Luận án Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp

-1- Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề ĐẶT VẤN ĐỀ “Thế kỷ 21 là thế kỷ của các bệnh Nội tiết và các Rối loạn chuyển hóa mà điển hình là bệnh đái tháo đường (Bệnh tiểu đường)”. Nhận xét này của nhóm chuyên gia về dự báo tình hình bệnh tật của Tổ chức Y tế thế giới đã đang trở thành hiện thực với những con số cụ thể. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2008) [77], hiện nay trên toàn thế giới có khoảng 180 triệu người mắc bệnh tiểu đường và ước tính con số này sẽ tăng gấp đôi vào năm 2030, chiếm khoảng 5% dân số thế giới. Đáng lo ngại hơn là các biến chứng của bệnh, cứ 10 giây có một người tử vong do nguyên nhân đái tháo đường, cứ 30 giây lại có một người đái tháo đường bị cắt cụt chi và cứ mỗi ngày có 5000 người mất khả năng nhìn do biến chứng mắt của bệnh. Mỗi năm có hơn 3,2 triệu người chết vì các bệnh liên quan tới đái tháo đường tương đương với số người tử vong vì bệnh HIV/AIDS [1]. Bệnh tiểu đường (BTĐ) đang trở thành gánh nặng cho mỗi nền kinh tế xã hội, mặc dù mỗi năm hàng nghìn tỷ đôla Mỹ được chi phí cho điều trị bệnh, nhưng chưa bao giờ và sẽ không bao giờ những chi phí khổng lồ về kinh tế có thể lấp đầy được những tổn thất, nhất là những mất mát về tinh thần do bệnh tật gây ra. Thực tế đáng lo ngại hơn là tình trạng bệnh xuất hiện ngày càng nhiều từ lớp trẻ [1]. Ở Việt Nam, tỷ lệ người mắc BTĐ ngày càng cao và ở các thành phố lớn tỷ lệ này đã tăng gấp đôi từ 2% lên 4% trong 10 năm giai đoạn 1990-2000. Số người mắc BTĐ hiện nay khoảng 4,5 triệu người, chiếm 5,7% dân số, trở thành nước có tốc độ phát triển BTĐ nhanh nhất thế giới [1]. Nguyên nhân của BTĐ là do thiếu insulin hoặc do cơ thể người bệnh kháng insulin. Insulin là một polypeptide hormone được sinh ra nhờ các tế bào β của tuyến tụy động vật, có vai trò điều hoà lượng đường trong máu. Phương -2- Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề pháp điều trị BTĐ phổ biến hiện nay là tiêm insulin định kỳ cho người bệnh. Do số lượng người mắc BTĐ ngày càng cao nên nhu cầu sử dụng insulin càng lớn. Ở châu Âu, lượng insulin đã tăng lên 3 lần trong vòng 12 năm từ 1995-2007. Theo ước tính, nhu cầu insulin trên thế giới tăng từ khoảng 5.000kg trong năm 2007 lên khoảng 16.000kg vào năm 2010, với thị trường dự tính khoảng 11,8 tỷ Mỹ kim [41]. Năm 1978, lần đầu tiên các nhà khoa học của công ty công nghệ sinh học Genetech đã dòng hóa thành công gen mã hóa cho insulin người vào vector biểu hiện trong E. coli và đã cho phép công ty Eli Lilly sử dụng kỹ thuật này để sản xuất insulin người tái tổ hợp với tên thương mại là Humulin. Năm 1982, Humulin đã được FDA (Food & Drug Administration – Cơ quan Quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ) cho phép lưu hành. Hiện nay có nhiều công ty dược phẩm trên thế giới sản xuất insulin tái tổ hợp như: Eli Lilly, Novo disk, Sanofi Aventis … với nhiều loại sản phẩm insulin khác nhau. Công nghệ sản xuất insulin hiện nay thường được tiếp cận theo hai phương pháp: phương pháp một chuỗi polypeptide và phương pháp hai chuỗi polypeptide. Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp bằng phương pháp một chuỗi polypeptide bao gồm ba bước cơ bản. Đầu tiên là bước tạo dòng chủng chủ (thường là E. coli) có khả năng mang gen ngoại tổng hợp các chất tiền thân của insulin (proinsulin). Đây là khâu then chốt quyết định sự thành công của công nghệ do cần phải biến đổi các codon thích hợp để tăng cường hiệu quả biểu hiện. Tiếp theo là bước lên men, cảm ứng biểu hiện, thu nhận proinsulin và xử lý để thu nhận insulin. Protein được biểu hiện dưới dạng thể vùi nằm trong tế bào chất, do vậy cần phải biến tính để làm tan, sau đó tiến hành tái gấp cuộn để có proinsulin có cấu hình tự nhiên. Proinsulin tái gấp cuộn được xử lý bằng protease cắt loại đoạn nối nội phân tử (đoạn peptide C) để thu insulin có hoạt tính. Đối với phương pháp sản xuất theo 2 mạch polypeptide, -3- Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề trước hết phải tạo dòng các chủng chủ riêng rẽ mang các gen mã hóa cho 2 chuỗi polypeptide khác nhau (chuỗi A, chuỗi B). Sau đó tinh chế thu nhận các chuỗi polypeptide A và B và thực hiện phản ứng tạo cầu nối disulfide để thu nhận insulin có hoạt tính. Ở Việt Nam, nhu cầu sử dụng insulin rất cao, tuy nhiên toàn bộ nguồn insulin sử dụng cho bệnh nhân mắc BTĐ đều phải nhập ngoại nên vừa gây tốn kém ngoại tệ vừa không chủ động được nguồn thuốc để đáp ứng chữa trị kịp thời cho bệnh nhân. Để đảm bảo cho điều trị toàn bộ bệnh nhân mắc BTĐ hàng ngày với liều dùng 0,5-1,0 U/kg trọng lượng cơ thể trong một ngày [78], thì Việt Nam cần phải nhập ngoại khoảng từ 120-240 triệu U/ năm, tương đương 420-840 kg insulin/ năm (100U =3,5 mg). Năm 2001, giấy phép độc quyền sản xuất insulin tái tổ hợp chính thức hết hiệu lực, mở ra cơ hội lớn cho các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam, có thể tiếp cận được công nghệ hiện đại để phát triển qui trình sản xuất insulin người tái tổ hợp trong nước, mang lại triển vọng góp phần giải quyết khó khăn trên. Mặc dù bản quyền sản xuất insulin bằng công nghệ DNA tái tổ hợp đã hết hạn tuy nhiên các công ty dược phẩm vẫn tiếp tục giữ những bí quyết công nghệ có tính thế mạnh của công ty nên rất khó tiếp cận để có được qui trình công nghệ đầy đủ nhằm sản xuất insulin. Do vậy, cần phải nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ riêng dựa trên những thông tin đã công bố và trình độ công nghệ sẵn có để tiến đến việc sản xuất insulin trong nước đáp ứng được yêu cầu đặt ra. Năm 2007, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh được giao nhiệm vụ thực hiện đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp điều trị bệnh đái tháo đường”, mã số -4- Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề KC.04.09/06-10. Nội dung nghiên cứu của luận án là thực hiện một phần trong nội dung của đề tài cấp nhà nước này. Về mặt khoa học, mục tiêu của luận án nhằm bước đầu nghiên cứu qui trình tổng hợp insulin người tái tổ hợp theo phương pháp một chuỗi polypeptide trong E. coli bao gồm tạo dòng E. coli tái tổ hợp biểu hiện mini-proinsulin, lên men, tái gấp cuộn mini-proinsulin và xử lý để tạo insulin có hoạt tính. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài là ứng dụng công nghệ gen, công nghệ lên men và công nghệ protein để tạo ra chế phẩm insulin có hoạt tính dùng làm thuốc trị bệnh tiểu đường. Luận án tập trung nghiên cứu cụ thể các vấn đề sau: - Tạo chủng E. coli tái tổ hợp có mang vector biểu hiện mini-proinsulin tái tổ hợp của người. - Xây dựng qui trình lên men nuôi cấy chủng E. coli tái tổ hợp biểu hiện mini-proinsulin. - Thiết lập qui trình thu nhận và tinh sạch mini-proinsulin từ tế bào chủng E. coli. - Xây dựng qui trình tái gấp cuộn mini-proinsulin và xử lý thu nhận insulin có hoạt tính. - Thử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp trên chuột.