Luận văn Ảnh hưởng của ph và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của enzyme papain trong đu đủ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM LÊ TH
ANH TH ẢNH HƯỞNG CỦA pH VÀ NHIỆT ĐỘ LÊN HOẠT TÍNH XÚC TÁC CỦA ENZYME PAPAIN TRONG ĐU ĐỦ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã ngành: 08 Người hướng dẫn NGUYN TH
THU THY NĂM 2008 Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang ii LỜI CẢM ƠN Trước tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến cô Nguyễn Thị Thu Thủy, người đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cũng như truyền đạt những kiến thức chuyên môn sâu sắc, bổ ích để em có thể hoàn thành tốt đề tài luận văn này. Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm đã tận tụy giảng dạy và truyền thụ những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập. Em chân thành cảm ơn quý thầy cô của bộ môn Sinh Lý- Sinh Hóa và phòng thực tập Sinh Hóa đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ trang thiết bị cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy cố vấn học tập Nguyễn Hữu Lộc và tập thể các bạn lớp Công Nghệ Thực Phẩm K29 đã giúp đỡ và động viên em trong suốt khóa học qua cũng như thời gian thực hiện đề tài. Cần Thơ, ngày …tháng…năm 2008 Sinh viên thực hiện Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang iii TÓM LƯỢC Với nền nông nghiệp phát triển lâu đời và phong phú như nước ta, có thể nói việc cung ứng các loại nguyên liệu trái cây không phải là khan hiếm về cả số lượng cũng như chất lượng; và đu đủ là loại cây ăn quả khá phổ biến, thân thuộc với người dân trên khắp đất nước. Tuy nhiên, đu đủ chỉ chủ yếu được sử dụng cho tươi sống nên giá trị kinh tế vẫn chưa cao vì thời gian bảo quản tương đối ngắn. Sự ra đời chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết và tinh khiết (một loại protease) thu nhận từ nhựa đu đủ xanh được xem như một phương pháp tích cực nhằm thúc đẩy giá trị của cây đu đủ vốn lâu đời này. Trên cơ sở đó, đề tài tiến hành khảo sát khả năng trích ly enzyme từ nhựa đu đủ xanh và yếu tố bên ngoài (nhiệt độ, pH) ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân protein (casein) của papain trong khoảng nhiệt độ từ 30oC - 60oC, pH = 5,5 - 8,0. Từ đó có thể tìm ra được quy luật và nhiệt độ, pH thích hợp để enzyme thể hiện hoạt tính cao nhất. Kết quả thí nghiệm cho thấy, có khả năng trích ly và tinh chế chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết từ nhựa đu đủ xanh ở dạng bột mịn, trắng có độ ẩm thấp và bảo quản lạnh đông (-20 oC ) trong quá trình sử dụng. Có sự tương tác qua lại giữa nhiệt độ và pH môi trường lên hoạt tính xúc tác của enzyme papain. Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang iv MỤC LỤC MỤC LỤC .......................................................................................................i DANH SÁCH HÌNH.....................................................................................vi DANH SÁCH BẢNG.................................................................................. vii CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ ..........................................................................1 1.1 Giới thiệu chung ......................................................................................................1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ...............................................................................................1 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU.......................................................2 2.1 Giới thiệu về cây đu đủ ..........................................................................................2 2.2 Giới thiệu về papain trong đu đủ...........................................................................3 2.2.1 Cấu tạo và hoạt tính............................................................................................3 2.2.2 Cơ chế hoạt hóa và kìm hãm...............................................................................5 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng .........................................................................................6 2.3 Giới thiệu về phản ứng thủy phân của papain .....................................................8 2.4 Giới thiệu về cơ chất casein ...................................................................................9 2.5 Phương pháp xác định hoạt tính papain (phương pháp Kunitz)......................11 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...12 3.1 Phương tiện nghiên cứu........................................................................................12 3.1.1 Địa điểm, thời gian thực hiện ...........................................................................12 3.1.2 Nguyên liệu .......................................................................................................12 3.1.3 Hóa chất thí nghiệm..........................................................................................12 3.1.4 Thiết bị thí nghiệm ............................................................................................12 3.2 Phương pháp nghiên cứu......................................................................................12 3.2.1 Phương pháp trích ly papain từ nhựa đu đủ.....................................................12 3.2.2 Phương pháp tinh chế papain bằng cồn ...........................................................13 3.2.3 Phương pháp chuẩn bị casein 1% ....................................................................14 3.3 Bố trí thí nghiệm....................................................................................................15 3.3.1 Thí nghiệm trích ly papain và tinh chế papain .................................................15 3.3.2 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hoạt tính của papain...15 Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang v CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...............................................17 4.1 Trích ly và tinh chế papain...................................................................................17 4.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết..........................................................................18 4.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết.....................................................................................................................18 4.2.2 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết ..........................................................................................................................20 4.2.3 Ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết.....................................................................................23 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................26 5.1 Kết luận .................................................................................................................26 5.2 Đề nghị ..................................................................................................................26 TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................27 PHỤ LỤC 1 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH..............................................v PHỤ LỤC 2 ................................................................................................ viii Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang vi DANH SÁCH HÌNH Hình Tựa hình Trang 1 Cây đu đủ thu lấy nhựa .................................................................................... 2 2 Cấu trúc không gian của papain....................................................................... 4 3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của papain........................................... 7 4 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme .................................................. 7 5 Quy trình trích ly và tinh chế papain bán tinh khiết....................................... 14 6 Quy trình chuẩn bị dung dịch casein.............................................................. 14 7 Chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết........................................................ 18 8 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau................................... 21 9 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết trong các điều kiện pH khác nhau.................................................. 23 10 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết ở điều kiện pH 5,5 và 8,0 ........................................................ 24 11 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng tương tác của nhiệt độ xử lý và pH lên hoạt tính của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết trong nhựa đu đủ ..................... 26 12 Quy trình thí nghiệm xác định hoạt tính của papain ........................................ vi 13 Đường chuẩn Tyrosine .................................................................................... vii Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang vii DANH SÁCH BẢNG Bảng Tựa bảng Trang 1 Thành phần dinh dưỡng của đu đủ có trong 304 g nguyên liệu....................... 3 2 Thành phần acid amin trong papain................................................................. 4 3 Thành phần các acid amin có trong casein .................................................... 10 4 Sự thay đổi hoạt tính của enzyme (Tu/mg) theo nhiệt độ .............................. 20 5 Sự thay đổi hoạt tính của enzyme (Tu/mg) theo nhiệt độ ứng với từng pH... 20 6 Sự thay đổi hoạt tính của enzyme (Tu/mg) theo pH ...................................... 22 7 Sự thay đổi hoạt tính của enzyme (Tu/mg) theo pH ứng với từng nhiệt độ... 22 8 Hoạt tính enzyme (Tu/mg) ở các mẫu xử lý nhiệt độ và pH khác nhau ....... 25 9 Kết quả thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý và pH môi trường lên hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain .......................... viii Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 1 CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu chung Với vô số công trình nghiên cứu, phát minh, thành tựu trong lĩnh vực khoa học ứng dụng, công nghệ sinh học ngày càng khẳng định vai trò khoa học mũi nhọn của mình từ những năm đầu thế kỷ XX đến nay. Và công nghệ enzyme - một nhánh không phải là nhỏ bé và đơn giản của cây đại thụ công nghệ sinh học - cũng vì thế mà phát triển rực rỡ. Enzyme được biết đến như một chất xúc tác sinh học nổi trội bởi khả năng thúc đẩy vận tốc phản ứng của chúng. Là một trong ba loại enzyme protease thu nhận từ nguồn gốc thực vật (enzyme tinh chế từ thực vật chỉ chiếm khoảng 4% tổng số enzyme thu nhận từ vi sinh vật, động vật và thực vật) - papain được nhiều người biết đến bởi khả năng thủy phân cơ chất protein mạnh mẽ và sâu sắc từ những bài thuốc sử dụng trong dân gian đến những công trình nghiên cứu đồ sộ với các chế phẩm tinh khiết hay bán tinh khiết trích ly từ nhựa trái đu đủ xanh. Vì thế, việc papain được ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm và cả lĩnh vực phi thực phẩm như y học, công nghiệp thuộc da, công nghệ xử lý chất thải,…cũng không phải là một điều khó hiểu. Đu đủ là loại cây ăn quả có nhiều giá trị dinh dưỡng và tác dụng trị liệu. Đối với nước ta, đu đủ không phải là nguồn nguyên liệu khan hiếm nhưng lại chưa được tận dụng tốt để thu hiệu quả kinh tế cao, phần lớn là sử dụng dạng tươi sống. Vì vậy, tại sao chúng ta lại không dựa vào thế mạnh ấy mà phát triển chế phẩm enzyme papain có giá trị thương mại cao? Tuy nhiên, giống như một số enzyme khác, hoạt tính xúc tác của papain cũng chịu ảnh hưởng bởi nhiều nhân tố cả môi trường ngoài và nội tại, trong đó nhiệt độ và pH là hai nhân tố được quan tâm nhiều nhất trong quá trình tinh chế cũng như sử dụng papain trong các lĩnh vực khác nhau. Khảo sát các ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của papain là việc làm cần thiết, tạo cơ sở cho việc ứng dụng papain một cách hợp lý và hiệu quả nhất. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Trích ly và tinh chế papain bán tinh khiết từ nhựa đu đủ xanh cũng như khảo sát những tác động, ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của papain đối với cơ chất casein. Từ đó, hiểu được quy luật biến thiên về hoạt tính của papain theo sự thay đổi của pH và nhiệt độ, nhằm ứng dụng trong các lĩnh vực thực phẩm và phi thực phẩm khác. Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 2 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cây đu đủ Họ đu đủ (danh pháp khoa học: Caricaceae, đồng nghĩa: Papayaceae) là một họ thực vật có hoa thuộc bộ Cải (Brassicales), có nguồn gốc từ khu vực nhiệt đới Trung, Nam Mỹ và châu Phi, là một trong những loài Caricaceae được trồng phổ biến ở vùng nhiệt đới, bán nhiệt đới. Chúng là các loài cây bụi hay cây gỗ nhỏ thân xốp và mập, thường xanh, tuổi thọ thấp, cao tới 5-10m và không có cành, nhiều loài có quả ăn được. Cụm hoa mọc ở nách lá, kiểu xim hoa. Lá hình chân vịt hay xẻ thùy, mọc so le. Lá và quả xanh chứa nhựa mủ màu trắng. Quả mọng, lớn. Hạt có nội nhũ nhiều dầu. Gần đây đu đủ được trồng nhiều chủ yếu để lấy nhựa nhằm tinh chế enzyme papain có giá trị thương mại cao hơn đu đủ tiêu thụ dạng tươi. Đu đủ được xem là thực phẩm rất giàu vitamin C, A, E, K, các hợp chất folate và muối. Ở Việt Nam, đu đủ được biết đến rất lâu bởi các tác dụng của nó trong việc chữa trị những bệnh thông thường như về đường tiêu hóa, chăm sóc sắc đẹp, đau lưng, viêm dạ dày mãn tính, ho do phế hư, tỳ vị hư nhược, chữa gai cột sống,… rất tốt. Ngoài ra, đu đủ là thực phẩm chứa nhiều carotenoids, chất này có khả năng chống oxy hóa mạnh, rất hữu ích trong việc phòng chống các bệnh tim mạch và ung thư, tăng sức đề kháng cho cơ thể nói chung và bảo vệ da khỏi tác hại của ánh nắng, giúp da tươi nhuận. Trong y học cổ truyền Nam Mỹ, đu đủ được đánh giá có hiệu lực trị bệnh tiểu đường, hen suyễn và chống ký sinh trùng đường ruột và điều trị hiệu quả bệnh ho lao nếu dùng đều đặn trong thời gian dài. (Nguồn: - 25k) Đu đủ là cây trồng quen thuộc và được trồng khắp nơi ở Việt Nam nhưng do chủ yếu được tiêu thụ dạng tuơi sống như thực phẩm hằng ngày nên giá trị kinh tế rất thấp, trái cây thu hoạch lúc chín nên thời gian sử dụng và bảo quản không cao. Tuy nhiên, gần đây một số vùng thuộc miền Trung như Đắc Lắc được sự hỗ trợ của chương trình hợp tác với vương quốc Bỉ, trồng đu đủ để thu enzyme papain nên có bước phát triển khá cao, tạo thu nhập cho người dân và nguồn papain dồi dào cho sinh học ứng dụng. Hình 1: Cây đu đủ thu lấy nhựa Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 3 Thành phần dinh dưỡng của đu đủ được thể hiện trong bảng 1. Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng của đu đủ có trong 304 g nguyên liệu (Nguồn: 2.2 Giới thiệu về papain trong đu đủ 2.2.1 Cấu tạo và hoạt tính i Cấu tạo Nhựa đu đủ xanh là một hỗn hợp gồm nhiều protease như: papain, chymopapain A (gốc amino acid cuối là glutamic acid), chymopapain B (gốc amino acid cuối là tyrosine), proteinase III, proteinase IV, thiolprotease, trong đó papain là protease có hàm lượng cao nhất, khoảng 95% tổng hàm lượng protease có trong nhựa và có ý nghĩa quan trọng nhất. Có thể nói, tùy theo từng phương pháp phân tích mà số lượng acid amin có được trong phân tử papain có thể khác nhau. Nếu theo nghiên cứu của Hill và Smith, papain được cấu tạo từ 185 acid amin thì khi phân tích bằng tia X hiện đại hơn, papain lại chứa đến 212 acid amin, được ổn định bởi 3 cầu nối disufua hình thành từ 6 gốc cystein ở vị trí 22-63, 56-95, 153-200, ba cầu nối này không có chức năng sinh học mà chỉ tăng tính chất bền vững của cấu trúc phân tử và một nhóm -SH tự do ở vị trí 25, trọng lượng phân tử khoảng 23406 Da. Nó có bộ ba xúc tác tạo thành bởi ba acid amin: cystein-25, histidine-159, asparagine-158. Thành phần dinh dưỡng Hàm lượng Đơn vị Nước Năng lượng Cacbohydrat Xơ Tro Calcium Magie Postassium Sodium Vitamin C Folate Vitamin A Vitamin E Vitamin K 270,043 118,56 29,822 5,472 1,854 72,960 30,4 781,28 9,12 187,872 115,52 863,36 3,405 7,0 g kcal g g g mg mg mg mg mg mcg IU mg mg Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 4 Theo tác giả Nguyễn Đức Lượng, thành phần acid amin trong papain đu đủ như sau: Bảng 2: Thành phần acid amin trong papain Amino acid Số lượng Alanine 13 Arginine 10 Aspartic acid 17 Haft – cystine 6 Glutamic acid 17 Glycine 23 Histidine 2 Isoleucine 10 Leucine 10 Lycine 9 Phenylalanine 4 Proline 9 Serine 11 Threonine 7 Tryptophan 5 Tyrosine 17 Valine 15 Methionine 0 (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004) Cấu trúc không gian của phân tử papain có dạng cầu với kích thước: 26 x 48 x 36 A0, mạch chính bị gấp lại thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Trung tâm hoạt động chính nằm trên khe này, nhóm sulfhydryl hoạt động của cystein 25 nằm bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe. Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm -SH của cystein 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen. Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các acid amin là: Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004) Hình 2: Cấu trúc không gian của papain Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 5 ii Hoạt tính Khoảng pH thích hợp để papain hoạt động là 6,0 - 8,0. Nhiệt độ thích hợp để hoạt động tùy vào từng cơ chất khác nhau và có thể duy trì hoạt tính đến 600C. Một điều cần lưu ý là khoảng pH và nhiệt độ tối thích của papain sẽ không cố định mà thay đổi tùy vào nguồn thu nhận, cơ chất phản ứng, cách thức trích ly và tinh chế papain; ứng với mỗi nguồn nguyên liệu và phương pháp tinh chế mà ta sẽ thu được các chế phẩm enzyme có khoảng pH, nhiệt độ hoạt động thích hợp khác nhau. Papain thủy phân protein, đóng vai trò vừa là một endopeptidase vừa là một exopeptidase. Các endopeptidase thủy phân protein chủ yếu thành peptide. R R R R (-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n +(HOH) (-NH-CH-COOH-)i +(H2N-CH-CO-)k Trong đó: i + k = n Các exopeptidase thủy phân peptide chủ yếu thành acid amin R R R R (-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n +(HOH) n’H2N-CH-COOH +(H2N-CH-CO-)k’ Trong đó: n’ + k’ = n So với các protease có nguồn gốc từ động vật hoặc vi sinh vật khác, papain có khả năng thuỷ phân sâu hơn, vì vậy nó được dùng để thủy phân tiếp các liên kết peptide còn lại sau khi đã thủy phân bằng trypsin hay chymotrypsin. Khả năng thủy phân cơ chất của papain còn phụ thuộc vào trạng thái của cơ chất, tức là có biến tính hay không. Nếu cơ chất bị biến tính thì papain có khả năng thủy phân sâu hơn. (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)