Luận văn Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào tử vi khuẩn bacillus subtilis

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  NGUYỄN DUY KHÁNH KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ SINH BÀO TỬ VI KHUẨN Bacillus subtilis LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ SINH BÀO TỬ VI KHUẨN Bacillus subtilis LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN DUY KHÁNH KHÓA: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  EXAMINE CULTURE CONDITION AND SPORULATION OF Bacillus subtilis GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Dr.NGUYEN NGOC HAI NGUYEN DUY KHANH TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 i LỜI CẢM ƠN Với tất cả lòng kính trọng, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trường. Em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hướng dẫn dạy dỗ, động viên, quan tâm, ủng hộ em hoàn thành khoá luận. Em xin chân thành cám ơn TS. Lê Anh Phụng, BSTY. Nguyễn Thị Kim Loan đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình hoàn thành khoá luận. Em xin chân thành cảm ơn Phòng vi sinh, Khoa Chăn nuôi – Thú Y đã cho phép và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu tại phòng. Tôi xin cảm ơn các bạn lớp CNSH 28 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Sinh viên thực hiện Nguyễn Duy Khánh ii TÓM TẮT NGUYỄN DUY KHÁNH, ĐH Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2006. “KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ SINH BÀO TỬ VI KHUẨN Bacillus subtilis”. Hội đồng hướng dẫn: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Việt nam là một nước nông nghiệp có nghành chăn nuôi rất phát triển và có đóng góp rất lớn vào sự phát triển kinh tế của đất nước. Vì vậy, vấn đề nâng cao năng suất, chất lượng sản phẩm và cải thiện môi trường chăn nuôi rất được quan tâm ở nước ta hiện nay. Xuất phát từ vấn đề này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtils, tìm hiểu điều kiện nuôi cấy thích hợp và xử lí bào tử để sản xuất chế phẩm sinh học nhằm cung cấp những thông tin để chọn lựa những điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis thích hợp, từ đó sản xuất chế phẩm sinh học cung cấp cho nghành chăn nuôi. Qua quá trình thực hiện đề tài chúng tôi đã có những ghi nhận sau: Khảo sát ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ) thì chế độ nuôi cấy lắc cho số lượng vi khuẩn cao hơn. Khảo sát ảnh hưởng của 4 loại môi trường khác nhau (TSB, TSB + 1% glucose, TSB + 1% cao nấm men, TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men) thì môi trường TSB cho số lượng vi khuẩn thấp nhất, 3 môi trường còn lại là những môi trường phù hợp cho Bacillus subtilis phát triển. Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường (pH 7 và 7,5), thời gian (24,36 và 48 giờ) và nhiệt độ nuôi cấy (nhiệt độ phòng, 37oC) thì ở pH 7, thời gian 48 giờ và nhiệt độ nuôi cấy 37oC cho số lượng vi khuẩn lớn nhất. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ (50, 70), pH (6, 9) và thời gian xử lí (3, 5 và 7 giờ) đến sự hình thành bào tử thì khi xử lí ở các nhiệt độ và pH này có sự ảnh hưởng đến quá trình hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis. iii MỤC LỤC Trang tựa Lời cảm tạ ........................................................................................................... i Tóm tắt ............................................................................................................... ii Mục lục ............................................................................................................. iii Danh sách chữ viết tắt ...................................................................................... iv Danh sách các hình ............................................................................................ v Danh sách các bảng .......................................................................................... vi Phần 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ......................................................................................... 1 1.2. Mục đích – Yêu cầu ........................................................................... 1 Phần 2. TỔNG QUAN ..................................................................................... 2 2.1. Đại cương về vi khuẩn Bacilus subtilis ........................................... 2 2.1.1. Lịch sử phát triển .................................................................... 2 2.1.2. Đặc điểm phân loại ................................................................. 2 2.1.3. Đặc điểm phân bố ................................................................... 2 2.1.4. Đặc điểm hình thái .................................................................. 2 2.1.5. Đặc điểm nuôi cấy ................................................................... 3 2.1.6. Đặc điểm sinh hoá ................................................................... 3 2.1.7. Cấu trúc kháng nguyên ........................................................... 4 2.1.8. Tính chất đối kháng của B. subtilis với một số vi sinh vật gây bệnh ....................................................................................... 4 2.2. Bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis............................................... 5 2.2.1. Khả năng sinh bào tử................................................................ 6 2.2.2. Cấu tạo của bào tử .................................................................... 7 2.2.3. Thành phần hoá học của bào tử ................................................ 8 2.2.4. Sự nảy mầm của bào tử ............................................................ 9 2.2.5. Sức đề kháng của bào tử .......................................................... 9 2.3. Hệ vi sinh vật đường ruột và sự loạn khuẩn ................................... 10 2.3.1. Hệ vi sinh vật đường ruột ....................................................... 10 2.3.2. Vai trò của hệ vi sinh vật đường ruột ...................................... 11 iv 2.3.3. Sự loạn khuẩn ......................................................................... 12 2.4. Giới thiệu chung về probiotic ......................................................... 13 2.4.1. Định nghĩa .............................................................................. 13 2.4.2. Chức năng sinh học của probiotic .......................................... 13 2.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm chứa vi khuẩn Bacillus subtilis .............................................................. 14 PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 16 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ............................................ 16 3.2. Vật liệu thí nghiệm .......................................................................... 16 3.2.1. Giống vi khuẩn ....................................................................... 16 3.2.2. Môi trường nuôi cấy ............................................................... 16 3.2.3. Hoá chất .................................................................................. 16 3.2.4. Thiết bị và dụng cụ .................................................................. 16 3.3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................... 17 3.4. Phương pháp thực hiện đề tài ......................................................... 17 3.4.1. Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis .................. 17 3.4.2. Các thí nghiệm về Bacillus subtilis ........................................ 17 3.4.2.1. Ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy (nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy lắc) và thời gian nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn ............................. 17 3.4.2.2. Khảo sát môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển tạo sinh khối .................... 18 3.4.2.3. Khảo sát pH môi trường thích hợp cho nuôi cấy vi khuẩn Bacilus subtilis .......................................................... 19 3.4.3. Các thí nghiệm về bào tử Bacillus subtilis ............................. 20 3.4.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis ........................................................ 20 3.4.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis ....................................................... 21 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 22 4.1. Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis .................................... 22 4.1.1. Đặc điểm hình thái của Bacillus sutilis .......................................... 22 v 4.1.2. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus subtilis ......................... 22 4.1.3. Quan sát dăc điểm nuôi cấy Bacillus subtilis trên môi trường canh23 4.1.4. Tính chất sinh hoá ........................................................................... 23 4.2. Các thí nghiệm về Bacillus subtíils ......................................................... 25 4.2.1. Khảo sát chế độ (nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy lắc) và thời gian nuôi cấy thích hợp ................................................................................. 25 4.2.2. Khảo sát môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp .................... 27 4.2.3. Khảo sát pH môi trường nuôi cấy vi khuẩn thích hợp .................... 29 4.2.4. Các thí nghiệm về bào tử Bacillus subtilis ..................................... 30 4.2.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử của Bacillus subtilis ......................................................................... 30 4.2.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis .......................................................... 32 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 34 5.1. Kết luận.................................................................................................... 34 5.2. Đề nghị .................................................................................................... 34 Phần 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................. 36 Phần 7. PHỤ LỤC ........................................................................................ 38 vi DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis .................................................. 3 Hình 2.2. Quá trình tạo bào tử ........................................................................... 6 Hình 2.3. Cấu tạo bào tử Bacillus sutilis ........................................................... 7 Hình 4.1 Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần ..................................................................... 22 Hình 4.2. Đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus subtilis trên môi trường TSA ..... 23 Hình 4.3. Khuẩn lạc Bacillus subtilis trên môi trường thạch tinh bột ............. 23 Hình 4.4. Phản ứng lên men một số loại đường của vi khuẩn Bacillus subtilis................................................................ 25 vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1. Các phản ứng sinh hoá của Bacillus subtilis ..................................... 4 Bảng 2.2. Sự khác nhau giữa bào tử và tế bào sinh dưỡng của Bacillus subtilis 8 Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm 1 .......................................................................... 18 Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm 2 .......................................................................... 19 Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm 3 .......................................................................... 20 Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm 4 .......................................................................... 21 Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm 5 .......................................................................... 21 Bảng 4.1. Ảnh hưởng của thời gian và chế độ nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis................................................................... 25 Bảng 4.2. Ảnh hưởng của môi trường và thời gian nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis................................................................... 27 Bảng 43. Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis .................................................................... 29 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis .................................................................... 30 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis ................................................................................... 32 viii DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1. Ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy và thời gian đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis.............................................................. 26 Biểu đồ 4.2. Ảnh hưởng của thời gian và môi trường nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis............................................................. 28 Biểu đồ 4.3. Ảnh hưởng pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis............................................................ 29 Biểu đồ 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis............................................................ 31 Biểu đồ 4.5. Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis .......................................................................... 33 1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Hiện nay, các loại chế phẩm sinh học từ vi sinh vật đã và đang được sử dụng ngày càng phổ biến. Đặc biệt là các chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus subtilis. Nước ta là một nước nông nghiệp, ngành chăn nuôi rất phát triển. Với mục đích tăng năng suất chất lượng sản phẩm chăn nuôi, bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng, bảo vệ môi trường sống không bị ô nhiễm bởi các loại hoá chất độc hại và đặc biệt là nhằm hạn chế dần việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi, chế phẩm sinh học là một giải pháp tối ưu để thực hiện mục đích này. Vì vậy, các nhà chăn nuôi đã rất chú ý đến vấn đề sử dụng chế phẩm sinh học. Chế phẩm sinh học chứa các vi sinh vật sống có lợi, người ta chọn lọc các vi sinh vật có lợi có tính đối kháng cao để đưa vào đường ruột tạo sự cân bằng có lợi cho hệ vi sinh vật đường ruột, khôi phục lại hoạt động bình thường, ức chế vi sinh vật có hại cho vật nuôi. Ngoài ra, chế phẩm sinh học còn cải thiện lượng thức ăn ăn vào và khả năng tiêu hoá, cung cấp chất dinh dưỡng… Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis”. 1.2. Mục đích – Yêu cầu  Mục đích Tìm hiểu điều kiện: nhiệt độ, thời gian, pH, môi trường nuôi cấy thích hợp và nhiệt độ, pH xử lý bào tử để ứng dụng sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học.  Yêu cầu  Khảo sát đặc điểm của Bacillus subtilis: về hình thái khuẩn lạc, tế bào vi khuẩn…  Tìm điều kiện: nhiệt độ, pH, môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp.  Tìm điều kiên: nhiệt độ, pH xử lý tạo bào tử. 2 Phần 2. TỔNG QUAN 2.1. Đại cƣơng về vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.1. Lịch sử phát triển Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi Tổ chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu, chủ yếu được sử dụng để phòng bệnh lị cho các bệnh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Việc sử dụng để điều trị bệnh phải đợi đến những năm 1949 - 1957 khi Henry, Albot và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Từ đó, “subtilistherapie” có nghĩa là thuốc subtilin ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hoá. Ngày nay, vi khuẩn Bacillus subtilis trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi, y học, thực phẩm…. 2.1.2. Đặc điểm phân loại Theo khoá phân loại của Bergey, vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis 2.1.3. Đặc điểm phân bố Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc ở đường ruột, chúng được phân bố hầu hết trong tự nhiên như: cỏ khô, bụi, đất nước…. Phần lớn chúng tồn tại ở trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở sa mạc, đất hoang thì Bacillus subtilis rất hiếm. Nước và bùn ở cửa sông cũng như nước biển có sự tồn tại của bào tử và tế bào sinh dưỡng Bacillus subtilis (Vũ Thị Thứ, 1996). 2.1.4. Đặc điểm hình thái Bacillus subtilis là vi khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, G+, kích thước 0,5 - 0,8 µm x 1,8 – 3 µm, đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động, 8 - 12 lông. Sinh bào tử nhỏ hơn vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8 µm. 3 Phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ…(Tô Minh Châu, 2000). Hình 2.1. Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis (www.microscopyconsulting.com/ Gallery/pages/Ba..._) 2.1.5. Đặc điểm nuôi cấy Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu 37oC. Nhu cầu O2: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển trong môi trường thiếu oxy. Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0 – 7,4. Môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc có dạng hình tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm sẩm màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đường kính 3 - 5mm. Sau 1- 4 ngày bề mặt nhăn nheo màu hơi sẩm. Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa gợn sóng. Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan đều khi lắc lên. Dinh dưỡng cần các nguyên tố C, H, O, N và các nguyên tố khác. 2.1.6. Đặc điểm sinh hoá Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose, arabinosse. Indol (-), nitrate (-), VP (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein (+), citrate (+), di động (+), hiếu khí (+). Dung huyết: một số dòng gây dung huyết ở dạng trên thạch máu ngựa và thỏ do tác động của hemolysine. 4 Bảng 2.1. Các phản ứng sinh hoá của Bacillus subtilis Phản ứng sinh hoá Kết quả Hoạt tính catalase + Sinh Indol - MR + VP + Sử dụng citrate + Khử Nitrate + Tan chảy Gelatin + Di động + Phân giải tinh bột + Arabinose + Xylose + Saccharose + Mannitol + Glucose + Lactose - Maltose + (Theo Holt, 1992) 2.1.7. Cấu trúc kháng nguyên Bacillus subtilis có kháng nguyên H và O, cấu trúc kháng nguyên dạng D và L - acid glutamic. Sản sinh kháng sinh subtilin và bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn G+ và G-. Bệnh học: đa số chủng Bacillus subtilis không gây bệnh. 2.1.8. Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với một số vi sinh vật gây bệnh Do Bacillus subtilis là vi khuẩn bắt buộc đường ruột nên ngoài khả năng chịu đựng được acid dạ dày , các chất dịch tiêu hoá trong đường ruột. Chúng còn có khả năng đấu tranh lại với các vi sinh vật gây bệnh ở đường ruột. 5  Với các vi sinh vật gây bệnh Môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với mộ