Luận văn Hoàn thiện quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn e. coli dh5α

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  BÙI THỊ THANH TỊNH HOÀN THIỆN QUY TRÌNH BIẾN NẠP ĐOẠN DNA VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN E. coli DH5α LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  HOÀN THIỆN QUY TRÌNH BIẾN NẠP ĐOẠN DNA VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN E. coli DH5α Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN BÙI THỊ THANH TỊNH NIÊN KHÓA: 2002-2006 Thành phố Hồ Chí Minh 2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY,HCHC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY  COMPLETING PROTOCOL OF TRANSFORMATION DNA FRAGMENTS INTO E.coli DH5α BACTERIAL CELLS GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Dr. LE ĐINH ĐON BUI THI THANH TINH TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 i LỜI CẢM ƠN Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ. Cha mẹ, anh chị và ngƣời thân luôn là chỗ dựa vững chắc về tinh thần và vật chất cho con. Em vô cùng biết ơn thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hƣớng dẫn và truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian làm đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn đến: Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian học tập vừa qua. Ban giám đốc Trung tâm Phân Tích Hóa Sinh - Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh cùng toàn thể các anh chị tại Trung Tâm đã tạo điều kiện thuận lợi tối đa cũng nhƣ tận tình giúp đỡ em trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Anh Nguyễn Văn Lẫm đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình làm đề tài Các anh, chị và các bạn sinh viên thực tập tại phòng 105, 118 - khu Phƣợng Vỹ Trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi. Và cuối cùng là các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học K28 đã luôn đồng hành, chia sẻ vui buồn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm đề tài. TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006 Bùi Thị Thanh Tịnh ii TÓM TẮT BÙI THỊ THANH TỊNH, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, “Hoàn thiện quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α”, đƣợc thƣc hiện tại Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh và Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật-Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Giáo viên hƣớng dẫn: thầy Lê Đình Đôn. Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 02 năm 2006 đến tháng 08 năm 2006 với các nội dung: Hoàn thiện phƣơng pháp chuẩn bị tế bào khả nạp theo phƣơng pháp sử dụng hoá chất. Hoàn thiện quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α.. Hoàn thiện quy trình chiết tách plasmid, phản ứng cắt plasmid để kiểm tra. Thiết lập phản ứng phủ đầu bằng cho đoạn DNA từ phản ứng PCR và plasmid sau khi cắt. Thiết lập phản ứng chèn đoạn DNA vào plasmid pBluescript. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: Thiết lập đƣợc quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hoá chất, tế bào khả nạp có thể giữ ở -70oC với glycerol trong thời gian 2 tháng. Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E. coli DH5α. Chiết tách plasmid không lẫn tạp theo quy trình của Sambrook và cộng sự có sửa đổi. iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn ................................................................................................................... i Tóm tắt ........................................................................................................................ ii Mục lục ......................................................................................................................iii Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................ vii Danh sách các hình ................................................................................................... vii Danh sách các bảng ................................................................................................... ix PHẦN 1. MỞ ĐẦU .................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1 1.2 Mục tiêu của đề tài................................................................................................ 2 1.3 Nội dung thực hiện ............................................................................................... 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 3 2.1 Hiện tƣơng biến nạp ở vi khuẩn ........................................................................... 3 2.1.1 Giới thiệu về hiện tƣợng biến nạp ................................................................ 3 2.1.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiện tƣợng biến nạp ................................ 3 2.1.3 Cơ chế của hiện tƣợng biến nạp ................................................................... 5 2.1.4 Vai trò của hiện tƣợng biến nạp ................................................................... 5 2.1.5 Ứng dụng của hiện tƣợng biến nạp .............................................................. 5 2.2 Các vector và chủng chủ dùng trong biến nạp ..................................................... 6 2.2.1 Khái niệm chung các vector ......................................................................... 6 2.2.2 Plasmid ......................................................................................................... 7 2.2.2.1 Cấu trúc ............................................................................................... 7 2.2.2.2 Tính chất của plasmid .......................................................................... 8 2.2.2.3 Phân loại plasmid ................................................................................ 8 2.2.3 Phage ............................................................................................................ 9 2.2.4 Chủng chủ E.coli .......................................................................................... 9 2.3 Các ezyme dùng trong biến nạp ......................................................................... 10 2.3.1 Các enzym cắt giới hạn (RE) ..................................................................... 11 iv 2.3.1.1 Hiện tƣợng giới hạn ........................................................................... 11 2.3.1.2 Tên gọi các RE .................................................................................. 11 2.3.1.3 Các loại ezyme giới hạn .................................................................... 12 2.3.1.4 Các RE loại II .................................................................................... 12 2.3.2 Các enzym thông dụng khác ...................................................................... 15 2.3.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) ........................................................ 15 2.3.2.2 Taq polymerase ................................................................................. 15 2.3.2.3 Terminal transferase .......................................................................... 15 2.3.2.4 Các DNase ......................................................................................... 15 2.3.2.5 Các enzym khử phosphoril hóa ......................................................... 16 2.3.3 Các enzym nối DNA .................................................................................. 16 2.3.3.1 E.coli DNA ligase .............................................................................. 16 2.3.3.2 T4 DNA ligase ................................................................................... 16 2.4 Các phƣơng pháp sử dụng trong biến nạp .......................................................... 17 2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp ............................................................................. 17 2.4.1.1 Phƣơng pháp hóa biến nạp ................................................................ 17 2.4.1.2 Phƣơng pháp điện biến nạp ............................................................... 18 2.4.2 Phƣơng pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp ................... 18 2.4.3 Chiết tách DNA plasmid ............................................................................ 19 2. 5 Điện di (Electrophoresis) ................................................................................... 19 2.6 Các nghiên cứu về biến nạp ở trong nƣớc và ngoài nƣớc .................................. 20 2.6.1 Ngoài nƣớc ................................................................................................. 20 2.6.2 Trong nƣớc ................................................................................................. 21 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 22 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp ....................................... 22 3.2 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 22 3.2.1 Vi khuẩn E. coli DH5α............................................................................... 22 3.2.2 pBluescript II SK(+/-) ................................................................................ 22 3.2.3 Đoạn DNA ................................................................................................. 23 3.3 Dụng cụ và hóa chất ........................................................................................... 23 3.3.1 Dụng cụ thí nghiệm .................................................................................... 23 v 3.3.2 Các thiết bị máy móc ................................................................................. 23 3.3.3 Các loại môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn ...................................................... 23 3.3.4 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm ................................................... 24 3.3.5 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm ...................................................... 24 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 25 3.4.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ....................................... 25 3.4.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E.coli DH5α và kiểm tra .......................................................................... 26 3.4.3 Tăng sinh vi khuẩn E.coli DH5α trên môi trƣờng LB ............................... 27 3.4.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp ............................................................................. 27 3.4.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) ................................. 27 3.4.6 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra ............................... 29 3.4.6.1 Chiết tách plasmid ............................................................................. 29 3.4.6.2 Phản ứng cắt Plasmid (quy trình trích dẫn bởi Samuel S.M.Sun, 1994) ...................................... 32 3.4.6.3 Quy trình điện di trên gel agarose ..................................................... 32 3.4.7 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR .................................. 33 3.4.7.1 Phƣơng pháp tinh sạch DNA ............................................................. 33 3.4.7.2 Quy trình tinh sạch DNA từ gel ........................................................ 33 3.4.7.3 Quy trình tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR bằng cột GFX ................... 34 3.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR ............................... 35 3.4.9 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end) ................................................ 36 3.4.10 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa) ............ 37 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 38 4.1 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn .......................................... 38 4.2 Tách chiết DNA plasmid .................................................................................... 40 4.2.1 Tách chiết DNA plasmid ........................................................................... 40 vi 4.2.2 Tách chiết DNA plasmid bằng AurumTM Plasmid Mini Kit ..................... 42 4.3 Phản ứng cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn EcoRV ................................... 42 4.4 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid sau khi cắt bằng HindIII ................................ 44 4.4.1 Tinh sạch đoạn DNA.................................................................................. 44 4.4.2 Tinh sạch plasmid ...................................................................................... 45 4.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp ................................................................................ 46 4.6 Tách chiết plasmid tái tổ hợp ............................................................................. 46 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 48 5.1 Kết luận ............................................................................................................... 48 5.2 Kiến nghị ............................................................................................................ 49 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp base pair CFU Colony Form Unit DNA Deoxyribonucleic acid dNTP 3’- Deoxyribonucleoside- 5’- triphosphate ETDA Ethylenediamine tetraacetic acid IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside MCS Multiple cloning Site OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction RE Restriction Enzyme RNA Ribonucleic acid RFLP Restriction fragment length polymorphism SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus Kb kilobase dATP deoxyadenosine triphosphate dGTP deoxyguanosine triphosphate dCTP deoxycytidine triphosphate dTTP deoxythymidine triphosphate Tris- HCL (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride UV Ultraviolet (light) X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D- glactopyranoside viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cơ chế của hiện tƣợng biến nạp .................................................................. 6 Hình 2.2 Mô hình plasmid sử dụng cho cloning ........................................................ 8 Hình 2.3 Hình thái của Escherichia coli ................................................................. 10 Hình 2.4 Hiện tƣợng giới hạn ở vi khuẩn ................................................................. 13 Hình 3.1 Phản ứng tạo đầu bằng (blunt-end) cho đoạn DNA ................................. 35 Hình 4.1 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ở thể tích 10:1.5 ............................ 38 Hình 4.2 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ở thể tích 3:0.5 .............................. 39 Hình 4.3 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 1% (lần 1) ............................ 41 Hình 4.4 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 1% (lần 2) ......................... 41 Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm tách chiết DNA plasmid bằng Kit trên gel agarose 1% ................................................... 42 Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid bằng EcoRV trên gel 1% (lần 1) ................................................................. 42 Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 1% (lần 2) ........................ 43 Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng HindIII trên gel agarose 1% ................. 43 Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng HindIII trên gel agarose 1% .................... 43 Hình 4.10 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch đoạn DNA bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX ............................................. 45 Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch đoạn DNA bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX ....................................................... 45 Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch trên gel agarose1% ................................ 46 Hình 1 Sơ đồ cấu trúc pBluescript II SK (+/-) .................................................................... 55 Hình 2 Sơ đồ cấu trúc pBluescript II KS (+/-) ......................................................... 56 ix DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ BẢNG Sơ đồ 3.1 Vùng trình tự MCS của plasmid pBluescript II SK (+/-) ......................... 23 Sơ đồ 3.2 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E. Coli ........................ 25 Sơ đồ 3.3 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E. coli DH5α và kiểm tra ...................................................................... 26 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay với sự phát triển nhƣ vũ bão của khoa học công nghệ, đặc biệt trong đó công nghệ sinh học là lĩnh vực đã đạt đƣợc những thành quả quan trọng và hứa hẹn đem lại những lợi ích vô cùng to lớn trong tƣơng lai cho con ngƣời. Các nghiên cứu hiện nay đang tập trung vào việc chuyển gen để tăng năng suất cây trồng, tạo ra những giống mới có tính năng vƣợt trội. Tuy nhiên, việc nghiên cứu và phân tích ở mức phân tử DNA thƣờng gặp khó khăn lớn về số lƣợng và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm. Để giải quyết vấn đề này, khi nghiên cứu trình tự của một đoạn DNA về sự hoạt động của gen, sự biểu hiện ra protein và cấu trúc của protein, ngƣời ta chú trọng tới việc phân lập và thu nhận đoạn DNA quan tâm và tiến hành tạo ra bản sao với số lƣợng lớn để tiến hành nghiên cứu. Mặc khác, bộ gen của sinh vật thì rất lớn và phức tạp mà trình tự gen chúng ta quan tâm thƣờng chỉ có một hay hai bản sao trong mỗi tế bào. Vì vậy chúng ta không thể sử dụng các phƣơng pháp sinh hoá thông thƣờng để phân lập gen mục tiêu trên bộ gen. Những vấn đề trên có thể đƣợc giải quyết khi ta sử dụng các cấu trúc DNA có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ để làm phƣơng tiện mang gen, biến nạp gen, tăng bản sao của gen, biểu hiện gen hay các thao tác khác trên gen. Các cấu trúc DNA dùng cho mục tiêu này gọi là vector. Việc biến nạp DNA tái tổ hợp vào một tế bào thích hợp sẽ cho phép vector có khả năng tồn tại ổn định và sao chép độc lập với bộ gen của tế bào. Tế bào có khả năng tiếp nhận vector tái tổ hợp gọi là tế bào chủ. Tế bào chủ thƣờng đƣợc chọn lọc và cải tạo để tạo thành các chủng chủ có kiểu gen và các đặc tính thuận lợi cho các thao tác trên gen. Chủng chủ mang vector tái tổ hợp gọi là dòng tái tổ hợp. Dòng tái tổ hợp đƣợc phân lập để lƣu trữ DNA tái tổ hợp hoặc dùng cho các thao tác trên gen. Toàn bộ quá trình trên gọi là tạo dòng DNA hay DNA cloning. Mục đích của tạo dòng nhằm thu đƣợc số lƣợng lớn và tinh khiết các trình tự DNA hay thu nhận một dòng tế bào có khả năng biểu hiện gen mục tiêu. Xuất phát từ những khó khăn trong thực tế nghiên cứu và trên nền tảng kiến thức về kĩ thuật di truyền đƣợc tiếp thu trong quá trình học tập, chúng tôi tiến hành 2 thực hiện đề tài “ Hoàn thiện quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α” phát triển từ đề tài: “Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α” do Phạm Duy và Huỳnh Văn Thái, trƣờng đại học Nông Lâm TPHCM thực hiện. 1.2 Mục tiêu của đề tài Hoàn thiện quy trình chèn một đoạn DNA bất kỳ vào plasmid pBluescript và chuyển plasmid tái tổ hợp này vào tế bào kí chủ E. coli DH5α. 1.3 Nội dung thực hiện - Nuôi cấy tế bào vi khuẩn E. coli DH5α. - Thiết lập qui trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hóa chất. - Thiết lập phƣơng pháp biến nạp plasmid DNA chƣa tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E.