Luận văn Nghiên cứu các đặc tính, ứng dụng và biện pháp kiềm chế tác hại của enzyme polyphenol oxidase từ thực vật

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -----------------------*****--------------------- NGUYỄN HỒ THƯ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH, ỨNG DỤNG VÀ BIỆN PHÁP KIỀM CHẾ TÁC HẠI CỦA ENZYME POLYPHENOL OXIDASE TỪ THỰC VẬT Chuyên ngành: Hóa sinh Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. ĐỒNG THỊ THANH THU THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, 2012 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABTS : 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6 sulphobic acid) CPE : Chế phẩm enzyme HđC : Hoạt độ chung HđR : Hoạt độ riêng Hđmax : Hoạt độ cao nhất KC : Kiểm chứng LMS : Laccase mediator system NL : Nguyên liệu OD : Giá trị mật độ quang ∆OD : Hiệu số giá trị mật độ quang PPO : Polyphenol oxidase Pr-E : Protein-enzyme SGZ : Syringaldazine TB : Trung bình TN : Thí nghiệm UI : Đơn vị hoạt độ E ΣUI : Tổng đơn vị hoạt độ E VddE : Thể tích dung dịch enzyme VEthanol : Thể tích ethanol vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Tính chất của PPO thu nhận từ các nguồn khác nhau............................... 18 Bảng 1.2. Thành phần hóa học cơ bản trong lá trà tươi ............................................ 36 Bảng 2.1. Thành phần phản ứng xác định hoạt độ của PPO ..................................... 41 Bảng 2.2. Phương pháp xây dựng đường chuẩn Bradford ........................................ 42 Bảng 3.1. Độ ẩm của lá trà nguyên liệu ..................................................................... 50 Bảng 3.2. Hoạt độ chung của PPO trong nguyên liệu ............................................... 50 Bảng 3.3. Hàm lượng protein trong nguyên liệu ....................................................... 51 Bảng 3.4. Hoạt độ riêng của PPO từ nguyên liệu ...................................................... 51 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của PPO ..................... 52 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến độ bền của PPO ........................ 53 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của PPO ............................................................................................................ 54 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO ............................................................................................................ 56 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO theo thời gian ..................................................................................... 57 Bảng 3.10. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ của PPO ..................................................................................................... 59 Bảng 3.11 . Kết quả khảo sát động học phản ứng của PPO theo thời gian ............... 61 Bảng 3.12. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt độ của PPO ............................................................................................................ 62 Bảng 3.13. Sự thay đổi OD trong quá trình chế biến trà đen (mẫu TN) ................... 64 Bảng 3.14. Sự thay đổi OD trong quá trình chế biến trà xanh (mẫu TN) ................. 65 Bảng 3.15. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sẫm màu của rau quả ............... 69 Bảng 3.16. Kết quả ảnh hưởng của pH đến sự sẫm màu của rau quả ....................... 69 Bảng 3.17. Kết quả ảnh hưởng của hóa chất đến sự sẫm màu của rau quả .............. 70 Bảng 3.18. Kết quả ảnh hưởng của enzyme đến sự sẫm màu của rau quả ............... 71 viii Bảng 3.19. Kết quả thu nhận chế phẩm PPO thô từ nguyên liệu ............................. 71 Bảng 5.1. Tương quan giữa giá trị ∆OD với nồng độ albumin ................................. 83 Bảng 5.2. Giá trị OD tương ứng khi xác định hàm lượng protein trong nguyên liệu................................................................................................. 84 Bảng 5.3. Giá trị OD tương ứng khi xác định hoạt độ PPO từ nguyên liệu ............. 84 Bảng 5.4. Giá trị OD tương ứng khi xác định pH tối ưu cho hoạt động của PPO ..................................................................................................... 85 Bảng 5.5. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của pH đến độ bền của PPO .............................................................................................. 86 Bảng 5.6. Giá trị OD tương ứng khi xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PPO ........................................................................................... 87 Bảng 5.7. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO ......................................................................................... 88 Bảng 5.8. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO theo thời gian ........................................................... 89 Bảng 5.9. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ của PPO .......................................................................... 92 Bảng 5.10. Giá trị OD tương ứng khi xác định động học phản ứng của PPO theo thời gian ..................................................................................... 93 Bảng 5.11. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của acid ascorbic đến hoạt độ của PPO ................................................................... 94 Bảng 5.12. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của acid citric đến hoạt độ của PPO.................................................................................. 95 Bảng 5.13. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của NaCl đến hoạt độ của PPO ....................................................................................... 96 Bảng 5.14. Sự thay đổi OD theo thời gian trong chế biến trà đen (mẫu TN) .................................................................................................. 97 Bảng 5.15. Sự thay đổi OD theo thời gian trong chế biến trà xanh (mẫu TN) .................................................................................................. 97 ix Bảng 5.16. Giá trị OD tương ứng khi xác định hoạt độ chế phẩm PPO thô từ nguyên liệu ............................................................................................ 98 Bảng 5.17. Giá trị OD tương ứng khi xác định hàm lượng protein trong CPE – PPO thô ......................................................................................... 98 Bảng 5.18. Sự tương quan giữa nồng độ và độ hấp thu cực đại của benzoquinon ở bước sóng 420nm ............................................................. 98 Bảng 5.19. Phương pháp xây dựng đường chuẩn tyrosin ....................................... 100 Bảng 5.20. Phương pháp xác định lượng tyrosin trong dung dịch nghiên cứu ............................................................................................... 100 Bảng 5.21. Tương quan giữa giá trị ∆OD với nồng độ tyrosin ............................... 101 Bảng 5.22. Giá trị OD tương ứng khi xác định hoạt độ của enzyme bromelin và ficin ...................................................................................... 102 Bảng 5.23. Kết quả xác định hoạt độ chung của enzyme bromelin và enzyme ficin ........................................................................................... 102 x DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ HÌNH MINH HỌA Trang BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3. Ảnh hưởng của các chất ức chế khác nhau đến hoạt độ của PPO ........................................................................................................... 62 ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của PPO .............................................. 52 Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng của pH đến độ bền của PPO ................................................ 54 Đồ thị 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của PPO ........................................ 55 Đồ thị 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO ....................................... 56 Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO theo thời gian ................. 58 Đồ thị 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ của PPO .......................... 60 Đồ thị 3.7. Động học phản ứng PPO theo thời gian .................................................. 61 Đồ thị 3.8. Sự thay đổi OD theo thời gian trong chế biến trà đen (mẫu TN) ................................................................................................... 64 Đồ thị 3.9. Sự thay đổi OD theo thời gian trong chế biến trà xanh (mẫu TN) .................................................................................................. 66 Đồ thị 5.1. Sự tương quan giữa giá trị ∆OD và nồng độ albumin ............................. 84 Đồ thị 5.2. Sự tương quan giữa giá trị OD và nồng độ benzoquinon ....................... 99 Đồ thị 5.3. Sự tương quan giữa giá trị ∆OD và nồng độ tyrosin ............................. 101 xi HÌNH MINH HỌA Hình 1.1. Phản ứng xúc tác của tyrosinase và catechol oxidase ................................. 9 Hình 1.2. Cấu trúc của tyrosinase .............................................................................. 10 Hình 1.3. Chu trình xúc tác hydroxyl hóa của monophenol và oxi hóa của o-diphenol thành o-quinone bởi tyrosinase ............................................... 12 Hình 1.4. Phản ứng xúc tác của laccase ..................................................................... 13 Hình 1.5. Trung tâm hoạt động với nguyên tử đồng của laccase .............................. 14 Hình 1.6. Cơ chế xúc tác của laccase ......................................................................... 15 Hình 1.7. (a) Chu trình xúc tác của laccase (b) Chu trình xúc tác của hệ thống laccase mediator ................................. 16 Hình 1.8. Cấu trúc của vài hợp chất polyphenol trong tự nhiên ............................... 33 Hình 1.9. Cây trà ........................................................................................................ 35 Hình 3.1. Sản phẩm trà xanh ...................................................................................... 67 Hình 3.2. Sản phẩm trà đen ........................................................................................ 67 Hình 3.3. Nước trà đen và trà xanh ............................................................................ 68 Hình 5.1. Phản ứng xúc tác bởi PPO trên cơ chất catechol .................................... 103 Hình 5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sẫm màu của khoai tây ....................... 103 Hình 5.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sẫm màu của táo tây ............................ 104 Hình 5.4. Ảnh hưởng của pH đến sự sẫm màu của khoai tây ................................. 104 Hình 5.5. Ảnh hưởng của pH đến sự sẫm màu của táo tây ..................................... 105 Hình 5.6. Ảnh hưởng của hóa chất đến sự sẫm màu của khoai tây ........................ 105 Hình 5.7. Ảnh hưởng của hóa chất đến sự sẫm màu của táo tây ............................ 106 Hình 5.8. Ảnh hưởng của enzyme đến sự sẫm màu của khoai tây ......................... 106 Hình 5.9. Ảnh hưởng của enzyme đến sự sẫm màu của táo tây ............................. 107 Hình 5.10. Chế phẩm PPO thô từ lá trà ................................................................... 107 ii MỤC LỤC Lời cảm ơn Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các biểu đồ, đồ thị và hình minh họa Trang Mở đầu .......................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3 1.1. Giới thiệu chung về enzyme oxi hóa khử ......................................................... 3 1.1.1. Các dehydrogenase ....................................................................................... 3 1.1.1.1. Dehydrogenase – piridin ................................................................... 3 1.1.1.2. Dehydrogenase – flavin ................................................................... 4 1.1.1.3. Dehydrogenase – ubiquinon (UQ) .................................................... 5 1.1.2. Các oxydase .................................................................................................. 6 1.2. Enzyme polyphenol oxidase ............................................................................... 8 1.2.1. Khái niệm ...................................................................................................... 8 1.2.2. Nguồn thu nhận PPO .................................................................................... 8 1.2.3. Phân loại ....................................................................................................... 8 1.2.3.1. Tyrosinase và catechol oxidase ......................................................... 9 1.2.3.2. Laccase ............................................................................................. 12 1.2.4. Tính chất của PPO ...................................................................................... 17 1.2.5. Một số công trình nghiên cứu về PPO ....................................................... 22 1.2.6. Chức năng sinh học của PPO ..................................................................... 22 1.2.7. Ứng dụng của PPO .................................................................................... 23 1.2.7.1. Trong công nghiệp thực phẩm .......................................................... 24 1.2.7.2. Trong các ngành công nghiệp khác .................................................. 25 1.2.7.3. Trong công nghệ môi trường ........................................................... 26 1.2.7.4. Trong y học và mỹ phẩm ................................................................. 26 iii 1.2.7.5. Trong công nghệ sinh học nano ........................................................ 27 1.2.8. Sự ức chế PPO ........................................................................................... 27 1.2.8.1. Phương pháp vật lý ........................................................................... 28 1.2.8.2. Phương pháp hóa học ....................................................................... 29 1.2.8.3. Phương pháp enzyme ....................................................................... 32 1.2.8.4. Phương pháp gen .............................................................................. 32 1.2.9. Cơ chất của PPO: Phenol ......................................................................... 33 1.3. Cây trà và các sản phẩm từ trà ........................................................................ 34 1.3.1. Giới thiệu chung về cây trà ........................................................................ 34 1.3.2. Các sản phẩm từ trà .................................................................................... 36 CHƢƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .................................................. 39 2.1. Vật liệu ................................................................................................................ 39 2.1.1. Nguyên liệu ................................................................................................. 39 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị...................................................................................... 39 2.1.3. Hóa chất ...................................................................................................... 39 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................. 39 2.2.1. Phương pháp xác định độ ẩm của lá trà ..................................................... 39 2.2.2. Phương pháp thu nhận PPO từ nguyên liệu ............................................... 40 2.2.3. Phương pháp xác định hoạt độ của PPO .................................................... 40 2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng protein trong mẫu phân tích ............... 41 2.2.5. Xác định hoạt độ riêng của PPO ................................................................ 42 2.2.6. Phương pháp xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của PPO .................................................................................................................. 43 2.2.6.1. Phương pháp xác định pH tối ưu cho hoạt động của PPO ............... 43 2.2.6.2. Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH đến độ bền của PPO .................................................................................................................. 43 2.2.6.3. Phương pháp xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PPO .................................................................................................................. 43 iv 2.2.6.4. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO .......................................................................................................... 44 2.2.6.5. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO theo thời gian .................................................................................... 44 2.2.6.6. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt động của PPO .......................................................................................... 45 2.2.6.7. Phương pháp khảo sát động học phản ứng PPO theo thời gian ................................................................................................................. 45 2.2.6.8. Phương pháp xác định ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt động của PPO .......................................................................................... 45 2.2.7. Phương pháp nghiên cứu ứng dụng PPO trong tạo màu cho trà trong công nghệ chế biến trà ........................................................................... 46 2.2.7.1. Phương pháp nghiên cứu sự thay đổi màu dung dịch do sự oxi hóa hợp chất polyphenol thành quinon trong công nghệ chế biến trà ............................................................................................................ 46 2.2.7.2. Phương pháp chế biến trà đen .......................................................... 46 2.2.7.3. Phương pháp chế biến trà xanh ....................................................... 47 2.2.8. Phương pháp nghiên cứu một số biện pháp kiềm chế tác hại của PPO gây sẫm màu rau củ, trái cây ......................................................... 48 2.2.9. Phương pháp thu nhận chế phẩm PPO thô từ nguyên liệu ....................... 49 CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .......................................................... 50 3.1. Khảo sát các đặc tính của lá trà nguyên liệu ................................................. 50 3.1.1. Xác định độ ẩm của lá trà nguyên liệu ....................................................... 50 3.1.2. Xác định hoạt độ của PPO trong nguyên liệu ............................................ 50 3.1.3. Xác định hàm lượng protein trong nguyên liệu ...................................... 51 3.1.4. Xác định hoạt độ riêng của PPO trong nguyên liệu ................................... 51 3.2. Khảo sát các điều kiện tối ƣu cho hoạt động của PPO trong lá trà nguyên liệu .................................................................................................. 52 3.2.1. Khảo sát pH tối ưu cho hoạt động của PPO ............................................... 52 v 3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến độ bền của PPO ................................... 53 3.2.3. Khảo sát nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PPO ..................................... 54 3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO ............................. 56 3.2.5. Khảo s