Luận văn Định danh nấm phytophthora spp. bằng các kỹ thuật sinh học phân tử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * * * NGUYỄN HUỲNH HOÀNG MINH ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN NGUYỄN HUỲNH HOÀNG MINH KS. TRỊNH THỊ PHƢƠNG VY KHÓA: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY * * * * * IDENTIFYING Phytophthora spp. BY MOLECULAR TECHNOLOGIES GRADUATION OF THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor: Student: PhD. LE DINH DON NGUYEN HUYNH HOANG MINH Bs. TRINH THI PHUONG VY TERM: 2002 - 2006 HCMC, 8/2006 iv LỜI CẢM ƠN - Em xin chân thành gửi lời cảm ơn của mình đến cán bộ giáo viên Trường Đại Học Nông Lâm, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này. - Em rất biết ơn sự hướng dẫn của thầy Tiến sĩ Lê Đình Đôn, Kỹ sư Trịnh Thị Phương Vy, Kỹ sư Nguyễn Văn Lẫm đã tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thợc hiện đề tài. - Cảm ơn thầy cô, anh chị giảng viên Phòng Công Nghệ Sinh Học – Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài. - Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn thực tập đề tài tại Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, đặc biệt là các bạn nhóm Bảo Vệ Thực Vật trong thời gian qua đã tận tình giúp đỡ. - Cảm ơn tập thể lớp Công nghệ sinh học khóa 28 đã cùng tôi chia sẽ những kỉ niệm buồn vui trong suốt thời gian bốn năm học vừa qua. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006 Sinh viên Nguyễn Huỳnh Hoàng Minh v TÓM TẮT Nguyễn Huỳnh Hoàng Minh, Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. “ ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ”. Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Đình Đôn KS. Trịnh Thị Phương Vy Nấm Phytophthora được xem là một trong những tác nhân nguy hiểm hàng đầu cho nền kinh tế nông nghiệp nước ta hiện nay. Dựa trên một số kết quả đạt được từ những nghiên cứu trước đây về hình thái và sinh thái của giống nấm này, chúng tôi đã đề nghị qui trình định danh giống nấm này trên cơ sở cấu trúc di truyền của chúng. Mục đích của đề tài bao gồm việc sử dụng kỹ thuật PCR, kỹ thuật giải trình tự nhằm khuếch đại và xác định vùng trình tự đặc trưng ITS1- 5,8S- ITS2. Kết quả của đề tài tạo cơ sở cho những nghiên cứu điều tra và kiểm soát mầm bệnh Phytophthora ở nước ta. Sau khi thực hiện toàn bộ qui trình, chúng tôi thu được một số kết quả sau: - Sản phẩm khuếch đại trong vùng ITS1- 5,8S- ITS2 của hai mẫu nấm trên tiêu Bà Rịa và sầu riêng Đồng Nai là 900 bp. Trong khi sản phẩm khuếch đại của hai mẫu nấm trên địa lan cho band 800 bp hoặc 900 bp hoặc cả hai band trên. - Kết quả giải trình tự hai mẫu nấm trên địa lan cho thấy trình tự của toàn vùng ITS1- 5,8S- ITS2 khoảng 800 bp. Trong đó vùng ITS1 khoảng 225 bp; vùng 5,8S là 160 bp và vùng ITS2 là 420 bp. vi MỤC LỤC .......o0o....... Trang Lời cảm ơn ............................................................................................................ iv Tóm tắt ................................................................................................................... v Mục lục ................................................................................................................. vi Danh mục các hình .............................................................................................. ix Danh mục các bảng................................................................................................ x Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................... xi 1. Giới thiệu ........................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................ 2 1.2 Mục đích – yêu cầu của đề tài ......................................................................... 2 1.2.1 Mục đích của đề tài ....................................................................................... 2 1.2.2 Yêu cầu của đề tài ......................................................................................... 2 1.2.3 Giới hạn của đề tài ........................................................................................ 2 1.2.4 Đối tượng của đề tài ..................................................................................... 2 2. Tổng quan .......................................................................................................... 3 2.1 Giới thiệu về giống Phytophthora ................................................................... 3 2.1.1 Cây tiến hoá của Phytophthora .................................................................... 4 2.1.2 Chu kì sống của Phytophthora ..................................................................... 4 2.1.3 Phân lập Phytophthora từ các bôl phận nhiễm bệnh của cây ....................... 5 2.1.4 Một số môi trường phân lập Phytophthora từ mô bệnh ............................... 6 2.1.5 Đặc điểm hình thái của giống Phytophthora ................................................ 6 2.1.6 Phân biệt nấm Pythium và nấm Phytophthora ............................................. 7 2.2 Một số bệnh Phytophthora được nghiên cứu tại Việt Nam ............................ 7 2.2.1 Cà chua và khoai tây ..................................................................................... 8 2.2.2 Khoai sọ ........................................................................................................ 8 2.2.3 Dứa ............................................................................................................... 8 2.2.4 Họ cam chanh ............................................................................................... 8 2.2.5 Sầu riêng ...................................................................................................... 9 vii 2.2.6 Mận ............................................................................................................... 9 2.2.7 Cao su ......................................................................................................... 10 2.3 Các kỹ thuật phát hiện và định danh Phytophthora ...................................... 11 2.3.1 Kỹ thuật quan sát hình thái trên môi trường nuôi cấy ................................ 11 2.3.2 So sánh sự tương xứng giữa sinh sản và sinh dưỡng ................................. 12 2.3.3 Kỹ thuật protein profile .............................................................................. 12 2.3.4 Isozyme ....................................................................................................... 13 2.3.5 Huyết thanh học và kit chuẩn đoán ............................................................ 13 2.3.6 Kỹ thuật RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism ) ............... 14 2.3.7 Kỹ thuật probe acid nucleic, DNA fingerprinting ..................................... 14 2.3.8 Sự lai DNA-DNA ....................................................................................... 15 2.3.9 Kỹ thuật PCR và RAPD ............................................................................. 15 2.4 Một số công trình nghiên cứu định danh nấm Phytophthora ........................ 15 2.4.1 Một số công trình nghiên cứu ngoài nước .................................................. 15 2.4.2 Công trình nghiên cứu trong nước.............................................................. 17 2.5 Một số lưu ý trước khi thực hiện thí nghiệm ................................................. 18 2.5.1 Sơ lược về trình tự ITS ............................................................................... 18 2.5.2 Danh mục các loài Phytophthora được tìm thấy ở Việt Nam .................... 19 3. Vật Liệu và phương pháp ................................................................................ 21 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài .......................................................... 21 3.1.1 Thời gian thực hiện ..................................................................................... 21 3.1.2 Địa điểm thực hiện ..................................................................................... 21 3.2 Vật liệu và hoá chất ....................................................................................... 21 3.2.1 Tăng sinh và nhân sinh khối ...................................................................... 21 3.2.2 Ly trích DNA .............................................................................................. 22 3.2.3 Điện di ........................................................................................................ 22 3.2.4 Kỹ thuật PCR .............................................................................................. 23 3.3 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 23 3.3.1 Tăng sinh và nhân sinh khối ....................................................................... 23 3.3.2 Ly trích DNA .............................................................................................. 24 3.3.3 Kỹ thuật PCR .............................................................................................. 26 3.3.4 Kỹ thuật giải trình tự .................................................................................. 28 viii 3.3.5 Xử lý kết quả giải trình tự .......................................................................... 29 4. Kết quả và thảo luận ........................................................................................ 30 4.1 Quá trình tăng sinh và nhân sinh khối ........................................................... 30 4.2 Quá trình ly trích .......................................................................................... 30 4.3 Quá trình PCR ............................................................................................... 31 4.4 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR .................................................................. 35 4.5 Xử lý kết quả giải trình tự ............................................................................. 36 5. Kết luận và đề nghị .......................................................................................... 44 6. Tài liệu tham khảo ........................................................................................... 45 7. Phụ lục ............................................................................................................. 47 ix Danh sách các hình Hình 2.1. Chu kì sống của Phytophthora .............................................................. 4 Hình 2.2. Một số bệnh do Phytophthora gây ra trên một số cây trồng ............... 10 Hình 2.3. Vùng trình tự ITS trong DNA ribosome ............................................. 18 Hình 4.1. Sản phẩm của qui trình 1 ..................................................................... 31 Hình 4.2. Sản phẩm của qui trình ly trích 2 ........................................................ 31 Hình 4.3. Thang nồng độ DNA chuẩn ................................................................. 32 Hình 4.4. Kết qủa phản ứng PCR ........................................................................ 33 Hình 4.5. Sản phẩm PCR lần thứ hai ................................................................... 34 Hình 4.6. Mẫu tinh sạch dùng cho phản ứng giải trình tự ................................... 36 Hình 4.7. Cây phát sinh loài của hai mẫu địa lan ................................................ 40 x Danh sách các bảng Bảng 2.1. Cây tiến hoá của nấm Phytophthora…………………………………..4 Bảng 2.2. Danh mục các loài nấm Phytophthora được tìm thấy ở Việt Nam ..... 19 Bảng 3.1. Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 25 l ..................................... 26 Bảng 3.2.Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 50 l ...................................... 27 Bảng 3.3.Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR ........................................................... 27 Bảng 4.1. Các nguồn nấm trên ngân hàng gen được dùng để so sánh ............... 37 Bảng 4.2. So sánh trình tự nucleotide vùng ITS của hai mẫu DL1, DL2 ........... 38 Bảng 4.3. Kết quả so sánh từng vùng trên đoạn ITS1- 5,8S- ITS2 ..................... 40 Bảng 4.4. Trình tự vùng gen (ITS1-5.8S-ITS2) của mẫu Phytophthora địa lan 42 xi DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT bp: base pair Kbp Kilobase pair DNA: Deoxyribonucleic acid dNTP: 3’- Deoxyribonucleoside- 5’- triphosphate dGTP: deoxyguanosine triphosphate dCTP: deoxycytidine triphosphate dATP: deoxyadenosine triphosphate dTTP: deoxythymidine triphosphate ETDA: Ethylenediamine tetraacetic acid PCR: Polymerase Chain Reaction RFLP: Restriction fragment length polymorphism RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA RNA: Ribonucleic acid rDNA: ribosome Deoxynucleotide acid SDS: Sodium dodecyl sulfate TAE: Tris Acetate EDTA Taq: Thermus aquaticus UV: Ultraviolet (light) w/v: Weight for volume 1 Phần 1. GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề: Nấm Phytophthora được xem là một tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho cây do sức tàn phá mãnh liệt của nó. Nó gây ra những căn bệnh như: bệnh thối rễ, thối lỡ cổ rễ, loét thân, tàn lụi lá, thối trái và đặc biệt nguy hiểm là bệnh mốc sương trên khoai tây. Việc phân lập và định danh nấm Phytophthora để tìm ra các phương cách phòng trừ hữu hiệu là một nhu cầu cấp thiết. Hiện nay, người ta chỉ định danh được khoảng 60 loài Phytophthora chính thức được phân bố trên nhiều ký chủ ở nhiều vùng khí hậu khác nhau trên thế giới. Các loài Phytophthora này đặc biệt phát triển mạnh ở các nước có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới trong đó có Việt Nam. Những nghiên cứu về Phytophthora ở Việt Nam chỉ nhằm mục đích phát hiện sự lây lan và phát triển bệnh. Mặt khác, do đặc tính của các loài Phytophthora gần giống nhau và rất biến đổi cho nên các kỹ thuật định danh trước đây (chẳng hạn như kỹ thuật quan sát hình thái) không thể định danh được một số loài. Ngày nay, dựa trên những tiến bộ khoa học kỹ thuật mà đặc biệt là những tiến bộ về các kỹ thuật sinh học phân tử ta có thể giải quyết những khó khăn trên. Các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại với các kỹ thuật như: kỹ thuật PCR, kỹ thuật sử dụng enzyme cắt, kỹ thuật đọc trình tự,…. tác động lên cấu trúc phân tử DNA của các loài nấm từ đó cho phép việc định danh chúng một cách chính xác hơn. Với sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học và được sự hướng dẫn của Tiến Sĩ Lê Đình Đôn, Kỹ Sư Trịnh Thị Phương Vy ( Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật- Khoa Nông Học). Chúng tôi đã thực hiện đề tài ” ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ” nhằm hoàn thiện qui trình định danh nấm Phytophthora bằng các kỹ thuật sinh học phân tử. 2 1.2. Mục đích – yêu cầu của đề tài 1.2.1 Mục đích của đề tài Định danh nấm Phytophthora.bằng các kỹ thuật sinh học phân tử. Cụ thể là sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi ITS4 và ITS5 để khuếch đại vùng ITS1 và ITS2 trong ribosomal DNA của nấm Phytophthora. Sau đó dùng kỹ thuật đọc trình tự để định danh các mẫu nấm trên. 1.2.2 Yêu cầu của đề tài - Tăng sinh, nhân sinh khối các mẫu nấm Phytophthora trên nhiều loại cây trồng ở một số vùng khác nhau. - Phát hiện đoạn gen ITS1- 5,8S- ITS2 bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi ITS4 và ITS5. - Sử dụng kỹ thuật đọc trình tự để định danh các mẫu nấm đã phân lập ở trên. 1.2.3 Giới hạn của đề tài Đề tài chỉ thực hiện được trên các mẫu nấm phân lập được ở một số cây trồng thuộc vùng Đông Nam Bộ. Do đó, đề tài chỉ định danh được ở một mức độ giới hạn các loài nấm Phytophthora ở Việt Nam. 1.2.4 Đối tƣợng của đề tài Các mẫu nấm được lấy từ nhiều loại cây khác nhau như: Tiêu, Sầu Riêng, các loại Lan tại các tỉnh như: Đồng Nai, Bà Rịa Vũng Tàu. 3 Phần 2. TỔNG QUAN 2.1. Giới thiệu về giống Phytophthora Tên của giống nấm bệnh Phytophthora có nguồn gốc từ tiếng Hi Lạp (Phyto có nghĩa là thực vật; phthora có nghĩa là vật phá hoại ). P.infestans còn được biết như loài nấm gây nên nạn mất mùa khoai tây ở Ailen. Nó đã phá hoại trên diện rộng những vụ mùa chính của khoai tây trong suốt hai năm 1845 và 1846. Căn bệnh này đã gây nên tác hại nghiêm trọng về kinh tế và xã hội cho đất nước này, đó là nạn đói và sự ra đi của hai triệu cư dân. Sau đó vài thập kỷ nó lại gây nên một cuộc tranh cải lớn về bệnh tàn lụi muộn, Anton de Bary cũng như Rev. Miles Joseph Berkeley trước đó đã khẳng định: giống nấm này có thể là nguyên nhân chính gây nên bệnh tàn lụi muộn. Và cho đến năm 1876 nó có tên là Phytophthora infestans (Bary). Bệnh Phytophthora đã được nghiên cứu sâu ở châu Âu. Tuy nhiên đây lại là bệnh khá phổ biến ở vùng nhiệt đới ẩm và gây nhiều bệnh nguy hiểm làm mất mùa ở nhiều loại cây ăn quả quan trọng ở những vùng này: như bệnh thối rễ, thối lỡ cổ rễ, loét thân, tàn lụi lá và thối trái. Có thể nói Phytophthora là một nhóm lớn thuộc lớp Oomycetes, có mặt khắp mọi nơi trên thế giới và có hơn 1.000 cây kí chủ, một vài loài của Phytophthora đã trở thành dịch hại (Gregory, 1983). Trong khi P. cinnamomi được tìm thấy ở vùng nhiệt đới thì P. palmivora, P. parasitica và P. citrophthora là đặc trưng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới; P.infestans, P.syringae và P.fragariae xuất hiện phổ biến ở vùng ôn đới. 4 Hình 2.1. Chu kì sống của Phytophthora (SI-AMMOUR, 2002) 2.1.1. Cây tiến hóa của Phytophthora (Andre’ Drenth, 2001) Bảng 2.1. Cây tiến hoá của nấm Phytophthora Ngành Lớp Bộ Họ Giống Chromista Oomycetes Lagenidiales Leptomitales Saprolegniales Saprolegniaceae Achlya Saprolegnia Peronosporales Pythiaceae Pythium Phytophthora Peronosporaceae Bremia Peronospora Albuginaceae Albugo 2.1.2. Chu kì sống của phytophthora 5 Khi Phytophthora được nuôi cấy trong môi trường thích hợp, khuẩn ty (Mycelium) của nó phát triển rất nhanh. Dưới điều kiện ẩm ướt chúng tạo ra những bào tử vô tính được gọi là túi bào tử (Sporangia) hoặc túi bào tử động (Zoosporangia). Túi bào tử này nảy mầm trong môi trường nước hoặc khi nhiệt độ môi trường giảm. Chúng phóng thích ra những bào tử động (Zoospores) với hệ lông roi không đều nhau (Heterokont flagella). Những bào tử động sau khi được phóng thích sẽ bơi lội hàng giờ liền và cuối cùng ngừng bơi lội để cuộn tròn hay kết kén. Sau một thời gian chúng hình thành vách tế bào. Ở giai đoạn này, bào tử được gọi là kén hay nang (Cyst). Bào tử vách dày (Chlamydospore) ở dạng hình cầu hay oval, là một cấu trúc nghỉ vô tính. Cấu trúc hữu tính bao gồm túi giao tử đực (Antheridium - bộ phận sinh sản đực) và túi noãn ( Oogonium - bộ phận sinh sản cái). Quá trình giảm phân hình thành nên túi giao tử đực và túi noãn. Đây chỉ là giai đoạn đơn bội trong vòng đời của Phytophthora. Giai đoạn lưỡng bội đóng vai trò quyết định trong suốt chu kì sống của chúng. Các vòi thụ tinh từ túi giao tử đực sẽ thoát vị đưa nhân của giao tử đực vào noãn. Hợp tử sau khi được thụ tinh sẽ nảy mầm ở điều kiện thích hợp tùy thuộc vào sự kết hợp của trứng với một hay nhiều ống giao tử đực. Giống Phytophthora bao gồm một số loài nấm dị tản (Heterothallic)(có hai kiểu lai A1và A2) chẳng hạn như P.infestans. Số còn lại là những loài nấm đồng tản (Homothallic) bao gồm cả P. sojae hoặc P. porri. 2.1.3. Phân lập Phytophthora từ các bộ phận nhiễm b