Luận văn Bước đầu xây dựng quy trình định lượng các sản phẩm biến đổi gen bằng phương pháp real-Time pcr

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HỮU TRƢỞNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 – 2005 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN NGUYỄN HỮU TRƢỞNG Th.S NGUYỄN THÁI THỦY Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 – 2005 iii LỜI CẢM TẠ Em xin chân thành cảm ơn: Ban Giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường. Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hướng dẫn, nhận xét và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này. Em xin cảm ơn thầy Nguyễn Thái Thủy đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ em rất nhiều, cũng như đã cho em những lời khuyên quý giá để hoàn thành khóa luận. Em xin gửi đến thầy lời biết ơn chân thành nhất. Thầy Phương, chị Kim Anh, anh Luân (công ty Bio-Rad) đã giúp đỡ em thực hành và nắm vững phương pháp Real-Time PCR. Em xin gởi lời cám ơn đến thầy Bùi Văn Lệ, anh Vũ, chị Liên, anh Nam cùng với các anh chị và các bạn đang làm việc tại phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử (Lab B), trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh đã nhiệt tình hướng dẫn và dành cho em những tình cảm quý giá trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này. Con xin gửi lòng tri ân đến Ba, Mẹ, em Thành và những người thân trong gia đình đã luôn ủng hộ, nâng đỡ và dành cho con tình thương sâu sắc nhất. Xin cảm ơn tất cả bạn bè thân yêu lớp Công nghệ Sinh học K27 đã cùng tôi chia sẻ biết bao buồn vui cũng như đã hết lòng giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong suốt những năm tháng dưới mái trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. Xin chân thành cảm ơn bạn Khánh Đan đã luôn động viên, giúp đỡ và dành cho tôi những tình cảm tốt đẹp nhất. Xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người Sinh viên Nguyễn Hữu Trưởng iv TÓM TẮT Nguyễn Hữu Trƣởng, Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR. Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Đình Đôn và Th.S Nguyễn Thái Thủy. Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005 tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử (lab B), Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Mục tiêu đề tài: Xây dựng quy trình định lượng bắp biến đổi gen dựa trên promoter 35S bằng phương pháp Real-Time PCR. Đánh giá khả năng định lượng và hiệu quả của phương pháp. Định lượng một số mẫu bắp và thực phẩm có chứa bắp trên thị trường Tp Hồ Chí Minh và phụ cận. Đề tài đã có những kết quả sau: Quy trình định lượng sản phẩm biến đổi gen: - Bước 1: Ly trích DNA mẫu bắp và thực phẩm có chứa bắp. Quy trình đề nghị: dung dịch phá màng tế bào: CTAB 2%; dung dịch biến tính protein: phenol/chloroform; dung dịch tủa DNA: isopropanol. - Bước 2: Sàng lọc bắp biến đổi gen dựa trên promoter 35S. Phương pháp đề nghị: Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I. Kết quả thí nghiệm sàng lọc: sản phẩm có promoter 35S cho vạch khuếch đại có kích thước 123 bp với nhiệt độ nóng chảy 86-86,5oC. - Bước 3: Định lượng mẫu bắp biến đổi gen có kết quả sàng lọc dương tính, dựa trên promoter 35S. Phương pháp đề nghị: Real-Time PCR với mẫu dò Taqman. Kết quả đánh giá: phương pháp Real-Time PCR có khả năng phát hiện và định lượng 1 copy gen đích trong mẫu thí nghiệm, định lượng chính xác một mẫu có tỷ lệ phần trăm chuyển gen biết trước. - Khảo sát một số mẫu sản phẩm cho thấy, trên thị trường Việt Nam có sản phẩm chuyển gen ở các dạng thực phẩm và thức ăn khác nhau. v SUMMARY NGUYEN HUU TRUONG, Nong Lam University, Ho Chi Minh City, VietNam. Aug 2005. ESTABLISHING A PROCESS OF GMOs (Genetically Modified Organisms) QUANTIFICATION BY REAL-TIME PCR METHOD Instructors: Le Dinh Don and Nguyen Thai Thuy. Recently, GMO is a controversial problem in the world. Because its advantages and disadvantages cannot be considered correctly, control methods are needed to limit its affects to environment and human health. For this purpose, methods for GMOs detection and quantification in order to determine the percentage ratio of GMO presentation in food and feed need to be developed. So, in this thesis, a process for GMO quantification will be researched and established by Real-Time PCR method, one of the most exactly methods for GMO quantification now. Purpose: Establishing a process of GM maize quantification based on CaMV 35S promoter by Real-Time PCR method. Evaluating quantification ability and efficiency of method. Applying it for quantification some of food and feed derived from maize in Ho Chi Minh City. Results: A process of GM maize quantification by Real-Time PCR method: - Step 1: DNA extraction: Cell wall destruction solution: CTAB 2%. Protein denaturalization solution: phenol/chloroform. DNA precipitation solution: Isopropanol - Step 2: GM maize screening based on 35S promoter. Method: Real-Time PCR with SYBR Green I dye. Results: Detection GM maize with p35S PCR amplifiers (123 bp and Tm 86- 86,5 o C). - Step 3: GM maize quantification based on 35S promoter. Method: Real-Time PCR with hybridization probe Taqman. Quantification ability: Detection and quantification 1 copy of p35S in a experiment template, exactly quantification a template which percentage ratio of GMO presentation has known. - Detection and quantification some food and feed in Ho Chi Minh City has GMO in its ingredients. Conclusion: A GM maize quantification process by Real-Time PCR has been established and can be applied to many other species. vi MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................ iii TÓM TẮT .................................................................................................................. iv MỤC LỤC ................................................................................................................. vi CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................................................... xi DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. xii DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. xiv PHẦN I: MỞ ĐẦU .................................................................................................... 1 1.Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1 2.Mục đích và yêu cầu .............................................................................................. 2 2.1.Mục đích ...............................................................................................................2 2.2.Yêu cầu .................................................................................................................2 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 3 1. Định nghĩa sinh vật biến đổi gen (GMO-genetically modified organism) ......... 3 2. Quá trình tạo sinh vật GMO .................................................................................. 3 2.1.Quá trình cơ bản ...................................................................................................3 2.2.Promoter CaMV 35S ............................................................................................4 3.Ứng dụng và lợi ích của thực vật chuyển gen ......................................................... 6 3.1.Ứng dụng ..............................................................................................................6 3.1.1. Thực vật sử dụng làm thực phẩm [17] ...................................................... 6 3.1.2. Thực vật không sử dụng làm thực phẩm [17]........................................... 7 3.2.Tác động có lợi của thực vật chuyển gen .............................................................8 4.Tình hình cây trồng chuyển gen trên thế giới ......................................................... 9 4.1.Tình hình bắp chuyển gen trên thế giới ................................................................11 5.Ảnh hƣởng bất lợi và dƣ luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen .................. 12 5.1.Các rủi ro có thể gặp [34] .....................................................................................12 5.2.Tác động có hại ....................................................................................................12 5.2.1. Môi trường .............................................................................................. 13 5.2.2. Sức khoẻ người tiêu dùng ....................................................................... 13 5.2.3. Các nghiên cứu và dẫn chứng cụ thể ...................................................... 14 vii 5.3.Dư luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen .....................................................14 6. .. Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen trên thế giới .......................................... 16 6.1.Quy định tại châu Âu [33]: ...................................................................................17 6.1.1. Nguyên tắc định lượng dựa trên DNA ................................................... 18 6.1.2. Quy trình xét nghiệm sản phẩm biến đổi gen tại châu Âu ..................... 19 6.1.2.1. Quá trình sàng lọc sản phẩm biến đổi gen ..................................... 19 6.1.2.2. Quá trình định lượng sản phẩm biến đổi gen ................................. 19 7. .. Tình hình Việt Nam ............................................................................................... 21 7.1.Nghiên cứu và phát triển sinh vật biến đổi gen ....................................................21 7.2.Vấn đề thương mại hóa và kiểm soát sinh vật biến đổi gen .................................21 8. .. Các phƣơng pháp định lƣợng sản phẩm chuyển gen ......................................... 22 8.1.Phương pháp ELISA ............................................................................................23 8.2.Quantitative competitive PCR (QC-PCR) [42] ....................................................23 8.3.Nguyên tắc kĩ thuật Real-time PCR .....................................................................24 8.3.1. Hóa chất định lượng ............................................................................... 24 8.3.1.1. SYBR Green I ................................................................................ 25 8.3.1.2. Mẫu dò phân hủy (Taqman probe) ................................................. 25 8.3.2. Công cụ phát hiện ................................................................................... 27 8.4.Nguyên tắc định lượng bằng kĩ thuật Real-time PCR ..........................................28 8.4.1. Quan hệ định lượng ................................................................................ 28 8.4.2. Thiết kế thí nghiệm ................................................................................. 29 8.4.3. Phân tích dữ liệu Real-time PCR ............................................................ 30 8.4.4. Tính toán hàm lượng GMO .................................................................... 31 8.5.Mức độ chuyên biệt trong phát hiện và định lượng cây trồng biến đổi gen [9][44]32 8.6.Một số công trình nghiên cứu về phát hiện và định lượng GMO dựa trên promoter 35S. .............................................................................................................34 8.6.1. Phát hiện và sàng lọc GMO dựa trên promoter 35S. .............................. 34 8.6.2. Định lượng GMO đựa trên promoter 35S .............................................. 35 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ................................ 36 1.Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 36 2.Điều kiện tiến hành thí nghiệm ............................................................................... 36 viii 2.1.Địa điểm thực hiện thí nghiệm .............................................................................36 2.2.Thời gian thực hiện ...............................................................................................36 3.Tiến trình thí nghiệm: ............................................................................................. 36 4.Vật liệu thí nghiệm ................................................................................................... 37 5.Thí nghiệm 1: Khảo sát các quy trình ly trích DNA ............................................ 38 5.1.Mục tiêu ................................................................................................................38 5.2.Vật liệu .................................................................................................................38 5.3.Phương pháp thực hiện .........................................................................................38 5.4.Phương pháp phân tích sản phẩm DNA ly trích...................................................41 6.Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen ..................................................... 41 6.1.Mục tiêu ................................................................................................................41 6.2.Nguyên tắc ............................................................................................................41 6.3.Vật liệu thí nghiệm ...............................................................................................42 6.4.Trang thiết bị ........................................................................................................42 6.5.Phương pháp thực hiện .........................................................................................43 6.5.1. Thành phần phản ứng PCR và Real-Time PCR ..................................... 43 6.5.2. Chương trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại ........................................ 43 6.5.3. Phát hiện sản phẩm khuếch đại............................................................... 44 6.5.4. Phân tích kết quả ..................................................................................... 45 7.Thí nghiệm 3: Xác định phƣơng pháp định lƣợng sản phẩm biến đổi gen ........ 46 7.1.Mục tiêu ................................................................................................................46 7.2.Nguyên tắc ............................................................................................................46 7.3.Vật liệu thí nghiệm ...............................................................................................46 7.4.Trang thiết bị ........................................................................................................46 7.5.Phương pháp thực hiện .........................................................................................46 7.5.1. Bố trí thí nghiệm ..................................................................................... 46 7.5.1.1. Xây dựng đường chuẩn định lượng p35S ...................................... 47 7.5.1.2. Đánh giá kết quả định lượng .......................................................... 48 7.5.2. Thành phần phản ứng PCR ..................................................................... 48 7.5.2.1. Đặc điểm 35S master mix .............................................................. 49 7.5.2.2. Đặc điểm SYBR Green I Supermix ............................................... 49 7.5.3. Chương trình nhiệt thiết lập trên máy Real-Time PCR .......................... 49 ix 7.5.4. Cài đặt phần mềm điều khiển ................................................................. 50 7.5.5. Phân tích kết quả thí nghiệm .................................................................. 51 8.Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng định lƣợng của phƣơng pháp Real-Time PCR. ..... 54 8.1.Mục tiêu ................................................................................................................54 8.2.Nguyên tắc ............................................................................................................54 8.3.Vật liệu thí nghiệm ...............................................................................................54 8.4.Trang thiết bị ........................................................................................................54 8.5.Hóa chất ................................................................................................................54 8.5.1. Đặc điểm 35S và corn-reference master mix ......................................... 55 8.5.2. Đặc điểm chuẩn 35S và gen tham chiếu (35S và corn reference calibration DNA standards) ............................................................................... 55 8.6.Phương pháp thực hiện .........................................................................................55 8.6.1. Bố trí thí nghiệm ..................................................................................... 56 8.6.1.1. Độ nhạy phản ứng .......................................................................... 56 8.6.1.2. Độ chính xác:.................................................................................. 56 8.6.2. Thiết kế phản ứng định lượng ................................................................ 56 8.6.3. Thành phần phản ứng Real-Time PCR ................................................... 57 8.6.4. Chương trình nhiệt thiết lập trên máy Real-Time PCR .......................... 57 8.6.5. Phân tích kết quả ..................................................................................... 58 9.Ứng dụng phƣơng pháp Real-Time PCR khảo sát một số mẫu trên thị trƣờng 58 9.1.Mục tiêu ................................................................................................................58 9.2.Nguyên tắc ............................................................................................................58 9.3.Vật liệu thí nghiệm ...............................................................................................58 9.4.Trang thiết bị và hóa chất .....................................................................................58 9.5.Phương pháp thực hiện .........................................................................................59 9.5.1. Bố trí thí nghiệm ..................................................................................... 59 9.5.2. Thiết kế phản ứng định lượng ................................................................ 59 9.5.3. Thành phần phản ứng và chương trình nhiệt thiết lập ............................ 59 9.5.4. Phân tích kết quả ..................................................................................... 59 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 60 x 1.Khảo sát các quy trình ly trích DNA ..................................................................... 60 2.Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen ..................................................... 63 2.1.Phương pháp 1: PCR truyền thống .......................................................................63 2.2.Phương pháp 2: