Luận văn Đánh giá tình trạng nhiễm tomato spotted wilt virus trên cà chua tại tỉnh Tiền Giang bằng kỹ thuật elisa và xây dựng quy trình chẩn đoán tomato spotted wilt virus bằng kỹ thuật rt – pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÀ CHUA TẠI TỈNH TIỀN GIANG BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN TOMATO SPOTTED WILT VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT – PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HỒNG PHƢỚC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÀ CHUA TẠI TỈNH TIỀN GIANG BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN TOMATO SPOTTED WILT VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT – PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN NGUYỄN HỒNG PHƢỚC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY EVALUATION ON THE STATUS QUO OF TOMATO SPOTTED WILT VIRUS AFFECTING TOMATO PLANT IN TIEN GIANG PROVINCE BY ELISA AND FORMULATING THE RT – PCR PROCESS TO DIAGNOSE TOMATO SPOTTED WILT VIRUS Graduation thesis Major: Biotechnology Professor: Student: BUI CACH TUYEN NGUYEN HONG PHUOC Term: 2003 – 2007 HCMC, 9/2007 iv LỜI CẢM TẠ  Em xin chân thành cảm tạ: PGS.TS. Bùi Cách Tuyến đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu giúp em hoàn thành khóa luận. Ban Giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh, Ban Chủ nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận này. Ban Giám đốc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh và toàn thể Anh Chị đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp em hoàn thành tốt khóa luận. TS. Lê Đình Đôn cùng quý Thầy – Cô trong và ngoài trƣờng đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và làm khóa luận.  Em xin cám ơn chị Dƣơng, chị Hƣng, chị Hạnh, anh Lẫm, anh Trƣờng, anh Vũ đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.  Cảm ơn tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học K29 niên khóa 2003 – 2007, đã luôn gắn bó, chia sẻ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện khóa luận.  Con vô cùng biết ơn cha mẹ đã dạy bảo, nuôi dƣỡng con đƣợc nhƣ ngày hôm nay, cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2007. Sinh viên Nguyễn Hồng Phƣớc v TÓM TẮT KHÓA LUẬN  Nguyễn Hồng Phƣớc, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 9 năm 2007, “Đánh giá tình trạng nhiễm Tomato Spotted Wilt Virus trên cà chua bằng kỹ thuật ELISA và xây dựng quy trình chẩn đoán Tomato Spotted Wilt Virus bằng kỹ thuật RT – PCR” đƣợc thực hiện từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2007 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh thuộc Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trƣờng (RIBET), Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.  Nội dung thực hiện: Thu mẫu có triệu chứng nhiễm TSWV tại xã Bình Ninh và xã Hòa Định huyện Chợ Gạo, xã Bình Nhì và xã Thạnh Nhật thuộc thị xã Gò Công. Xác định tỉ lệ nhiễm TSWV trên cà chua tại các xã Bình Ninh, Hòa Định, Bình Nhì, Thạnh Nhật thuộc tỉnh Tiền Giang bằng kỹ thuật DAS – ELISA. Mẫu biểu hiện dƣơng tính mạnh đƣợc chọn để thực hiện phản ứng RT – PCR. Từ đó tìm ra quy trình RT – PCR chẩn đoán bệnh TSWV.  Kết quả đạt đƣợc: 1. Xác định tỷ lệ nhiễm TSWV tại các địa bàn nhƣ sau: Huyện Chợ Gạo Xã Hòa Định 12,0 % Xã Bình Ninh 13,16 % Thị xã Gò Công Xã Bình Nhì 14,29 % Xã Thạnh Nhật 10,0 % 2. Bƣớc đầu tìm đƣợc quy trình RT – PCR một bƣớc để chẩn đoán bệnh TSWV. vi SUMMARY  This is Nguyen Hong Phuoc studying at Nong Lam University and finishing the thesis on 9 th 2007. The thesis entiled “Evaluation on the status quo of Tomato Spotted Wilt Virus affecting tomato plant in Tien Giang province by ELISA and formulating the RT – PCR process to diagnose Tomato Spotted Wilt Virus” This research was conducted from 3th, 2007 to 8th, 2007 in the laboratory of biotechnology and chemistry of Nong Lam University.  The contents of this are as follows: Collecting the samples with Tomato Spotted Wilt Virus symptoms in Binh Ninh and Hoa Dinh villages of Cho Gao district, Binh Nhi and Thanh Nhat of Go Cong town. Diagnosing Tomato Spotted Wilt Virus in tomato at Binh Ninh, Hoa Dinh, Binh Nhi anh Thanh Nhat villages of Tien Giang province by DAS – ELISA kit. Samples of Tomato Spotted Wilt Virus with positive reaction are selected to conduct the RT – PCR. The RT – PCR protocol to diagnose Tomato Spotted Wilt Virus was tested.  The results of this research are as follows: 1. DAS – ELISA result data show that: Cho Gao district: Hoa Dinh village: 12,0 % Binh Ninh village: 13,16 % Go Cong town: Binh Nhi village: 14,29 % Thanh Nhat village: 10,0 % 2. Finding out the one step RT – PCR process to diagnose Tomato Spotted Wilt Virus. vii MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................ iv TÓM TẮT KHÓA LUẬN .......................................................................................... v SUMMARY .............................................................................................................. vi MỤC LỤC ................................................................................................................ vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................ x DANH SÁCH CÁC HÌNH ....................................................................................... xi DANH SÁCH CÁC BẢNG ..................................................................................... xii DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ .................................................................................. xiii Chƣơng 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1 1.2. Mục đích ........................................................................................................... 2 1.3. Yêu cầu ............................................................................................................. 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3 2.1. Sơ lƣợc về cây cà chua ..................................................................................... 3 2.1.1. Nguồn gốc và phân bố .............................................................................. 3 2.1.2. Phân loại học ............................................................................................. 4 2.1.3. Đặc điểm thực vật học ............................................................................... 4 2.1.4. Giá trị dinh dƣỡng ..................................................................................... 5 2.2. Sơ lƣợc về bệnh hại cà chua ............................................................................. 6 2.2.1. Đặc điểm chung bệnh do virus .................................................................. 6 2.2.2. Sự lan truyền bệnh virus thực vật ............................................................. 7 2.2.3. Sơ lƣợc về TSWV ..................................................................................... 8 2.2.3.1. Nguồn gốc TSWV .............................................................................. 8 2.2.3.2. Cấu trúc TSWV .................................................................................. 9 2.2.3.3. Phân loại TSWV .............................................................................. 10 2.2.3.4. Dãy ký chủ của TSWV .................................................................... 11 viii 2.2.3.5. Con đƣờng truyền bệnh .................................................................... 11 2.2.3.6. Hình thức tấn công và gây bệnh ....................................................... 12 2.2.3.7. Điều kiện phát triển .......................................................................... 13 2.2.3.8. Triệu chứng bệnh ............................................................................. 13 2.2.3.9. Khống chế bệnh do TSWV ............................................................. 14 2.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh ................................................................. 16 2.3.1. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng ......................................... 16 2.3.2. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị ................................................ 17 2.3.3. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử ................................. 17 2.3.4. Phƣơng pháp ELISA ............................................................................... 18 2.3.5. Phƣơng pháp RT – PCR .......................................................................... 19 2.3.5.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR .................................................. 19 2.3.5.2. Nested PCR ...................................................................................... 20 2.3.5.3. RT – PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction) . 20 2.4. Một số kết quả nghiên cứu về TSWV ............................................................ 23 2.4.1. Nghiên cứu nƣớc ngoài ........................................................................... 23 2.4.2. Nghiên cứu trong nƣớc ........................................................................... 23 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 24 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................. 24 3.2. Vật liệu ........................................................................................................... 24 3.2.1. Dụng cụ và thiết bị .................................................................................. 24 3.2.1.1. Dụng cụ ............................................................................................ 24 3.2.1.2. Máy móc, thiết bị ............................................................................. 25 3.2.2. Hoá chất .................................................................................................. 25 3.2.2.1. Hoá chất dùng trong kỹ thuật ELISA............................................... 25 3.2.2.2. Hóa chất dùng trong kỹ thuật RT – PCR ......................................... 26 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................ 28 3.3.1. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 28 3.3.2. Phƣơng pháp lấy mẫu .............................................................................. 28 ix 3.3.3. Phƣơng pháp phát hiện TSWV ............................................................... 30 3.3.3.1. Phƣơng pháp ELISA ........................................................................ 30 3.3.3.2. Phƣơng pháp RT – PCR ................................................................... 32 3.3.3.3. Đổ gel điện di ................................................................................... 38 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 40 4.1. Kết quả phát hiện TSWV bằng kỹ thuật ELISA ............................................ 40 4.1.1. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại hai xã thuộc huyện Chợ Gạo .............................. 40 4.1.2. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại hai xã thuộc thị xã Gò Công ............................... 41 4.1.3. Tỉ lệ nhiễm bệnh TSWV của huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công .......... 42 4.1.4. Tỉ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng ....................................................... 43 4.2. Kết quả phát hiện TSWV bằng kỹ thuật RT – PCR....................................... 44 4.2.1. Kết quả kiểm tra sản phẩm RNA ............................................................ 44 4.2.2. Kết quả điện di sản phẩm cDNA ............................................................ 45 4.2.3. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi ..................................................... 46 4.2.4. Kết quả phản ứng RT – PCR................................................................... 46 4.2.4.1. Phản ứng RT – PCR hai bƣớc .......................................................... 46 4.2.4.2. Phản ứng RT – PCR một bƣớc......................................................... 46 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 48 5.1. Kết luận .......................................................................................................... 48 5.2. Đề nghị ........................................................................................................... 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 50 x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TSWV: Tomato Spotted Wilt Virus RNA: Ribonucleic acid RNase: Ribonuclease DNA: Deoxyribonucleic acid DNase: Deoxyribonuclease cDNA: Complementary Deoxyribonucleotide acid bp: Base pair DEPC: Diethyl pyrocarbonate ddNTP: Dideoxyribonucleoside triphosphate dNTP: Deoxyribonucleoside triphosphate ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay DAS – ELISA: Direct double antibody sandwich PCR: Polymerase chain reaction RT-PCR: Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction PBS-T: Phosphate buffer saline with TWEEN – 20 p-NPP: p – nitrophenyl phosphate Ta: Annealing temperature Tm: Melting temperature UV: Ultra violet OD: Optical density xi DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Cấu trúc virus TSWV ................................................................................ 10 Hình 2.2. Chu trình sống của bọ trĩ ........................................................................... 12 Hình 2.3. Triệu chứng TSWV trên cà chua .............................................................. 14 Hình 2.4. Quy trình RT – PCR một bƣớc ................................................................. 21 Hình 2.5. Quy trình RT – PCR hai bƣớc ................................................................... 21 Hình 4.1. Kết quả điện di RNA tổng số .................................................................... 44 Hình 4.2. Kết quả điện di sản phẩm cDNA .............................................................. 45 Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm RT – PCR một bƣớc ....................................... 47 xii DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1. Thành phần dinh dƣỡng trong 100 g thịt trái cà chua (McGlasson, B., 1993; PROSEA, 1994) ................................................................................ 5 Bảng 3.1. Sơ đồ bố trí lấy mẫu .................................................................................. 30 Bảng 3.2. số lƣợng mẫu và vị trí lấy mẫu ................................................................. 30 Bảng 3.3. Sơ đồ bố trí ELISA ................................................................................... 31 Bảng 3.4. Thành phần hóa chất RT – PCR một bƣớc ............................................... 35 Bảng 3.5. Thành phần hóa chất tổng hợp cDNA ...................................................... 36 Bảng 3.6. Thành phần hoá chất PCR ........................................................................ 37 Bảng 4.1. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại xã Bình Ninh và xã Hòa Định thuộc huyện Chợ Gạo ............................................................................................................ 40 Bảng 4.2. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại xã Bình Nhì và xã Thạnh Nhật thuộc thị xã Gò Công .......................................................................................................... 41 Bảng 4.3. Tỉ lệ nhiễm TSWV của huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công .................... 42 xiii DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ ĐỒ THỊ TRANG Đồ thị 4.1. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại huyện Chợ Gạo ................................................... 40 Đồ thị 4.2. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại thị xã Gò Công ................................................... 41 Đồ thị 4.3. Tỉ lệ nhiễm TSWV huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công ......................... 42 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Cà chua (Solanum lycopersicum) là cây trồng rất quan trọng, nó không những phục vụ nhu cầu hằng ngày của con ngƣời mà còn đem lại thu nhập cho ngƣời dân mà xa hơn nữa là góp phần không nhỏ vào ngân sách nhà nƣớc. Chính vì lợi nhuận không nhỏ đó mà cà chua đƣợc trồng vào tất cả các mùa trong năm, ở khắp mọi nơi trên thế giới. Tiền Giang với điều kiện khí hậu thích hợp, nƣớc tƣới dồi dào và đất đai màu mỡ rất phù hợp để trồng rau màu, trong đó cà chua chiếm diện tích khá lớn, nó nhƣ là nguồn thu nhập không thể thiếu của ngƣời dân nơi đây. Nhƣ là một quy luật của tự nhiên, đi đôi với sự gia tăng về diện tích, tăng cƣờng thâm canh thì dịch bệnh gia tăng không kém. Dịch bệnh là một trong những trở ngại lớn cho việc canh tác của ngƣời dân, dịch bệnh làm thiệt hại không nhỏ cho thu nhập ngƣời dân và ngân sách nhà nƣớc. Trong số những bệnh hại cây trồng thì bệnh do virus là nguy hiểm nhất do chƣa có thuốc trị đặc hiệu, kèm theo là khả năng lây lan rất nhanh, khó nhận biết ở giai đoạn sớm, và khi phát thành bệnh thì đã gây thiệt hại rất lớn không thể kiểm soát đƣợc. Trong số những bệnh do virus gây ra thì TSWV gây thiệt hại rất lớn cho việc canh tác cà chua, thuốc lá và những cây trồng họ Solanaceae. Điều đó đặt ra một nhu cầu cấp thiết làm sao để sớm phát hiện và loại bỏ cây bị nhiễm. Đây không chỉ là vấn đề quan trọng đối với các nƣớc Trung Quốc, Mỹ, Brazil, Mehico… mà còn đối với các nƣớc nhiệt đới khác, trong đó có Việt Nam. Ngày nay với sự phát triển vƣợt bậc khoa học và công nghệ đặc biệt là của công nghệ sinh học, các kỹ thuật phân tử đã giúp cho việc chẩn đoán sớm bệnh một cách nhanh, chính xác nhiều bệnh virus. 2 Xuất phát từ thực tế trên cùng với sự chấp nhận của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh và sự hƣớng dẫn của PGS.TS. Bùi Cách Tuyến, chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá tình trạng nhiễm Tomato Spotted Wilt Virus trên cà chua tại tỉnh Tiền Giang bằng kỹ thuật ELISA và xây dựng quy trình chẩn đoán Tomato Spotted Wilt Virus bằng kỹ thuật RT - PCR” nhằm góp phần kiểm soát dịch bệnh. 1.2. Mục đích Chẩn đoán bệnh TSWV trên cà chua tại Tiền Giang bằng kỹ thuật ELISA. Xây dựng hoàn chỉnh quy trình chẩn đoán Tomato Spotted Wilt Virus bằng kỹ thuật RT – PCR. 1.3. Yêu cầu Thu mẫu cà chua có triệu chứng nhiễm bệnh TSWV . Nắm vững kỹ thuật và các bƣớc tiến hành DAS – ELISA. Lấy mẫu có phản ứng dƣơng tính mạnh với DAS – ELISA tiến hành phản ứng RT – PCR. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Sơ lƣợc về cây cà chua 2.1.1. Nguồn gốc và phân bố Cà chua có nguồn gốc ở Peru, Ecuado và Bolivia. Những loài cà chua hoang dại gần gũi với cà chua trồng trọt ngày nay vẫn còn đƣợc tìm thấy ở dọc theo dãy núi Anđơ (Peru), Ecuado và Bolivia (De Candolle,1884). Tuy nhiên Mehico là đất nƣớc đâu tiên trồng trọt hóa cây trồng này dựa vào 3 chứng cứ: cà chua trồng bắt đầu từ Châu Mỹ; đƣợc trồng trọt hóa trƣớc khi chuyển xuống Châu Âu, Châu Á và tổ tiên của cà chua trồng ngày nay là cà chua Anh Đào đƣợc tìm thấy ở vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Châu Mỹ, sau đó đến vùng nhiệt đới Châu Á và Châu Phi; những nghiên cứu về enzyme định vị và sự biến đổi