Luận văn Hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu sự đa dạng di truyền của cây đước đôi (rhizophora apiculata blume) ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật rapd

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: VÕ CÔNG DANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. BÙI MINH TRÍ VÕ CÔNG DANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM TẠ Không ngôn từ nào có thể nói hết tình yêu con dành cho Ba Mẹ, ngƣời sẵn sàng hy sinh tất cả vì con. Cảm ơn các anh em, những ngƣời luôn tạo động lực cho tôi tiến lên. Em xin chân thành cảm ơn: Các Thầy Cô trong trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt bốn năm học. Ban chủ nhiệm cùng các Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học đã động viên, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận. Thầy Bùi Minh Trí đã tận tình chỉ dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Chị Hƣng, chị Dung, chi Trân, anh Thế, anh Phƣơng, anh Khoa cùng các anh chị trong Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trƣờng đã động viên, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận. Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thu thập mẫu. Anh Bình, anh Kiệt cùng các anh trong phòng Kỹ thuật thuộc Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình thu thập mẫu. Xin cảm ơn các bạn lớp Công nghệ Sinh học 29 đã cùng tôi chia sẻ biết bao niềm vui, nỗi buồn trong suốt bốn năm đại học. Chân thành cảm ơn! Võ Công Danh iv TÓM TẮT VÕ CÔNG DANH, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 9/2007. “HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”. Cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ rất có giá trị về kinh tế và môi trƣờng. Việc nghiên cứu đa dạng di truyền của cây đƣớc đôi là cấp thiết nhằm bảo vệ, quản lý và phát triển khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ theo hƣớng đa dạng sinh học. Những kết quả đạt đƣợc Thu thập đƣợc 40 mẫu lá đƣớc với những đặc điểm hình thái khác nhau Xác định điều kiện tối ƣu để bảo quản mẫu lá đƣớc Hoàn thiện quy trình ly trích DNA từ lá đƣớc Xây dựng quy trình RAPD phù hợp cho cây đƣớc Kết quả thực hiện phản ứng RAPD với primer OPAC10 trên 10 mẫu kết quả thu đƣợc 5 band đa hình chiếm tỷ lệ 83,3% và 1 band đồng hình chiếm tỷ lệ 16,7%. Phân tích kết quả RAPD với phần mềm NTSYSpc cho kết quả nhƣ sau: các mẫu đƣớc trồng cùng năm có hệ số đồng dạng di truyền cao từ 0,83 – 1,00. Các mẫu đƣớc trồng năm 1978 và năm 1980 có hệ số đồng dạng di truyền biến thiên trong khoảng 0,50 – 0,83. Các mẫu đƣớc nguồn gốc tại chỗ đƣợc trồng năm 1991 và trồng năm 1996 có hệ số đồng dạng di truyền là 0,50. Những cây đƣớc đôi nguồn giống tại chỗ và nguồn giống Cà Mau có hệ số đồng dạng di truyền khá thấp từ 0,33 đến 0,67. ( II ) ( III ) v SUMMARY VO CONG DANH, Nong Lam University Ho Chi Minh City, September 2007. “DEVELOP A METHOD TO ACEESS THE GENETIC DIVERSITY OF Rhizophora apiculata Blume IN CAN GIO MANGROVE BIOPHERE RESERVE BY RAPD-PCR” Mangrove population (Rhizophora apiculata Blume) in Can Gio swamp forest eco-conservation area has a high economic and environmental value. Researching the genetic diversity of this plant is necessary to preserve and develop this area in a sustainable way. Obtained results were: Collected 40 samples of Rhizophora apiculata Found out the best conditions to preserve Rhizophora apiculata Completed DNA extraction protocol from Rhizophora apiculata Established RAPD protocol for Rhizophora apiculata We analysed 10 samples using RAPD with primer OPAC 10 and got 5 polymorphic bands (100 – 600kb) and 1 monomorphic band (170 kb) which made up 83,3 percents and 16,7 percents of bands. Analyse RAPD data with NTSYSpc software showed following results: Rhizophora apiculata planted in 1978, 1980 had high similarity from 0,83 to 1,00. Compare R. apiculata planted in 1978 with the one planted in 1980 showed a similarity from 0,50 to 0,83. The similarity of local R. apiculata and the one planted in 1991 or in 1996 is 0,50. While the local R. apiculata and the one from Camau plants had long distance from 0,33 to 0,67. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG LỜI CẢM TẠ .................................................................................................................. iii TÓM TẮT ....................................................................................................................... iv SUMMARY ..................................................................................................................... v MỤC LỤC ....................................................................................................................... vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................ ix DANH SÁCH CÁC HÌNH .......................................................................................................... x DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ................................................................................... xi Chƣơng 1 MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1 1.2. Mục đích, yêu cầu, giới hạn của đề tài ...................................................................... 2 1.2.1. Mục đích ........................................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu ............................................................................................................. 2 1.2.3. Giới hạn đề tài .................................................................................................. 2 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3 2.1. Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ................................ 3 2.1.1. Giới thiệu khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ............................. 3 2.1.2. Cấu trúc của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ .......................... 5 2.1.3. Vai trò của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ............................ 6 2.2. Đặc điểm sinh vật học và hình thái học của cây đƣớc đôi ....................................... 8 2.2.1. Hình thái học .................................................................................................... 8 2.2.2. Phân bố ............................................................................................................. 9 2.2.3. Vai trò của rừng đƣớc ...................................................................................... 9 2.3. Quy trình ly trích DNA thực vật .............................................................................. 9 2.3.1. Đánh giá chất lƣợng DNA .............................................................................. 11 vii 2.4. PCR (Polymerase chain reaction) ........................................................................... 12 2.4.1. Khái niệm ....................................................................................................... 12 2.4.2. Nguyên tắc ..................................................................................................... 13 2.4.3. Ứng dụng ........................................................................................................ 13 2.4.4. Ƣu và nhƣợc điểm ......................................................................................... 13 2.5. Đa dạng di truyền .................................................................................................... 14 2.5.1. Khái niệm ...................................................................................................... 14 2.5.2. Ý nghĩa nghiên cứu đa dạng di truyền ........................................................... 14 2.6. Chỉ thị phân tử DNA (DNA marker) ..................................................................... 15 2.6.1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ................................... 16 2.6.2. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) .................................... 17 2.6.3. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) .......................................... 18 2.6.4. Một số nghiên cứu về chỉ thị phân tử trên cây đƣớc ...................................... 21 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ........................................ 22 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện .............................................................................. 22 3.1.1. Thời gian thực hiện ......................................................................................... 22 3.1.2. Địa điểm thực hiện ......................................................................................... 22 3.2. Vật liệu thí nghiệm .................................................................................................. 22 3.1.2. Mẫu đƣớc đôi .................................................................................................. 22 3.2.2. Hoá chất thí nghiệm ........................................................................................ 23 3.2.3. Trang thiết bị thí nghiệm ................................................................................ 24 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................................... 25 3.3.1. Bố trí thí nghiệm ............................................................................................. 25 3.3.2. Phƣơng pháp ly trích DNA ............................................................................. 25 3.3.3. Kiểm tra kết quả ly trích ................................................................................. 28 3.3.4. Kỹ thuật RAPD ............................................................................................... 30 viii 3.3.5. Phƣơng pháp đánh giá mối quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYS ....... 34 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 36 4.1. Kết quả thu thập mẫu đƣớc tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ .................................................................................................................................. 36 4.2. Bảo quản mẫu ..................................................................................................................... 36 4.3. Hoàn thiện quy trình ly trích DNA ..................................................................................... 37 4.4. Kết quả phản ứng RAPD – PCR ......................................................................................... 44 4.4.1. Thí nghiệm 1 .............................................................................................................. 44 4.4.2. Thí nghiệm 2 .............................................................................................................. 45 4.4.3. Thí nghiệm 3 ............................................................................................................. 45 4.4.4. Thí nghiệm 4 .............................................................................................................. 46 4.4.5. Thí nghiệm 5 .............................................................................................................. 47 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................................... 51 5.1. Kết luận ............................................................................................................................... 51 5.2. Đề nghị ................................................................................................................................ 51 TÀI LIÊU THAM KHẢO ......................................................................................................... 53 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT ............................................................................................................ 53 TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI ........................................................................................... 54 PHỤ LỤC ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT A, T, G, C, U: Adenine, Thymine, Guanine, Cytosine, Uracine bp: Base pair CTAB: Cetyltrimethyl Ammonium Bromide dNTP: Deoxynucleotide triphosphate DNA: Deoxyribonucleic acid EB: Extraction Buffer EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid ng: Nanogram OD: Optical density PCR: Polymerase chain reaction RNA: Ribonucleic acid RNase: Ribonuclease RAPD: Random Amplified Polymorphism of DNA SDS: Sodium Dodecyl Sulfate SIDA: Swedish Inernaional Devolopment cooperration Agency TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA TE: Tris EDTA Tm: Melting temperature UNESCO: United Nations Educational Scientific and Cultural Organization UBND: Ủy ban Nhân dân UV: Ultra Violet x DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ................................... 4 Hình 2.2 Nguyên tắc của kỹ thuật RAPD ...................................................................... 19 Hình 3.1 Lá, hoa, trái của cây đƣớc đôi ......................................................................... 23 Hình 4.1 Vị trí lấy mẫu trên bản đồ Cần Giờ ................................................................. 36 Hình 4.2 DNA tổng số của 4 mẫu đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ (Ly trích theo 3 quy trình ) ...................................................................... 40 Hình 4.3 DNA tổng số của 6 mẫu lá đƣớc (Lá già và lá non) thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ (Ly trích theo quy trình 3). ................................... 40 Hình 4.4 DNA tổng số của 17 mẫu lá đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ .......................................................................................................... 41 Hình 4.5 DNA tổng số pha loãng của 17 mẫu lá đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ...................................................................................... 41 Hình 4.6 Sản phẩm PCR với primer OPAC10 của 3 mẫu đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ............................................................................... 44 Hình 4.7 Sản phẩm PCR khảo sát nồng độ Mg2+ ở thí nghiệm 2 ................................... 45 Hình 4.8 Sản phẩm PCR khảo sát nồng độ primer OPAC10 ở thí nghiệm 3................. 45 Hình 4.9 Sản phẩm PCR thử nghiệm 2 primer OPAC10 VÀ OPA10 ........................... 46 Hình 4.10 Sản phẩm PCR của 10 mẫu đƣớc ở thí nghiệm 5 ......................................... 47 Hình 4.11 Cây phân nhóm di truyền của 10 mẫu đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh quyển ngập mặn Cần Giờ ............................................................................................... 48 ( I ) ( II ) xi DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Bảng 2.1 Phân tách các đoạn DNA trong gel theo kích thƣớc ...................................... 12 Bảng 2.2 Các loại chỉ thị phân tử sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền ............ 15 Bảng 3.1 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ................................................................. 30 Bảng 3.2 Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD .................................... 31 Bảng 3.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Mg2+ đến sản phẩm RAPD với primer OPAC10 ....................................................................................................... 32 Bảng 3.4 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ primer đến sản phẩm RAPD với primer OPAC10 ....................................................................................................... 33 Bảng 3.5 Thực hiện phản ứng RAPD với primer OPA10 và OPAC10. ........................ 33 Bảng 3.6 Thành phần hóa chất thích hợp sử dụng trong phản ứng RAPD .................... 33 Bảng 4.1 Bảng giá trị OD của 6 mẫu đƣớc (Lá non và lá già) thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 10 mẫu dùng để thực hiện phản ứng PCR với chỉ thị phân tử RAPD ..................................................................................................... 42 Bảng 4.2 Bảng giá trị OD của 10 mẫu đƣớc dùng để thực hiện phản ứng PCR với chỉ thị phân tử RAPD .................................................................................................... 43 Sơ đồ 4.1 Sơ đồ ly trích DNA từ lá đƣớc đôi theo quy trình 3 ...................................... 39 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Đƣớc đôi hay đƣớc (Rhizophora apiculata Blume) là cây có giá trị về kinh tế và môi trƣờng. Gỗ đƣớc đƣợc sử dụng rộng rãi trong xây dựng nhà cửa, đóng vật dụng, làm tà vẹt, chống lò, làm giấy và làm dụng cụ đánh bắt thủy sản. Than đƣớc cho nhiệt lƣợng cao và ít khói [13]. Vỏ có nhiều tanin đƣợc dùng trong công nghệ thuộc da, công nghệ dƣợc phẩm, kỹ nghệ in, nhuộm, làm keo dán. Rừng đƣớc sản sinh nhiều bã mùn làm nền tảng cho chuỗi thức ăn đặc trƣng của vùng ven biển, cửa sông. Các khu rừng đƣớc có vai trò vô cùng quan trọng vào việc duy trì cân bằng sinh thái làm cho khí hậu dịu mát, giảm biên độ nhiệt, giảm quá trình xói lở và ngăn chặn có hiệu quả tác động công phá của sóng biển. Mặt khác các khu rừng đƣớc là nơi cƣ trú của nhiều loài động vật hoang dã quý hiếm. [5] Trong chiến tranh chống Mỹ, rừng ngập măn Cần Giờ đã bị hủy diệt hoàn toàn bởi hàng chục ngàn tấn bom đạn, hàng triệu lít hóa chất khai quang đã rải xuống gây thiệt hại vô cùng nghiêm trọng về tài nguyên và môi trƣờng sinh thái. Từ năm 1978, Thành phố tiến hành khôi phục lại hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ với hầu hết giống đƣớc đƣợc thu mua ở Năm Căn (Cà Mau). Qua 22 năm khôi phục, tổ chức UNESCO sau khi kiểm tra công trình rừng ngập mặn Cần Giờ đã thống nhất công nhận là “Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ” vào ngày 21/01/2000 [5]. Trƣớc áp lực là khu dữ trữ sinh quyển thế giới cùng với những vai trò vô cùng quan trọng về kinh tế và môi trƣờng thì việc nghiên cứu đa dạng di truyền của cây đƣớc đôi là vô cùng cấp thiết. Trên cơ sở đó, các cơ quan chức năng sẽ có chiến lƣợc bảo vệ, quản lý và phát triển khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ theo hƣớng đa dạng sinh học. Rừng đƣớc trồng thuần rất nhạy cảm và dễ bị tổn hại khi có những tác động bên ngoài. Mặt khác chúng ta cũng có thể tìm ra các chỉ thỉ phân tử nhằm rút ngắn thời gian cho quá trình chọn giống, tạo giống phục vụ cho công tác trồng rừng, đảm bảo cho sự phát triển bền vững. 2 Đƣợc sự phân công của Bộ môn Công nghệ Sinh học - Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM, dƣới sự hƣớng dẫn của Thầy Bùi Minh Trí, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”. 1.2. Mục đích, yêu cầu, giới hạn của đề tài 1