................... 27 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 28 4.1. Kết quả RT-PCR trên mẫu chuẩn của PRRSV .............................................. 28 4.1.1. RT-PCR với Taq beat hot start (Promega) .............................................. 28 4.1.2. RT-PCR với Taq polymerase của Biorad và ABgene ............................ 29 4.2. Kết quả RT-PCR trên mẫu RNA ly trích ....................................................... 30 4.2.1. RT-PCR với Taq beat hot start trên RNA ly trích từ huyết thanh bằng phương pháp sử dụng TRIzol .............................................................................. 30 4.2.2. RT-PCR với Taq polymerase của Biorad và ABgene trên các mẫu ly trích từ dịch nuôi cấy tế bào sử dụng quy trình ly trích theo bộ kit ............................ 31 iv 4.3. Điện di RNA trên mẫu ly trích ........................................................................ 32 4.4. Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp primer ........................................................ 33 4.5. RT-PCR sử dụng cặp primer P1, P2 .............................................................. 33 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 35 5.1. Kết luận .......................................................................................................... 35 5.2. Đề nghị ........................................................................................................... 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 36 PHỤ LỤC .................................................................................................................. x v DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT - AMV: Avian myeloblastosis virus - DEPC: Diethyl pyrocarbonate - dNTP: Deoxynucleotide triphosphate - EAV: Equine arteritis virus - EDTA: Ethylene diamine tetra acetid acide - ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay - FAb: Fluorescent antibody - FA: Formaldehyde agarose - IHC: Immunohistochemistry staining - IMPA: Immunoperoxidase monolayer assay - LDV: Lactase dehydrogenase elevating virus - MDS: Mystery swine disease - MOPS: 3- morpholine propane sulphonate - ORF: Open reading fraction - PAMs: Pulmonary alveolar macrophage - PRRSV: Porcine reproduction and respiratory syndrome virus - RT-PCR: Reverse transcriptase polymerase chain reaction - SHFV: Simian hemorrhagic fewer virus - SNV: Serum neutralization virus - TBE: Tris borate EDTA - TE: Tris EDTA - μl: Micro lit vi DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Tên mục Trang Sơ đồ 2.1. Quá trình hoặt động của các primer trong phiên mã ngược ........................ 19 Bảng 3.1. Cặp primer sử dụng trong phản ứng .............................................................. 21 Bảng 3.2. Thành phần phản ứng RT-PCR ..................................................................... 25 Bảng 3.3. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR ............................................................. 26 Hình 4.1. Sản phẩm RT-PCR trên mẫu RNA chuẩn khi dùng với Taq Beat Hot Start 28 Hình 4.2. Sản phẩm RT-PCR trên mẫu RNA chuẩn khi dùng Taq polymerase của công ty Biorad và Abgene. ...................................................................................................... 29 Hình 4.3. Sản phẩm RT-PCR với Taq Beat trên mẫu chuẩn và 5 mẫu ly trích theo TRIzol .............................................................................................................................. 30 Hình 4.4. Sản phẩm RT-PCR dùng Taq ABgene trên mẫu chuẩn và 5 mẫu ly trích theo bộ kit ................................................................................................................................ 31 Hình 4.5. Sản phẩm điện di RNA sau ly trích................................................................ 32 Hình 4.6. Sản phẩm RT-PCR dùng cặp primer P1, P2 trên một mẫu RNA chuẩn và 5 mẫu huyết thanh ly trích theo quy trình dùng TRIzol ................................................... 34 vii Phần I. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) là tác nhân chính gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn – PRRS (porcine reproductive and respiratory syndrome). Đây là một bệnh mới, phức tạp. Đặc trưng của bệnh là gây sẩy thai ở giai đoạn cuối, chết thai và thai khô hoặc lợn con sinh ra yếu, bệnh biểu hiện ở hệ hô hấp của lợn con theo mẹ và lợn cai sữa, bệnh còn làm trì hoãn sự động dục và những khó khăn về hô hấp ở lợn. Bệnh có thể xảy ra ở tất cả các kiểu chăn nuôi: nuôi nhốt hay thả rong; tập trung hay phân tán, qui mô đàn lớn hay nhỏ và tình trạng sức khoẻ tốt hay xấu. Nguyên nhân lây bệnh phổ biến là do thiếu cách ly hoặc kiểm dịch đối với lợn mua, ở gần đàn mắc bệnh và qui mô đàn lớn. Do tính chất nghiêm trọng và khả năng lây lan rộng của bệnh, việc chẩn đoán và phát hiện bệnh sớm là rất quan trọng. Tuy nhiên việc phát hiện theo phương pháp nuôi cấy truyền thống thì lại rất khó khăn và mất nhiều thời gian. Cho đến những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đã phát triển một cách mạnh mẽ và chứng minh được vai trò ưu việt, trong đó kỹ thuật PCR ngày càng được ứng dụng rộng rãi hơn. Đây là một kỹ thuật có độ chính xác cao, ít tiêu tốn thời gian và về mặt chi phí thì có thể chấp nhận được. Nhằm mục đích ứng dụng rộng rãi kỹ thuật sinh học phân tử vào công tác chẩn đoán, được sự chấp nhận của bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Ngọc Hải và PGS.TS Trần Thị Dân, chúng tôi thực hiện đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật RT - PCR để phát hiện virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn”. 1 1.2. Mục tiêu – yêu cầu Mục tiêu Thăm dò khả năng ứng dụng kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcriptase polymerase chain reaction) trong chẩn đoán virus PRRS. Yêu cầu - Thiết lập quy trình phát hiện sự hiện diện RNA của virus PRRS trong mẫu RNA chuẩn. - Ly trích RNA và điện di RNA từ một số mẫu bệnh phẩm. - Sử dụng quy trình RT - PCR vừa thiết lập để kiểm tra sự hiện diện RNA virus trong huyết thanh và trong dịch nuôi cấy tế bào. 2 Phần II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) 2.1.1. Giới thiệu Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn – PRRS (porcine reproductive and respiratory syndrome) là bệnh gây ra bởi virus thuộc nhóm Arteriviridae có khả năng xâm nhiễm vào đại thực bào và mô. Đặc biệt, bệnh có một lịch sử dịch tễ học phức tạp và rất khó kiểm soát đối với những điều kiện thông thường trong chăn nuôi lợn công nghiệp. Đây là một trong những bệnh gây ra sự tổn thất vô cùng lớn trong nền công nghiệp nuôi lợn trên thế giới Bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1987 ở Mỹ và được gọi với nhiều tên gọi khác nhau như “bệnh thần bí ở lợn”, “bệnh tai xanh ở lợn”, “hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn”(2). Đầu tiên, trên cơ sở về hình thái học, tổ chức gene, sự sao chép, dịch mã và vị trí protein giống nhau, PRRSV đã được định danh cùng nhóm với virus gây viêm động mạch ở ngựa (EAV: equine arteritis virus), virus LDV (lactate dehydrogenase elevating virus) và virus gây sốt xuất huyết ở khỉ (SHFV: simian hemorrhagic fewer virus). Những họ virus này có khả năng sao chép trong đại thực bào và nhiễm bệnh lâu dài trên vật chủ tự nhiên của chúng (dẫn liệu từ tài liệu tham khảo 7). Nhìn chung, PRRS có những biểu hiện lâm sàng giống nhau giữa dòng Châu Mỹ và dòng Châu Âu. Tuy nhiên, những dòng này có những đặc tính gây bệnh, kiểu kháng nguyên và những đặc tính di truyền khác nhau. Những đặc điểm khác nhau này là cơ sở cho việc phân loại các dòng thành hai nhóm nhỏ: nhóm A gồm hầu hết các dòng ở Nam Mỹ và nhóm B gồm hầu hết các dòng ở Châu Âu (19). 2.1.2. Lịch sử bệnh (11) Vào cuối thập niên 80 đã xảy ra một trận đại dịch ở Mỹ. Người ta mô tả đầu tiên về một hội chứng bệnh ở vùng phía nam Carolina, bao gồm việc suy giảm mạnh khả năng sinh sản, viêm phổi sau cai sữa, gia tăng tỉ lệ tử vong ở heo. Nguyên nhân lúc bấy giờ chưa được biết, do đó được gọi với tên gọi “bệnh thần bí ở lợn” (MSD: mystery swine disease). 3 Đầu tiên có rất nhiều ý kiến về nguyên nhân gây ra trận đại dịch, bao gồm, nguyên nhân do virus viêm não và cơ tim (Encephalomyocarditis), hog cholera virus, porcine enterovirus, porcine parvovirus, pseudorabies virus,… và cả nguyên nhân do thức ăn bị nhiễm độc tố nấm (mycotoxins). Ở Canada, một dạng virus gây bệnh cúm type A được phân lập ở heo con bệnh về hô hấp và cũng được đưa vào danh sách nghi ngờ nguyên nhân gây ra “bệnh thần bí”. Việc tìm hiểu nguyên nhân gây bệnh ngày càng khó khăn bởi vì nhiều tác nhân gây bệnh được phân lập từ “bệnh thần bí”. Ở Châu Âu, một trận dịch tương tự như MSD cũng được báo cáo ở vùng Münster của Đức (1992), bệnh này lập tức lan ra một cách nhanh chóng và có đến khoảng 3000 trận dịch đã xảy ra ở Đức cho đến tháng 5 năm 1991. Không tìm thấy sự liên quan nào giữa trận dịch ở Đức và ở Mỹ (Anoon, 1991). Căn bệnh này cũng được báo cáo ở Netherlands vào tháng 1 năm 1991 và ở Belgium vào tháng 3 năm 1991 (OIE, 1992). Trường hợp đầu tiên của bệnh phát hiện ở Tây Ban Nha là qua biểu hiện lâm sàng của đàn heo sống nhập khẩu. Ba trận dịch được báo cáo ở Tây Ban Nha, trong đó hai trường hợp xảy ra ở tỉnh Huesca và một trường hợp xảy ra ở tỉnh Lerida, tất cả các heo ở đây đều bị giết thịt nhanh chóng. Ở Anh, “bệnh tai xanh” (một dạng biểu hiện lâm sàng của bệnh PRRS) xuất hiện vào tháng 5 năm 1991 . Điều đáng chú ý là ở Anh tại thời điểm này không có hiện tượng nhập khẩu heo sống, tinh trùng hay phôi từ những quốc gia đang có bệnh MDS trong vòng 12 tháng; vì vậy không có sự giải thích rõ ràng về nguồn gốc gây ra căn bệnh này ở Anh. Ở Pháp, những trận dịch đầu tiên xảy ra ở Brittany vào tháng 10 năm 1991, sau đó là trận dịch ở Đan Mạch vào tháng 3 năm 1992. Ở châu Á, trận dịch đầu tiên xuất hiện ở Nhật năm 1988 và Đài Loan vào năm 1991. Như vậy, đại dịch MSD đã lan truyền trên hầu hết các trung tâm chăn nuôi lợn lớn trên thế giới chỉ trong khoảng thời gian vài năm. Bệnh này trước đây được gọi với nhiều tên khác nhau. Cho đến năm 1992, tổ chức dịch tể thế giới (OIE) và hội nghị quốc tế về bệnh này ở St.Paul, Minnestota đã nhất trí sử dụng tên PRRS để chỉ loại bệnh này. 2.1.3. Dịch tễ học Bệnh PRRS nổi lên trong ngành chăn nuôi lợn ở Bắc Mỹ và Châu Âu từ những năm 1987. Bệnh này cũng gặp ở Mỹ, Hà Lan, Pháp, Canada, Đức và Anh. Điều tra huyết thanh học ở đàn lợn nái có biểu hiện lâm sàng nghi ngờ nhiễm bệnh PRRS cho 4 thấy rằng 75 % bệnh có phản ứng dương tính với virus Lelystad, gần 10 % có dương tính với các virus khác như Encephalomyocarditis(2). Ở Châu Âu, bệnh này được phát hiện lần đầu tiên ở Đức vào tháng 11/1991, ở Hà Lan vào tháng 1/1991. Bệnh này nhanh chóng lây lan theo hướng tây nam và sau đó chuyển sang hướng bắc theo hư