Luận văn Bước đầu khảo sát quá trình phát sinh bệnh (pathogenesis) của virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) trên tôm sú (Penaeus mondon) sử dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn và phương pháp hóa mô miễn dịch (immunohistochemistry)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * * * PHẠM MINH NHỰT BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÖ (Penaeus monodon) BẰNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƢƠNG PHÁP HÓA MÔ MIỄN DỊCH LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÖ (Penaeus monodon) BẰNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƢƠNG PHÁP HÓA MÔ MIỄN DỊCH LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN VĂN HẢO PHẠM MINH NHỰT ThS. NGÔ XUÂN TUYẾN KHÓA: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY * * * * * STANDARD CHALLENGE TEST MODEL AND IMMUNOHISTOCHEMISTRY PRIMARILY INVESTIGATING PATHOGENESIS OF WHITE SPOT SYNDROME VIRUS IN BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) GRADUATION OF THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor: Student: PhD. NGUYEN VAN HAO PHAM MINH NHUT MSc. NGO XUAN TUYEN TERM: 2002 - 2006 HCMC, 8/2006 iv LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: BGH Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM và các thầy cô ở Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo mọi điều kiện để chúng em học tập tốt, đã tận tình giúp đỡ, quan tâm đến việc học tập của chúng em trong suốt 4 năm qua và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để chúng em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. TS. Nguyễn Văn Hảo, ThS. Ngô Xuân Tuyến, CN. Đoàn Văn Cƣờng đã tận tình chỉ bảo, giải đáp các vƣớng mắc, các khó khăn mà tôi gặp phải trong suốt quá trình thực tập, giúp tôi hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này. KS. Phạm Thị Tuyết Anh đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài. TS. Lý Thị Thanh Loan đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình thực tập tại Viện. Các anh chị ở phòng Mô học tại Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, Thành Phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài. Các anh chị ở phòng Sinh Học Thực Nghiệm và Trại thực nghiệm Thủy Sản Thủ Đức đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành quá trình bố trí thí nghiệm. Bạn Trần Thị Ánh Nguyệt và các bạn thân yêu ở lớp Công Nghệ Sinh Học 28 đã cùng tôi chia sẻ những cảm xúc vui buồn trong thời gian học tập và giúp đỡ, động viên tôi để tôi hoàn thành khóa luận này. Và con vô cùng biết ơn cha mẹ và những ngƣời thân trong gia đình đã luôn động viên, giúp đỡ con để con có thể hoàn thành khóa luận này. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006. Sinh viên thực hiện Phạm Minh Nhựt v TÓM TẮT PHẠM MINH NHỰT - Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8/2006. “BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƢƠNG PHÁP HÓA MÔ MIỄN DỊCH”. Giáo viên hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN VĂN HẢO ThS. NGÔ XUÂN TUYẾN Bệnh đốm trắng do virus đốm trắng (WSSV) gây ra là nguyên nhân gây chết hàng loạt đối với tôm sú nuôi lẫn tôm tự nhiên tại Việt Nam và trên thế giới. Các nghiên cứu về quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tôm hiện nay rất ít. Do đó việc hiểu rõ hơn về quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng sẽ giúp cho việc tạo ra những phƣơng thức kiểm soát bệnh. Kết hợp mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn và phƣơng pháp hóa mô miễn dịch trên tôm sú không mang các virus thông thƣờng nhằm xác định vị trí xâm nhập đầu tiên của virus đốm trắng, phân tích sự xâm nhiễm và tìm ra nguyên nhân gây chết trên tôm. Tiến trình thí nghiệm đƣợc thực hiện nhƣ sau: tôm không mang các virus thông thƣờng đƣợc gây nhiễm bằng cách tiêm vào phần cơ với liều thấp (101,5 SID50/ml) và liều cao (104,0 SID50/ml). Ở mỗi liều gây nhiễm, tiến hành thu mẫu theo từng thời điểm sau khi gây nhiễm. Sử dụng phƣơng pháp hóa mô miễn dịch để khảo sát các mẫu theo từng thời điểm nhằm khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tôm sú. Các kết quả thu đƣợc: Các biểu hiện lâm sàng của tôm thí nghiệm bị nhiễm bệnh: hoạt động bất thƣờng, bỏ ăn, đỏ thân, xuất hiện đốm trắng, hấp hối và chết, đƣợc phát hiện vào thời điểm 36 giờ ở liều thấp và 24 giờ ở liều cao. Vị trí xâm nhập đầu tiên của virus đốm trắng trên tôm sú ở liều thấp xảy ra vào thời điểm 12 giờ sau khi gây nhiễm với tỷ lệ tôm bị nhiễm đốm trắng tại thời điểm này là 33,3 % và cơ quan xâm nhiễm đầu tiên của chúng là các tế bào của tim với cƣờng độ nhiễm là (+) vi Ở liều cao, các cơ quan phát hiện dƣơng tính với virus đốm trắng vào thời điểm 12 giờ sau khi tiêm sau khi nhuộm bằng hóa mô miễn dịch. Tỷ lệ tôm bị nhiễm đốm trắng tại thời điểm này là 50 %. Và cơ quan xâm nhiễm đầu tiên của virus đốm trắng ở liều cao là các tế bào của tim, mô tạo máu, mang, tuyến anten và các tế bào của màng bao bên ngoài gan tụy với cƣờng độ nhiễm thấp (+). Ở thời điểm 36 giờ sau khi gây nhiễm và ở cả 2 liều gây nhiễm tất cả các cơ quan đều bị nhiễm virus đốm trắng. Cƣờng độ nhiễm virus đốm trắng trên các cơ quan khi gây nhiễm với liều cao và liều thấp có sự khác biệt trên các cơ quan lymphoid, mang, ruột trƣớc, tuyến anten, dạ dày, biểu mô dƣới vỏ và mô liên kết của màng bao gan tụy. vii MỤC LỤC TRANG TRANG TỰA LỜI CẢM TẠ ........................................................................................................... ..... iv TÓM TẮT ................................................................................................................. ...... v MỤC LỤC ................................................................................................................ .... vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... ...... x DANH SÁCH CÁC HÌNH ............................................................................................. xi DANH SÁCH CÁC BẢNG .......................................................................................... xii PHẦN I: GIỚI THIỆU .................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1 1.2. Mục đích .............................................................................................................. 2 1.3. Yêu cầu ................................................................................................................ 2 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 3 2.1. Đặc điểm sinh học của hệ miễn dịch tôm sú ................................................... 3 2.1.1. Miễn dịch không đặc hiệu của giáp xác ............................................................... 3 2.1.2. Các tế bào máu tham gia vào đáp ứng miễn dịch của giáp xác ............................ 3 2.1.3. Hệ thống hoạt hóa prophenoloxidase ................................................................... 3 2.1.4. Hệ thống đông máu .............................................................................................. 6 2.1.5. Các chất ức chế proteinase ................................................................................... 7 2.1.6. Hệ thống nhận diện không chuyên biệt ................................................................ 7 2.1.7. Các peptide kháng khuẩn ..................................................................................... 8 2.1.8. Peroxynectin ......................................................................................................... 9 2.2. Bệnh đốm trắng và virus gây bệnh đốm trắng ................................................ 9 2.2.1. Bệnh đốm trắng .................................................................................................... 9 2.2.1.1. Lịch sử và phân bố ........................................................................................ 10 2.2.1.2. Triệu chứng, bệnh tích .................................................................................. 11 2.2.2. Virus đốm trắng .................................................................................................. 11 2.2.2.1. Phân loại và tên gọi ....................................................................................... 11 2.2.2.2. Hình thái ........................................................................................................ 12 2.2.2.3. Cấu trúc ......................................................................................................... 13 2.3. Quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng ............................................. 15 viii 2.3.1. Vật liệu gây bệnh ................................................................................................ 15 2.3.2. Cơ chế gây bệnh ................................................................................................. 16 2.3.3. Cơ chế lây lan ..................................................................................................... 17 2.4. Mô hình cảm nhiễm chuẩn virus trên tôm ..................................................... 18 2.5. Phƣơng pháp hóa mô miễn dịch ..................................................................... 19 2.5.1. Nguyên lý .......................................................................................................... 19 2.5.2. Kháng nguyên ..................................................................................................... 20 2.5.3. Kháng thể ............................................................................................................ 20 2.5.4. Phƣơng pháp nhuộm ........................................................................................... 21 2.5.4.1. Phƣơng pháp trực tiếp ................................................................................... 21 2.5.4.2. Phƣơng pháp gián tiếp .................................................................................. 22 2.5.4.3. Phƣơng pháp PAP (peroxidase anti – peroxidase method) .......................... 23 2.5.4.4. Phƣơng pháp avidin – biotin complex (ABC method) ................................. 23 2.5.4.5. Phƣơng pháp đánh dấu Streptavidin Biotin (LASB) .................................... 24 PHẦN III: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP ............................................................... 25 3.1. Thời gian và địa điểm ........................................................................................... 25 3.1.1. Thời gian .............................................................................................................. 25 3.1.2. Địa điểm .............................................................................................................. 25 3.2. Vật liệu ................................................................................................................... 25 3.2.1. Vật liệu và dụng cụ sử dụng trong quá trình gây nhiễm thực nghiệm ................ 25 3.2.1.1. Vật liệu ............................................................................................................. 25 3.2.1.2. Dụng cụ............................................................................................................. 25 3.2.2. Các hóa chất và dụng cụ sử dụng trong IHC ....................................................... 26 3.2.2.1. Hóa chất ............................................................................................................ 26 3.2.2.2. Vật tƣ ................................................................................................................ 26 3.2.2.3. Thiết bị .............................................................................................................. 26 3.3. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................... 27 3.3.1. Tôm và điều kiện thí nghiệm .............................................................................. 27 3.3.2. Virus đốm trắng dòng Việt Nam (WSSV-VN) ................................................... 27 3.3.3. Gây nhiễm virus đốm trắng trên tôm sú .............................................................. 27 3.3.4. Thời gian theo dõi và thu mẫu để khảo sát quá trình phát sinh bệnh ................. 28 ix 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................... 28 3.4.1. Phƣơng pháp pha loãng dịch virus ...................................................................... 28 3.4.2. Phƣơng pháp thu mẫu tôm ................................................................................... 29 3.4.3. Phƣơng pháp nhuộm IHC .................................................................................... 30 3.4.4. Xử lý thống kê ..................................................................................................... 34 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 35 4.1. Độc lực của virus gốc dòng Việt Nam (WSSV-VN) ........................................... 35 4.1.1. Các dấu hiệu lâm sàng và tỷ lệ gây chết .............................................................. 35 4.1.2. Tỷ lệ nhiễm của tôm thí nghiệm theo từng thời điểm ......................................... 36 4.2. Khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng dòng Việt Nam trên tôm sú ............................................................................................................ 37 4.2.1. Quá trình phát sinh bệnh của WSSV-VN trên tôm sú ở liều gây nhiễm thấp (101,5 SID50/ml) ................................................................ 38 4.2.2. Quá trình phát sinh bệnh của WSSV-VN trên tôm sú ở liều cao (104,0 SID50/ml) .................................................................................. 42 4.2.3. So sánh giữa hai liều gây nhiễm về quá trình phát sinh bệnh ............................. 46 4.3. Thảo luận .............................................................................................................. 48 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 50 5.1. Kết luận ................................................................................................................. 50 5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 52 PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 57 x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT WSSV White Spot Syndrome Virus WSSV-VN White Spot Syndrome Virus – Việt Nam WSSV-TL White Spot Syndrome Virus – Thailand WSD White Spot Disease MBV Monodon Baculovirus YHV Yellow Head Virus proPO Prophenoloxidase PO Phenoloxidase AMPs Antimicrobial Peptides LPS Lipopolysaccharide PG Peptidoglycan PPAE Prophenoloxidase Activating Enzyme CP Clotting Protein TGase Transglutaminase PAMPS Pathogen-associated Molecular Patterns PRR (PRP) Pattern Recognition Receptor (protein) GBP Beta Glucan Binding Protein LPBP Lipopolysaccharide binding protein ICTV International Committee on Taxonomy for Virus SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SID Shrimp Infectious Dose LD Lethal Dose IHC Immunohistochemistry ctv cộng tác viên xi DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 2.1: Các dạng bạch cầu của giáp xác và chức năng của chúng ............................... 4 Bảng 3.1: Thời gian theo dõi và thu mẫu để khảo sát quá trình phát sinh bệnh ............ 27 Bảng 4.1: Tỷ lệ phần trăm (%) tôm biểu hiện các dấu hiệu lâm sàng ở các thời điểm sau khi gây nhiễm ................................................................................. 34 Bảng 4.2: Tỷ lệ nhiễm của tôm thí nghiệm ở liều cao và liều thấp theo từng thời điểm ........................................................................................................ 35 Bảng 4.3: Kết quả theo dõi tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan khảo sát ở liều thấp (%) ................................................................................. 37 Bảng 4.4: Kết quả theo dõi tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan khảo sát ở liều cao (%) .................................................................................. 41 Bảng 4.5: Tỷ lệ (%) các cơ quan bị nhiễm WSSV-VN theo từng thời điểm khảo sát ... 46 xii DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Tôm bị bệnh đốm trắng .................................................................................. 11 Hình 2.2: Hình thái của virus đốm trắng quan sát dƣới kính hiển vi điện tử ................. 12 Hình 2.3: Thành phần các protein của virus đốm trắng ................................................. 13 Hình 2.4: Genome của virus đốm trắng.......................................................................... 14 Hình 2.5: Kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng .................................................... 20 Hình 2.6: Các phƣơng pháp nhuộm IHC ........................................................................ 21 Hình 3.1: Hệ thống bể thí nghiệm .................................................................................. 26 Hình 3.2: Gây nhiễm virus trên tôm thí nghiệm ............................................................ 27 Hình 3.3: Tiêm dung dịch Davidson vào đầu tôm ......................................................... 28 Hình 3.4: Các giai đoạn thực hiện IHC .......................................................................... 29 Hình 3.5: Các giai đoạn xử lý mẫu ................................................................................. 30 Hình 3.6: Các bƣớc thực hiện IHC ................................................................................. 31 Hình 4.1: Tôm bị nhiễm virus đốm trắng ....................................................................... 35 Hình 4.2: Tỷ lệ nhiễm của tôm thí nghiệm ở liều cao và liều thấp theo từng thời điểm................................................................................................. 36 Hình 4.3: Các cơ quan khảo sát quá trình phát sinh bệnh của WSSV-VN .................... 37 Hình 4.4: Đồ thị biểu diễn tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan ở liều thấp. ...................................................................................................... 38 Hình 4.5: Các tế bào của các cơ quan bị nhiễm WSSV ở tôm thí nghiệm liều thấp ...... 40 Hình 4.6: Đồ thị biểu diễn tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan ở liều cao ........................................................................................................ 42 Hình 4.7: Các cơ quan bị nhiễm WSSV ở liều cao sau khi nhuộm IHC ........................ 43 Hình 4.8: Đồ thị so sánh tỷ lệ nhiễm trên các cơ quan khảo sát ở liều cao và liều thấp ..................................................................................................... 45 1 PHẦN I: GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Bệnh đốm trắng (White Spot Disease) do virus gây hội chứng đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) gây ra trên tôm sú nuôi. Đây là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho nhóm tôm he, bệnh có sức tàn phá rất lớn, làm tôm chết trong