Luận văn Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chất hoạt hóa plasminogen mô của người trong vi khuẩn echerichia coli

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -------------------------------------------- HOÀNG PHÚ HIỆP NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHẤT HOẠT HÓA PLASMINOGEN MÔ CỦA NGƯỜI TRONG VI KHUẨN Echerichia coli LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên – 2008 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -------------------------------------------- HOÀNG PHÚ HIỆP NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHẤT HOẠT HÓA PLASMINOGEN MÔ CỦA NGƯỜI TRONG VI KHUẨN Echerichia coli Chuyên ngành : Di truyền học Mã số : 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. LÊ THỊ THU HIỀN Thái Nguyên - 2008 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC Trang Bảng viết tắt ............................................................................................................. 1 Danh mục các hình ................................................................................................... 2 Mở đầu .................................................................................................................... 3 Chương 1: Tổng quan tài liệu ............................................................................... 5 1.1. Bệnh tim mạch ............................................................................................. 5 1.2. Chất hoạt hóa plasminogen.......................................................................... 5 1.3. Chất hoạt hóa plasminogen mô người ......................................................... 9 1.4. Vai trò của chất hoạt hóa plasminogen mô trong quá trình làm tan máu đông ............................................................................................. 12 1.5. Nghiên cứu ứng dụng sản xuất chất hoạt hóa plasminogen mô người ......................................................................................................... 14 1.6. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ............................................................... 18 Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ................................................ 19 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị ........................................................................ 19 2.1.1. Vật liệu ..................................................................................................... 19 2.1.2. Hóa chất .................................................................................................... 20 2.1.3. Thiết bị ...................................................................................................... 20 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 20 2.2.1. Điện di DNA trên gel agarose .................................................................. 20 2.2.2. Điện di protein trên gel polyacrylamide ................................................... 21 2.2.3. Phản ứng dây chuyền polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) ........................................................................................ 22 2.2.4. Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế ............................................................ 23 2.2.5. Ghép nối DNA .......................................................................................... 23 2.2.6. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt .............................................................................. 24 2.2.6.1. Chuẩn bị tế bào khả biến E. coli ............................................................ 24 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.2.6.2. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli ............................................. 24 2.2.7. Tách chiết và tinh sạch DNA plasmid ...................................................... 25 2.2.8. Xác định trình tự gen ................................................................................ 26 2.2.9. Biểu hiện protein trong vi khuẩn E. coli ................................................... 27 Chương 3: Kết quả và thảo luận ........................................................................... 28 3.1. Thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa h-tPA................................. 28 3.1.1. Nhân đoạn cDNA mã hóa h-tPA bằng kỹ thuật PCR ............................... 28 3.1.2. Ghép nối cDNA mã hóa h-tPA vào vector pGEX6p1 và pET21a(+) ..................................................................................................... 30 3.1.2.1. Xử lý sản phẩm PCR cDNA mã hóa h-tPA bằng enzyme hạn chế .......................................................................................................... 30 3.1.2.2. Xử lý vector pGEX6p1 và pET21a(+) bằng enzyme hạn chế ..................... 31 3.1.2.3. Ghép nối cDNA mã hóa h-tPA vào vector pGEX6p1 và pET21a(+) ..................................................................................................... 32 3.1.3. Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hóa h-tPA ................. 32 3.1.3.1. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt ................................................................................................ 32 3.1.3.2. Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hoá h-tPA ............................................................................................................. 33 3.1.4. Xác định và phân tích trình tự cDNA mã hóa h-tPA ............................... 37 3.2. Biểu hiện gen ............................................................................................... 43 3.2.1. Tổng hợp protein h-tPA tái tổ hợp ........................................................... 43 3.2.2. Kiểm tra protein bằng phương pháp điện di trên SDS-PAGE ................. 43 Kết luận và đề nghị ................................................................................................ 47 Tài liệu tham khảo ................................................................................................. 48 Phụ lục ..................................................................................................................... 54 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 BẢNG VIẾT TẮT Amp Ampicillin kb Kilo base Bp Cặp bazơ (Base pair) LB Luria – Bertani CIAP Calf Intestinal Alkaline Phosphatase P Vùng serine protease (Serine protease) ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate PA Chất hoạt hóa plasmingen (Plasminogen activator) DNA Deoxyribonucleic acid PAI Chất ức chế chất hoạt hóa plasminogen (Plasminogen activator inhibitor) dNTP Deoxynucleoside triphosphate PCR Phản ứng dây chuyền polymerase (Polymerase Chain Reaction) E. coli Escherichia coli rDNA DNA tái tổ hợp (Recombinant DNA) EDTA Ethylene Diamine Tetra- acetic Acid RNA Ribonucleic acid EGF Vùng nhân tố sinh trưởng biểu bì (Epidermal growth factor region) RNase Ribonuclease EtBr Ethidium bromide scuPA Chất hoạt hóa urokinase sợi đơn (single chain urokinase - type plasminogen activator) F Vùng “ngón tay” (Finger) SDS Sodium Dodecyl Sulphate GST Glutathione S-transferase SK Streptokiase h- tPA Chất hoạt hóa plasminogen mô người (Human tissue plasminogen activator) TAE Tris-acetate- EDTA IPTG Isopropyl b-D thiogalactoside tPA Chất hoạt hóa plasminogen mô (Tissue - type plasminogen activator) K1 Vùng Kringle 1 uPA Chất hoạt hóa urokinase (Urokinase - type plasminogen activator) K2 Vùng Kringle 2 v/p Vòng/ phút Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Cấu trúc của tPA và uPA 7 1.2 Các vùng của tPA 10 1.3 Cấu trúc h-tPA 11 1.4 Quá trình phân hủy huyết khối 13 1.5 Con đường phân giải tơ máu (Fibrin) 13 2.1 Bản đồ vector pET21a(+) và pGEX6p1 19 3.1 Sản phẩm PCR nhân cDNA mã hóa h-tPA 30 3.2 Kết quả xử lý cDNA mã hóa h-tPA và các vector biểu hiện bằng enzyme hạn chế 32 3.3 Chọn dòng pGEX6p1 mang cDNA mã hóa h-tPA (pGEX6p1/h-tPA) 34 3.4 Chọn dòng pET21a(+) mang cDNA mã hóa h-tPA (pET21a(+)/h-tPA) 35 3.5 Kiểm tra các vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA bằng enzyme hạn chế 36 3.6 Kiểm tra các vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA bằng kỹ thuật PCR 37 3.7 So sánh trình tự nucleotide của h-tPA trong pGEX6p1/h- tPA và pET21a(+)/h-tPA với NM_000930 42 3.8 Kiểm tra kiểm tra protein h-tPA trong pGEX6p1/h-tPA p3 44 3.9 Kiểm tra protein h-tPA trong pET21a(+)/h-tPA p1 45 Formatted: Font: Bold Formatted: Font: Bold Formatted: Font: Bold Formatted: Font: Bold Formatted: Font: Bold Formatted: Font: Bold Formatted: Font: Bold Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt Formatted: Font: Bold Formatted: Font: Bold Formatted: Font: Bold Formatted: Font: Bold Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Bắt đầu từ những năm đầu thập niên 1970, các thành tựu về sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền giúp chúng ta có thể hiểu rõ bản chất phân tử của các bệnh xuất hiện trên động vật, thực vật và đặc biệt là trên người. Giáo sư Paul Berg thuộc trường đại học Stanford (Hoa Kỳ), người được nhận giải Nobel hóa học năm 1980, là người đầu tiên tạo ra DNA tái tổ hợp (recombinant DNA- rDNA) vào năm 1972. Kể từ đó đến nay, công nghệ rDNA và những ứng dụng trong ngành công nghiệp dược phẩm đã thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ của các công ty công nghệ sinh học và các dược phẩm tạo ra nhờ công nghệ rDNA (dược phẩm sinh học) nhằm phục vụ và bảo vệ sức khỏe con người [44]. Trong lĩnh vực nghiên cứu tạo các loại dược phẩm làm tan các cục máu đông để điều trị huyết khối và các rối loạn huyết khối tắc mạch, cuối những năm 1980, thông qua công nghệ rDNA, các nhà khoa học đã nghiên cứu và tạo ra một số loại dược phẩm sinh học là các protein tái tổ hợp có khả năng làm tan các cục máu đông “đặc hiệu”. Một trong những protein đó, chất hoạt hóa plasminogen mô của người (human tissue plasminogen activator- h-tPA) đã được nhiều nhóm tác giả trên thế giới nghiên cứu và đưa vào ứng dụng trong y dược. DNA bổ sung (complementary DNA- cDNA) của gen mã hóa h-tPA đã được phân lập, tạo dòng, biểu hiện ở nhiều loại tế bào như tế bào trứng chuột đồng (Chinese hamster ovary- CHO), tế bào thận chuột chưa trưởng thành... và sản xuất dưới dạng dược phẩm tái tổ hợp [39]. Ở Việt Nam, nghiên cứu tạo các dược phẩm bằng công nghệ sinh học đang bắt đầu được tiếp cận. Việc nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chất hoạt hóa plasminogen mô trong vi khuẩn Escherichia coli tiến tới sản xuất dược phẩm sinh học phục vụ bảo vệ sức khỏe con người có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. Xuất phát từ các lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chất hoạt hóa plasminogen mô của ngƣời trong vi khuẩn Escherichia coli”. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 2. Mục tiêu nghiên cứu Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử và công nghệ rDNA để thiết kế vector và biểu hiện gen mã hóa h-tPA trong vi khuẩn E. coli nhằm tiến tới sản xuất protein h-tPA tái tổ hợp có giá trị sử dụng trong y dược. 3. Nội dung nghiên cứu - Tạo dòng gen mã hóa h-tPA trong các vector biểu hiện thích hợp. - Biểu hiện gen mã hóa h-tPA trong vi khuẩn E. coli. 4. Những điểm mới của đề tài Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học để tiếp tục nghiên cứu nhằm tiến tới ứng dụng sản xuất chất hoạt hóa plasminogen mô của người - một dược phẩm công nghệ sinh học có giá trị hoàn toàn chưa được nghiên cứu và sản xuất ở nước ta. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Bệnh tim mạch Bệnh tim mạch là các bệnh liên quan đến những rối loạn ảnh hưởng tới tim và các mạch máu bao gồm bệnh mạch vành, bệnh mạch máu não, bệnh mạch máu ngoại biên và tăng huyết áp. Bệnh tim mạch là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên thế giới. Mỗi năm, bệnh tim mạch là nguyên nhân gây tử vong cho 17,5 triệu người và dự đoán sẽ có khoảng 25 triệu người bị bệnh tim mạch tử vong vào năm 2020. Bệnh tim mạch cũng được dự đoán sẽ là nguyên nhân lớn nhất gây tàn phế cho người vào năm 2020. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), cứ mỗi 2 giây có 1 người chết vì bệnh tim mạch. Cứ mỗi 5 giây thì có 1 trường hợp nhồi máu cơ tim và mỗi 6 giây thì có một trường hợp đột quỵ. Hiện có đến 300 yếu tố nguy cơ kết hợp với bệnh mạch vành và đột quỵ sẽ dẫn đến bệnh tim mạch [60]. Một trong những nguyên nhân sinh lý quan trọng dẫn tới các bệnh tim mạch là do thành mạch bị tổn thương, dẫn tới hình thành huyết khối bên trong mạch máu. Do vậy, điều trị huyết khối là một trong những phương pháp hiệu quả giúp làm giảm nguy cơ tử vong và các biến chứng ở các bệnh nhân mắc bệnh tim mạch, đặc biệt là ở các bệnh nhân đột quỵ và nghẽn mạch máu. Trong phác đồ điều trị huyết khối và bệnh tim mạch, chất hoạt hóa plasminogen (plasminogen activator, PA) đóng vai trò quan trọng và được xem là thuốc điều trị có hiệu quả cao. Chất hoạt hóa plasmminogen có vai trò biến đổi plasminogen thành plasmin- là chất phân hủy huyết khối (thrombolytic). Plasmin sau đó sẽ hòa tan dần fibrin và fibrinogen từ đó làm tan huyết khối. Bằng công nghệ gen, các PA đã được nghiên cứu và đưa vào sản xuất nhằm tạo ra thuốc đặc hiệu trong điều trị huyết khối và bệnh tim mạch. Tuy nhiên, do quy trình sản xuất phức tạp nên giá thành của sản phẩm này khá cao. 1.2. Chất hoạt hóa plasminogen Chất hoạt hóa plasminogen có tác dụng quan trọng trong quá trình làm tan khối máu đông. Chất hoạt hóa plasminogen là nhóm enzyme duy nhất chuyển chất Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 xúc tác plasminogen từ dạng bất hoạt sang dạng hoạt động - plasmin. Vì đặc tính này, một vài loại plasminogen khác nhau đã được sử dụng nhằm điều trị các chứng bệnh tim mạch. Chất hoạt hóa plasminogen gồm bốn nhóm chính. Một nhóm là chất hoạt hóa plasminogen urokinase (urokinase- type plasminogen activator, uPA). Chất này có liên quan đến kháng thể urokinase và không kết hợp với tơ máu. Bởi vậy chất hoạt hóa này được cho rằng có thể có liên quan đến hoạt hóa plasminogen trong pha lỏng của huyết thanh. Loại thứ hai là chất hoạt hóa plasminogen mô (tissue-type plasminogen activator, tPA), có khả năng tương tác với kháng thể chất hoạt hóa mô và kết hợp với tơ máu. Loại thứ ba là streptokinase (SK). SK hoạt hóa plasminogen bằng cơ chế trực tiếp. Cuối cùng là enzyme phân hủy tơ máu (fibrinolysis) được giải phóng nhanh khi huyết tương bị tổn thương và giải phóng một số chất hoạt hóa vào thành mạch [18], [47]. Chất hoạt hóa plasminogen urokinase là sản phẩm chính của thận, tồn tại dưới dạng phân tử chất hoạt hóa urokinase sợi đơn (single chain urokinase - type plasminogen activator - scuPA) không hoạt động. Chất hoạt hóa plasminogen urokinase được phân lập có hai dạng: dạng có trọng lượng phân tử cao (khối lượng 54,7kDa) và dạng có trọng lượng phân tử thấp (khối lượng 31,5kDa) [18]. Chúng có hai chức năng: chức năng chính là tham gia trong phân giải protein mô liên kết và chức năng thứ hai được biết đến với vai trò điều khiển của tPA như chất hoạt động sinh lý trong máu [30]. Sự hoạt hóa của scuPA do sự phân hủy xung quanh bởi plasmin trong cấu trúc hai sợi dẫn tới việc tăng hoạt tính của plasminogen lên. Thông qua quá trình này, một số lượng nhỏ của plasmin có thể xúc tác sản phẩm uPA hoạt động, ảnh hưởng tới hình dạng của nhiều plasmin. Chất hoạt hóa plasminogen urokinase có thể chỉ hoạt hóa plasminogen với sự có mặt của fibrin. Tuy nhiên, nó sẽ không kết hợp với fibrin và sẽ không phân hủy fibrin. Trong huyết tương người, nồng độ kháng thể uPA từ 2 đến 7ng/ml. Giá trị cao nhất thường được tìm thấy trong bệnh nhân gan mãn tính và ung thư gan [9]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 Gen mã hóa tPA và protein này đã được nhiều nhóm tác giả trên thế giới nghiên cứu và đưa vào ứng dụng trong y- dược [31], [40]. Những nghiên cứu gần đây cho thấy tPA còn đóng vai trò quan trọng trong hệ thống thần kinh [49], [56]. Ở người và các động vật khác, tPA đóng vai trò quan trọng trong hệ thống tiêu hủy fibrin [53], [54]. Đối với các trường hợp mắc bệnh huyết khối, sau khi tPA được đưa vào cơ thể, dưới tác dụng của tPA, plasmin sẽ được tạo ra chủ yếu tại vị trí hình thành huyết khối, nên tránh được tình trạng phân hủy ở những vùng khác trong cơ thể, tuy nhiên hoạt tính chọn lọc này chỉ là tương đối [21]. Streptokinase là một chất hoạt hóa plasminogen ngoại sinh có khối lượng 47kDa. Hiện nay, Streptokinase được thu chủ yếu từ nuôi cấy vi khuẩn Streptococci B-hemolytic. Streptokinase có chức năng tương tự với plasminogen ở người. Chức năng chính là phụ thêm vào thay đổi cấu trúc trong phân tử plasminogen, làm trung tâm hoạt động của phân tử plasminogen này hoạt động để hoạt hóa phân tử plasminogen thứ hai bằng cách cắt phân tử plasminogen thứ hai tại vị trí Agr560- Hình 1.1. Cấu trúc của tPA và uPA [9] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 Val561. Tiếp theo, plasminogen trong hỗn hợp Streptokinase- plasminogen sẽ được chuyển thành plasmin, cuối cùng, hỗn hợp tách nhau hình thành dạng Streptokinase và plasmin tự do. Cả hai loại của hỗn hợp Streptokinase đều ảnh hưởng ngang nhau tới sự hoạt hóa của plasminogen: Streptokinase + plasminogen → Streptokinase-plasminogen Streptokinase- plasminogen + plasminogen → streptokinase- plasmin + plasmin Streptokinase- plasmin + plasminogen → streptokinase- plasmin + plasmin Streptokinase là một chất hoạt hóa plasminigen không đặc hiệu. Việc dùng Streptokinase dẫn tới tình trạng phân hủy hệ thống. Một tác dụng không mong muốn của việc dùng Streptokinase là gây cảm ứng việc đáp ứng của chất trợ đông thông qua việc tăng giải phóng thrombin. Mặc dù đáp ứng trợ đông xảy ra với tất cả các thuốc tan huyết khối, nhưng các số liệu in vitro cho thấy tác dụng này lớn nhất với Streptokinase. Tương ứng với các nhóm hoạt hóa plasminogen, hiện nay trên thị trường có 5 loại thuốc tan huyết khối được phép lưu hành: Alteplase tương ứng với chất hoạt hóa plasminogen mô, có nguồn gốc từ DNA tái tổ hợp do hãng Genentech sản xuất [8]; Streptase tương ứng với streptokinase có nguồn gốc từ cầu khuẩn tan máu beta được sản xuất bởi hãng Aventis Pharma; Urokinase biết đến với tên là Abbokinase được sản xuất bởi hãng ImaRx Therapeutics, urokinase có nguồn gốc từ chất chiết tế bào thận người; phức chất hoạt hóa Streptokinase plasminogen anisoylat hóa (APSAC); và Tenecteplase, một dạng biến đổi của chất hóa hóa plasminogen mô người gắn với fibrin và làm biến đổi plasminogen thành plasmin. Tất cả các dạng thuốc này được dùng để điều trị nhồi máu cơ tim, huyết khối tĩnh mạch sâu, nghẽn mạch phổi, tái thông mạch. Tuy nhiên, tùy từng trường hợp, các loại thuốc khác nhau được sử dụng để điều trị một cách hiệu quả và ít tốn kém nhất. Ví dụ, Streptase là thuốc rẻ nhất nhưng chỉ được dùng cho những trường hợp đặc biệt vì nhiều lý do như thiếu tính đặc hiệu với sợi huyết, hiệu quả thấp, thời gian dùng thuốc kéo dài... Còn Alteplase được sử dụng nhiều hơn trong điều trị nghẽn động mạch phổi lớn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 1.3. Chất hoạt hóa plasminogen mô ngƣời Chất hoạt hóa plasminogen mô người là dạng chủ yếu của dạng hoạt động nội sinh của plasminogen trong máu. Nó được tạo ra dưới dạng phân tử sợi đơn ở tế bào thành mạch trong và được giữ trong huyết tương một cách liên tục hoặc giải thoát một cách nhanh chóng bằng phản ứng kích thích của chất cảm ứng của tế bào thành mạch máu [39]. Dạng hoạt động plasminogen được sử dụng làm tan huyết khối về phương diện lâm sàng cho các quá trình điều trị tắc mạch phổi và chứng nhồi máu cơ tim [9], [27], [46]. Không giống như nhiều protease serine khác, h-tPA hoạt động dưới d