Luận văn Nghiên cứu chế tạo kit thử nhanh trong phân tích urea

iĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KIT THỬ NHANH TRONG PHÂN TÍCH UREA SVTH : TRỊNH THỊ THANH TÂM MSSV : 60302440 CBHD : TS. TRẦN BÍCH LAM BỘ MÔN KỸ THUẬT THỰC PHẨM TP Hồ Chí Minh, 01/2008 NHẬÄN XÉÙT CỦÛA GIÁÙO VIÊÂN HƯỚÙNG DẪÃN ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... NHẬÄN XÉÙT CỦÛA GIÁÙO VIÊÂN PHẢÛN BIỆÄN ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... LỜI CÁM ƠN GVHD: TS. Trần Bích Lam ii LỜØI CẢÛM ƠN  Trước hết, em xin gởi lời cám ơn đến thầy cô trường Đại học Bách Khoa, đặc biệt là các thầy cô Bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho chúng em trong suốt gần năm năm ngồi trên ghế giảng đường đại học. Em xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến cô Trần Bích Lam đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em rất nhiều để em có thể hoàn thành tốt luận văn này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn các bạn lớp HCTP03 đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian làm luận văn. Chúc các bạn luôn vui vẻ và thành công trong cuộc sống. Sinh viêân Trịnh Thị Thanh Tââm MỤC LỤC GVHD: TS. Trần Bích Lam iii MỤÏC LỤÏC ĐỀÀ MỤÏC: Trang TRANG BÌA ................................................................................................................ i LỜØI CẢÛM ƠN ................................................................................................................................ ii MỤÏC LỤÏC..................................................................................................................................... iii DANH SÁÙCH HÌNH VẼÕ ........................................................................................................... vii DANH SÁÙCH BẢÛNG BIỂÅU....................................................................................................... ix LỜØI MỞÛ ĐẦÀU ................................................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1 ................................................................................................................................... 2 1.1. Enzyme urease (EC 3.5.1.5) ................................................................................................ 3 1.1.1. Danh pháp quốc tế và phân loại .................................................................................. 3 1.1.2. Tính chất vật lý của enzyme urease ............................................................................ 3 1.1.3. Tính chất hóa lý của enzyme urease ........................................................................... 6 1.1.4. Trung tâm hoạt động .................................................................................................... 6 1.1.5. Cơ chế xúc tác .............................................................................................................. 9 1.1.6. Cơ chất của urease...................................................................................................... 10 1.1.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của urease ......................................... 12 1.2. Các phương pháp thu nhận urease .................................................................................... 23 1.2.1. Nguồn thu nhận........................................................................................................... 23 1.2.2. Một số phương pháp tách chiết và tinh chế enzyme................................................. 26 1.3. Các phương pháp xác định hoạt tính urease..................................................................... 27 1.3.1. Xác định hoạt tính urease dựa trên việc định lượng NH3 được giải phóng.............. 29 MỤC LỤC GVHD: TS. Trần Bích Lam iv 1.3.2. Xác định hoạt tính urease bằng cách định lượng CO2 được giải phóng................... 30 1.4. Ứng dụng của enzyme urease ........................................................................................... 31 1.4.1. Trong nông nghiệp...................................................................................................... 31 1.4.2. Trong thực phẩm ......................................................................................................... 31 1.4.3. Trong phân tích hóa sinh ............................................................................................ 31 1.4.4. Trong công nghệ môi trường ...................................................................................... 32 1.4.5. Trong y học ................................................................................................................. 32 1.5. Tổng quan về urea ............................................................................................................. 32 1.5.1. Cấu tạo hóa học của urea........................................................................................... 32 1.5.2. Phát hiện ..................................................................................................................... 33 1.5.3. Công dụng ................................................................................................................... 34 1.5.4. Mức độ nguy hiểm...................................................................................................... 35 1.5.5. Các nguồn phát sinh urea ........................................................................................... 35 1.5.6. Các phương pháp xác định urea ................................................................................. 39 1.6. Kit thử nhanh trong phân tích urea.................................................................................... 46 1.6.1. Tình hình các loại kit thử nhanh ở Việt Nam [52]..................................................... 46 1.6.2. Các loại kit phân tích urea ......................................................................................... 47 CHƯƠNG 2 ................................................................................................................................. 50 2.1. Nguyên liệu........................................................................................................................ 51 2.1.1. Hóa chất ...................................................................................................................... 51 2.1.2. Dụng cụ ....................................................................................................................... 51 2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................................... 52 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu ........................................................................................................ 52 2.2.2. Phương pháp tìm chất chỉ thị màu tối ưu ................................................................... 52 2.2.3. Phương pháp xác định lượng chất chỉ thị thích hợp cho lên kit................................. 54 2.2.4. Phương pháp chọn dung môi thích hợp dùng để pha urease..................................... 54 MỤC LỤC GVHD: TS. Trần Bích Lam v 2.2.5. Phương pháp chọn thể tích chấm enzyme phù hợp ................................................... 58 2.2.6. Phương pháp nghiên cứu lượng enzyme urease thích hợp cho lên kit ..................... 59 2.2.7. Phương pháp khảo sát giới hạn phát hiện của kit, xây dựng thang màu bán định lượng urea và đường chuẩnpH........................................................................................ 60 2.2.8. Phương pháp xác định thời gian hiện màu của kit .................................................... 60 2.2.9. Phương pháp xác định thời gian sử dụng của kit ....................................................... 60 2.2.10. Khảo sát khả năng phát hiện của kit trong mẫu thực.............................................. 61 2.2.11. Các phương pháp xử lý số liệu................................................................................. 61 CHƯƠNG 3 ................................................................................................................................. 62 3.1. Khảo sát các loại chất chỉ thị màu .................................................................................... 63 3.2. Khảo sát lượng chất chỉ thị thích hợp cho lên kit ............................................................. 65 3.3. Khảo sát dung môi pha urease .......................................................................................... 68 3.3.1. Khảo sát hoạt tính của enzyme urease theo phương pháp Nessler .......................... 68 3.3.2. Khảo sát dung môi dùng để pha urease .................................................................... 70 3.4. Khảo sát lượng enzyme thích hợp cho lên kit .................................................................. 72 3.4.1. Khảo sát thể tích chấm enzyme urease lên kit.............................................................. 72 3.4.2. Khảo sát nồng độ dung dịch enzyme urease cho lên kit............................................... 72 3.5. Khảo sát giới hạn phát hiện của kit, xây dựng thang màu bán định lượng urea và đường chuẩnpH.............................................................................................................................. 76 3.5.1. Xác định khả năng phát hiện của kit ......................................................................... 76 3.5.2. Xây dựng thang màu bán định lượng urea................................................................. 77 3.5.3. Xây dựng đường chuẩnpH để định lượng urea .................................................... 78 3.6. Khảo sát thời gian hiện màu của kit ................................................................................. 83 3.7. Khảo sát thời gian sử dụng của kit.................................................................................... 85 3.8. Khảo sát khả năng phát hiện của kit trong mẫu thực...................................................... 87 3.8.1. Sữa............................................................................................................................... 87 MỤC LỤC GVHD: TS. Trần Bích Lam vi 3.8.2. Nước mắm................................................................................................................... 89 3.8.3. Thủy sản...................................................................................................................... 90 CHƯƠNG 4 ................................................................................................................................. 95 4.1. Kết luận.............................................................................................................................. 96 4.2. Kiến nghị:........................................................................................................................... 97 TÀØI LIỆÄU THAM KHẢÛO............................................................................................................ 98 DANH SÁCH HÌNH VẼ GVHD: TS. Trần Bích Lam vii DANH SÁÙCH HÌNH VẼÕ Chương 1: TỔNG QUAN Hình 1.1: Tinh thể urease được J.B.Summer chiết tách và kết tinh............................................... 4 Hình 1.2: Khối lượng phân tử của urease qua cột lọc gel Agarose A_15m .................................. 4 Hình 1.3: Cấu trúc của enzyme urease........................................................................................... 6 Hình 1.4: Trung tâm hoạt động của urease.................................................................................... 8 Hình 1.5: Urease từ K.aerogenes và từ Bacillus pasterrii ............................................................. 8 Hình 1.6: Cơ chế xúc tác của enzyme............................................................................................. 9 Hình 1.7: Cơ chế xúc tác của urease ............................................................................................ 10 Hình 1.8: Công thức cấu tạo của một số cơ chất chứa phospho của urease .............................. 11 Hình 1.9: Đồ thị biểu diễn vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất............................................ 12 Hình 1.10: Đồ thị hoạt tính urease theo pH trong 3 loại đệm nồng độ M/8 ............................... 14 Hình 1.11: Ảnh hưởng của chất kìm hãm cạnh tranh và không cạnh tranh ................................ 16 Hình 1.12: Cơ chế ức chế của hydroxamic acid với urease ......................................................... 17 Hình 1.13: Công thức hóa học của các α-hydroxyketones (1–13) and α – diketones (14–20) ... 19 Hình 1.14: Ảnh hưởng của các hợp chất thiols, urea và acid boric tới khả năng ức chế urease của dịch chiết tỏi trước khi ủ........................................................................................................ 21 Hình 1.15: Động học của sự ức chế urease bởi dịch chiết tỏi ở các nồng độ khác nhau........... 21 Hình 1.16: Cấu trúc phân tử urease của Helicobacter Pylori..................................................... 23 Hình 1.17: Các loại đậu chứa enzyme urease .............................................................................. 25 Hình 1.18: Cấu trúc phân tử của urea ......................................................................................... 32 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Hình 3.1: Màu sắc của chỉ thị trong nước cất (pH = 6.5) ........................................................... 64 Hình 3.2: Màu sắc của chỉ thị trong nước máy (pH = 6.8) ......................................................... 64 Hình 3.3: Vị trí chất chỉ thị và enzyme urease trên kit ................................................................ 66 DANH SÁCH HÌNH VẼ GVHD: TS. Trần Bích Lam viii Hình 3.4: Kit thử với các nồng độ phenol red khác nhau trước khi nhúng dung dịch urea........ 66 Hình 3.5: Sự thay đổi màu sắc của chỉ thị PR trên kit sau khi nhúng urea................................. 66 Hình 3.6: Kit thử với các nồng độ phenol red khác nhau sau khi nhúng dung dịch urea 2% .... 67 Hình 3.7: Kit thử sau khi dung dịch urea chạy hết kit ................................................................. 67 Hình 3.8: Kit thử trắng sau khi dung dịch urea chạy hết kit........................................................ 68 Hình 3.9: Đồ thị NH3 chuẩn dùng để xác định hoạt tính urease ................................................. 69 Hình 3.10: Biểu đồ so sánh hoạt tính urease trong các loại dung môi ....................................... 71 Hình 3.11: Khảo sát khả năng phát hiện của kit chấm 30µl urease 4% trong dung dịch urea ở các nồng độ: 1 – 0ppm, 2 – 1000ppm, 3 – 800ppm, 4 – 600ppm................................................ 74 Hình 3.12: Khảo sát khả năng phát hiện của kit chấm 60µl urease 4% trong dung dịch urea ở các nồng độ: 1 – 0ppm, 2 – 1000ppm, 3 – 800ppm, 4 – 600ppm, 5 – 400ppm, 6 – 200ppm, 7 – 100ppm, 8 – 50ppm ....................................................................................................................... 75 Hình 3.13: Sự thay đổi màu sắc của chỉ thị trên kit sau khi nhúng dung dịch urea ở các nồng độ: 1 – 0ppm, 2 – 50ppm, 3 – 40ppm, 4 – 30ppm, 5 – 20ppm, 6 – 10ppm, 7 – 5ppm ................ 76 Hình 3.14: Sự thay đổi màu sắc của chỉ thị trên kit sau khi nhúng dung dịch urea ở các nồng độ: 1 – 0ppm, 2 – 50ppm, 3 – 100ppm, 4 – 200ppm, 5 – 400ppm, 6 – 600ppm, 7 – 800ppm, 8 – 1000ppm ........................................................................................................................................ 77 Hình 3.15: Sự thay đổi màu sắc của chỉ thị trên kit sau khi nhúng dung dịch urea 0.5% và 1%78 Hình 3.16: Các bước định tính sự có mặt urea trong mẫu thử .................................................... 78 Hình 3.17: Đồ thị đường chuẩn biểu diễn sự thay đổi của p