Luận văn Bước đầu xây dựng quy trình nhuộm nhiễm sắc thể trên tế bào máu thỏ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHUỘM NHIỄM SẮC THỂ TRÊN TẾ BÀO MÁU THỎ Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: MAI MINH MẪN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHUỘM NHIỄM SẮC THỂ TRÊN TẾ BÀO MÁU THỎ Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện THS. HỒ THỊ NGA MAI MINH MẪN BSTY. NGUYỄN KIÊN CƢỜNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 iii LỜI CẢM TẠ Con xin gửi đến Ba Má lòng thành kính ghi ơn. Con kính chúc Ba Má sức khỏe, con sẽ luôn phấn đấu để trở thành ngƣời có ích cho xã hội để không phụ công dƣỡng dục của Ba Má. Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: * Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả các quý thầy cô đã tận tụy truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. * ThS. Hồ Thị Nga, BSTY. Nguyễn Kiên Cƣờng, đã trực tiếp hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. * PGS.TS. Trần Thị Dân, KS. Nguyễn Văn Út đã giúp đỡ cũng nhƣ động viên lúc tôi gặp khó khăn. * TS. Dƣơng Nguyên Khang cùng các thầy cô Khoa Chăn Nuôi Thú Y đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành tốt đề tài. * Thầy Đinh Xuân Phát, Cô Quách Tuyết Anh đã dành thời gian quý báu để cung cấp cho tôi những tài liệu, kinh nghiệm quý báu. * Cùng toàn thể lớp CNSH29 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Sinh viên thực hiện MAI MINH MẪN iv TÓM TẮT MAI MINH MẪN, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHUỘM NHIỄM SẮC THỂ TRÊN TẾ BÀO MÁU THỎ” Giáo viên hƣớng dẫn: ThS. Hồ Thị Nga BSTY. Nguyễn Kiên Cƣờng Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh lý Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh trên đối tƣợng thỏ. Nhiễm sắc thể là yếu tố ảnh hƣởng đến sự di truyền của một giống loài. Xây dựng đƣợc kiểu nhân của một loài là bƣớc đầu cho việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế di truyền của loài đó. Phƣơng pháp hiệu quả nhất trong nghiên cứu kiểu nhân là nuôi cấy tế bào bạch cầu của máu và nhuộm. Máu thỏ nuôi cấy với hai liều lƣợng là 0,4 ml và 1 ml trong môi trƣờng RPMI 1640 có bổ sung một số chất giúp cho sự sinh trƣởng và phát triển tế bào nhƣ huyết thanh phôi bò (FBS), Pokeweed (lectin), kháng sinh antimycotic – antibiotic. Mẫu máu đƣợc nuôi cấy chủ yếu bằng chai Rough trong 72 giờ ở 37 0C trong tủ ấm CO2. Sau 72 giờ, cho thêm 40 µl colcemid vào môi trƣờng và ủ theo ba mức thời gian 20 phút, 40 phút và 60 phút trƣớc khi xử lý để nhuộm. Bên cạnh đó ống nghiệm 15 ml cũng đƣợc sử dụng để nuôi cấy thử nghiệm. Kết quả cho thấy khi nuôi cấy 1ml máu thỏ với môi trƣờng RPMI 1640 trong 72 giờ ở 37 0C và ủ với colcemid trong thời gian 60 phút thì thu đƣợc tế bào ở giai đoạn trung kỳ nhiều nhất. Ngoài ra, khi nuôi cấy máu thỏ với ống nghiệm 15 ml vẫn thu đƣợc các tế bào ở giai đoạn trung kỳ. Mặc dù vậy, chúng tôi vẫn chƣa xây dựng đƣợc kiểu nhân (karyotype) của bộ nhiễm sắc thể thỏ do nhiễm sắc thể chƣa trãi đều khi nhuộm. v SUMMARY MAI MINH MAN, Nong Lam University, August 2007. “THE INITIAL STEP OF SETTING UP STAINING RABBIT PERIPHERAL BLOOD CHROMOSOME PROCESS” Supervisors HO THI NGA, MSc NGUYEN KIEN CUONG, DMV A study was carried out on rabbit chromosome at physiology laboratory of Faculty of Animal Science and Veterinary Medicine, Nong Lam University Ho Chi Minh City. Chromosome is an element which affects the species genetics. Setting up karyotype of species is the initial step of researching extendedly into species’ genetic mechanism. The most effective researching karyotype method is that culturing and staining lymphocyte. Rabbit peripheral blood (anticoagulated by heparin) was cultured with two dosages, 0,4 ml and 1 ml. It was cultured in RPMI 1640 medium which supplements some mitogenic agents: fetal bovine serum (FBS), pokeweed (lectin), antimycotic – antibiotic. Blood cell was cultured primarily in Rough vase for 72 hours at 37 0 C. In addition, 15 ml falcon tubes were also used to culture. After 72 hours, we added colcemid to medium and incubate in 20 min, 40 min and 60 min before the cell was fixed. The best result was that culturing 1 ml rabbit peripheral blood and incubating with colcemid in 60 min. Besides, the cells also grew and divided when they were cultured in 15 ml falcon tubes. So that, we could replace Rough vase with 15 ml falcon tubes in culturing blood leukocytes. However, we haven’t established rabbit karyotype yet because chromosome didn’t spread on slides. vi MỤC LỤC Trang Lời cảm tạ ...................................................................................................... iii Tóm tắt ............................................................................................................ iv Summary .......................................................................................................... v Mục lục ............................................................................................................ vi Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................. ix Danh sách các bảng ......................................................................................... x Danh sách các hình ........................................................................................ xi Chƣơng 1 MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu và yêu cầu ..................................................................................... 2 1.2.1 Mục tiêu ................................................................................................. 2 1.2.2 Yêu cầu ................................................................................................... 2 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3 2.1 Tổng quan về thỏ .......................................................................................... 3 2.1.1 Phân loài ................................................................................................. 3 2.1.2 Một số đặc điểm sinh lý ......................................................................... 3 2.1.3 Đặc điểm của máu thỏ ............................................................................ 3 2.2 Nhiễm sắc thể ............................................................................................... 4 2.2.1 Khái niệm ............................................................................................... 4 2.2.2 Hình thái và kích thƣớc .......................................................................... 4 2.2.3 Số lƣợng nhiễm sắc thể .......................................................................... 5 2.2.4 Cấu trúc nhiễm sắc thể ........................................................................... 6 2.2.4.1 Cấu trúc hiển vi của nhiễm sắc thể ......... ………………………….6 2.2.4.2 Cấu trúc siêu vi của nhiễm sắc thể ................................................... 8 2.3 Chu Kỳ sống của tế bào ............................................................................... 9 2.3.1 Gian kỳ ................................................................................................... 9 vii 2.3.1.1 Pha G1 ............................................................................................ 10 2.3.1.2 Pha S ............................................................................................... 10 2.3.1.3 Pha G2 ............................................................................................ 10 2.3.1.4 Phân bào ......................................................................................... 10 2.3.2 Nguyên phân ........................................................................................ 11 2.3.2.1 Đặc điểm của nguyên phân ............................................................ 11 2.3.2.2 Các kỳ của phân bào ...................................................................... 12 2.4 Sơ lƣợc các kỹ thuật nghiên cứu nhiễm sắc thể ........................................ 14 2.4.1 Kỹ thuật splash ..................................................................................... 14 2.4.2 Kỹ thuật squash .................................................................................... 16 2.5 Nghiên cứu về kiểu nhân nhiễm sắc thể thỏ .............................................. 16 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ........................... 20 3.1 Thời gian và địa điểm................................................................................. 20 3.2 Đối tƣợng ................................................................................................... 20 3.3 Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 20 3.4 Vật liệu và hóa chất .................................................................................... 20 3.4.1 Thiết bị ................................................................................................. 20 3.4.2 Dụng cụ ................................................................................................ 21 3.4.3 Hóa chất ............................................................................................... 21 3.5 Bố trí thí nghiệm ........................................................................................ 23 3.5.1 Thí nghiệm 1 ........................................................................................ 23 3.5.2 Thí nghiệm 2 ........................................................................................ 23 3.5.3 Thí nghiệm 3 ........................................................................................ 24 3.5.4 Chỉ tiêu quan sát ................................................................................... 24 3.6 Phƣơng pháp tiến hành ............................................................................... 24 3.6.1 Phƣơng pháp lấy máu thỏ..................................................................... 24 3.6.1.1 Phƣơng pháp lấy máu tim .............................................................. 24 3.6.1.2 Phƣơng pháp lấy máu động mạch tai ............................................. 24 3.6.2 Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào máu .......................................................... 25 viii 3.6.3 Kỹ thuật nhuộm nhiễm sắc thể ................................................................ 26 3.6.3.1 Kỹ thuật trãi đều nhiễm sắc thể ...................................................... 26 3.6.3.1 Nhuộm nhiễm sắc thể với giemsa .................................................. 27 3.7 Xử lý số liệu ............................................................................................... 27 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 28 4.1 Kết quả nhuộm theo thời gian ủ với colcemid ........................................... 28 4.2 Kết quả nhuộm theo lƣợng máu nuôi cấy .................................................. 29 4.3 Kết quả nuôi cấy thử nghiệm trên ống ly tâm 15ml ................................... 31 4.4 Một số nguyên nhân ảnh hƣởng tới kết nuôi cấy và nhuộm ...................... 35 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................... 38 5.1 Kết luận ...................................................................................................... 38 5.2 Đề nghị ....................................................................................................... 38 CHƢƠNG 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................ 39 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribonucleotide ARN Acid ribonucleotide Ctv Cộng tác viên IU International unit FBS Fetal bovine serum NST Nhiễm sắc thể PHA Phytohemaglutinin PBS Phosphate buffer saline x DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Số lƣợng nhiễm sắc thể của một số loài ................................................ 5 Bảng 1.2 Đặc điểm các băng trên nhiễm sắc thể thể........................................... 17 Bảng 3.1 Môi trƣờng nuôi cấy 0,4 và 1 ml máu ................................................ 22 Bảng 4.1 Kết quả nhuộm theo thời gian ủ với colcemid..................................... 28 Bảng 4.2 Kết quả nhuộm theo lƣợng máu nuôi cấy ............................................ 30 Bảng 4.3 Kết quả nuôi cấy trên chai Rough và ống nghiệm 15 ml .................... 32 xi DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Nhiễm sắc thể ......................................................................................... 4 Hình 2.2 Cấu trúc nhiễm sắc thể ........................................................................... 6 Hình 2.3 Các kiểu hình nhiễm sắc thể ................................................................... 7 Hình 2.4 Cấu trúc siêu vi và phân tử của nhiễm sắc thể ........................................ 8 Hình 2.5 Chu kỳ phân chia tế bào .......................................................................... 9 Hình 2.6 Quá trình nguyên phân giảm nhiễm ...................................................... 13 Hình 2.7 Kiểu nhân tế bào thỏ đực ...................................................................... 19 Hình 3.1 Phƣơng pháp lấy máu động mạch tai .................................................... 25 Hình 3.2 Nuôi cấy tế bào bạch cầu ...................................................................... 26 Hình 4.1 Nhiễm sắc thể nhuộm với giemsa ......................................................... 33 Hình 4.2 Hình dạng nhiễm sắc thể thỏ ................................................................. 33 Hình 4.3 Chu kỳ phân chia của tế bào bạch cầu .................................................. 34 Hình 4.4 Nhân tế bào bạch cầu thỏ chƣa vỡ ........................................................ 36 Hình 4.5 Nhiễm sắc thể không trải đều trên phiến kính ...................................... 37 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Tế bào là đơn vị tổ chức cơ bản của cơ thể sống. Trong tế bào có chứa các bào quan và nhân. Nhân tế bào là cấu thành bắt buộc của tế bào eukaryote, vì trong nhân có chứa nhiễm sắc thể (NST), là cấu trúc mang vật chất di truyền ADN (acid deoxyribonucleotide) của tế bào và cơ thể. Nhiễm sắc thể đƣợc quan sát đầu tiên bởi Nageli năm 1842, nhƣng đến năm 1888, NST mới đƣợc Waldeyer đặt tên là “chromosome” (“chromo” có nghĩa bắt màu nhuộm và “some” nghĩa là một thể) (Eldridge, 1985). Nhiễm sắc thể đóng vai trò rất quan trọng trong di truyền của các loài, một yếu tố quyết định cho sự tiến hóa hay suy thoái của giống nòi. Có thể nói hơn 100 năm qua, chƣa có một cấu trúc sinh học nào nhƣ NST đã đƣợc nhiều phòng thí nghiệm, nhiều nhà nghiên cứu, nhiều phƣơng tiện kỹ thuật và kinh phí để nghiên cứu. Mục đích cuối cùng là làm sáng tỏ cấu trúc phân tử, siêu vi thể cũng nhƣ cơ chế hoạt động của chúng trong tế bào. Một trong những kỹ thuật nghiên cứu NST rất cổ điển nhƣng rất hiệu quả đó là phƣơng pháp nhuộm. Với phƣơng pháp nhuộm, chúng ta có thể nghiên cứu đƣợc kiểu nhân (karyotype) của một loài nào đó. Mà việc sử dụng bảng đồ kiểu nhân có tầm quan trọng trong nghiên cứu di truyền tế bào, trong y học lâm sàng chẩn đoán bệnh di truyền, bệnh ung thƣ, trong phân loại học cũng nhƣ trong công tác chọn giống cây trồng và vật nuôi. Do đó tìm ra một quy trình nhuộm NST tối ƣu để nghiên cứu kiểu nhân trong tế bào là điều rất cần thiết. Xuất phát từ nhu cầu thực tế, đƣợc sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm cùng với sự giúp đỡ của Khoa Chăn Nuôi Thú Y, chúng tôi thực hiện đề tài “Bƣớc đầu xây dựng quy trình nhuộm nhiễm sắc thể trên tế bào máu thỏ”, để tạo cơ sở cho việc xây dựng kiểu nhân hoàn chỉnh của thỏ, góp phần ứng dụng cho những nghiên cứu sau này. 2 1.2 Mục tiêu và yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu Xây dựng quy trình nhuộm nhiễm sắc thể tế bào bạch cầu trong máu thỏ. 1.2.2 Yêu cầu - Thu nhận và nuôi cấy tế bào bạch cầu thỏ đạt giai đoạn trung kỳ. - Thử nghiệm quy trình nhuộm ở các mức thời gian ủ khác nhau. - Thử nghiệm quy trình nhuộm với lƣợng máu nuôi cấy khác nhau. - Thử nghiệm nuôi cấy tế bào máu thỏ trên ống nghiệm 15 ml. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về thỏ Thỏ có nguồn gốc từ thỏ rừng, đã đƣợc con ngƣời thuần hoá hơn 1000 năm trƣớc công nguyên và trở thành thỏ nhà với tên khoa học là Oryctolagus Cesnoaclus Domesticies. 2.1.1 Phân loài ־ Bộ gặm nhấm: Rodentia ־ Lớp: Lagomorpha ־ Loài: Orgctolagus ־ Họ thỏ: Leporides 2.1.2 Một số đặc điểm sinh lý ־ Thân nhiệt: 39,50C (biến động từ 30 – 410C) ־ Nhịp tim: 120 - 160 lần/phút ־ Tần số hô hấp: 60 - 90 lần/phút ־ Nhiệt độ môi trƣờng thích hợp khoảng: 20 – 250C 2.1.3 Đặc điểm của máu thỏ Lƣợng máu của thỏ chiếm khoảng 5,5% so với trọng lƣợng cơ thể. Thành phần máu gồm huyết tƣơng và tế bào máu. Huyết tƣơng chiếm 60% thể tích, gồm huyết thanh và chất sinh sợi huyết. Huyết tƣơng có vai trò vận chuyển chất hữu cơ và vô cơ trong cơ thể (Dƣơng Nguyên Khang, 2006). Máu có ba loại tế bào là hồng cầu, tiểu cầu và bạch cầu. Số lƣợng hồng cầu khoảng từ 6 – 6,5 triệu trong 1 mm3 máu, chiếm hơn 90% tế bào máu. Hồng cầu có vai trò vận chuyển O2 và CO2, điều hòa pH. Số lƣợng tiểu cầu khoảng 300.000 trong 1 mm3 máu. Tiểu cầu khi vỡ sẽ sinh ra enzyme thrombokinase có tác dụng làm đông máu. Khi nuôi cấy tế bào máu, ngƣời ta dùng heparin để kháng lại cơ chế đông máu. Heparin có trong đại thực bào của gan, phổi và bạch cầu ƣa base, chúng không gây độc đối với tế bào. 4 Bạch cầu giữ nhiệm vụ bảo vệ cơ thể, số lƣợng bạch cầu ở thỏ khoảng 7.600 trong 1mm 3 máu (Trịnh Văn Thịnh, 1978). Bạch cầu gồm hai nhóm: bạch cầu có hạt và bạch cầu không hạt. Bạch cầu có hạt gồm: trung tính, acid và base. Bạch cầu không hạt gồm: đơn nhân lớn và lympho. Trong đó, bạch cầu lympho có khả năng phân chia nhanh và nhiều nhất trong nuôi cấy in vitro (Eldridge, 1985). 2.2 Nhiễm sắc thể 2.2.1 Khái niệm Nhiễm sắc thể (NST) là những cấu trúc hiển vi trong nhân tế bào, cấu tạo chủ yếu từ DNA và protein histon, có khả năng tự nhân đôi và biến đổi hình thái cấu trúc theo qui luật trong các quá trình phân bào. Nhiễm sắc thể tồn tại trong nhân tế bào soma thành từng cặp đồng dạng, trong đó một NST có nguồn gốc từ bố và một có nguồn gốc từ mẹ. Trong các tế bào bình thƣờng mỗi NST gồm 2 nhiễm sắc tử (chromatid), còn trong các giao tử NST đơn bội ở dạng một nhiễm sắc tử. Mỗi loài bình thƣờng có bộ NST lƣỡng bội (2n) đặc trƣng về số lƣợng, hình thái, cấu trúc và ổn định tƣơng đối qua các thế hệ. Kiểu nhân (karyotype) là thuật ngữ dùng chỉ số lƣợng và hình dạng của các NST chuyên biệt cho mỗi loài. Hình 2.1 Nhiễm sắc thể (Nguồn 2.2.2 Hình thái và kích thƣớc Nhiễm sắc thể quan sát ở trung kỳ thƣờng có hình dạng chấm hoặc hình que, thƣờng có kích thƣớc đƣờng kính khoảng 0,2 µm đến 3 µm và chiều dài chiều dài khoảng 0,2 µm đến 50 µm. Về kích thƣớc ở các tế bào khác nhau thì không giống nhau, nhƣng chúng đặc trƣng cho các tế bào và cá thể của cùng một loài. 5 Tuy nhiên, các mô khác nhau của cùng một cơ thể có sự biến đ