Luận văn Nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa và độc tính tế bào của một số hợp chất Lignan và Stilbene

21 5. Kết quả và thảo luận 5.1 Kết quả nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa 5.1.1 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH Khi tiến hành thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH trên ba chất PI, RES và PTS chúng tôi thu đƣợc kết quả tóm tắt ở bảng 1 nhƣ sau: Chất %Ức chế DPPH IC50(μM) 100μM 50μM 25μM 10μM PI 81.1 ± 1.3 72.9 ± 2.1 69.8 ± 2.8 30.5 ± 0.8 17.4 RES 73.5 ± 2.1 57.6 ± 0.7 40.6 ± 2.5 21.9 ± 0.2 38.9 PTS 63.2 ± 0.9 46.9 ± 0.4 29.2 ± 1.5 13.8 ± 0.6 59.5 Bảng 1. Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của PI, RES và PTS. Ba chất quercetin, isotaxiresinol và secoisolariciresinol do có IC50 < 10 μM nên tiếp tục đƣợc thử hoạt tính ở các nồng độ 10, 5, 2, 1μM.Và thu đƣợc kết quả ở bảng 2 nhƣ sau: Chất % ức chế DPPH IC50(μM) 10μM 5μM 2μM 1μM ITR 68.6 ± 1.6 36.3 ± 0.7 15.7 ± 1.5 9.9 ± 1.8 7.1 SSR 52.5 ± 0.5 34.6 ± 2.5 12.9 ± 0.5 6.3 ± 0.4 9.3 Quercetin 81.3 ± 0.1 53.8 ± 0.2 14.2 ± 2.0 6.9 ± 0.8 4.7 Bảng 2. Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH. Kết quả cho thấy cả 5 chất khảo sát đều có khả năng ức chế gốc tự do DPPH. Trong đó, ITR và SSR có hoạt tính mạnh với IC50 < 10μM (giá trị IC50 lần lƣợt là 7.1 μM và 9.3 μM) và kế đến là PI với IC50 = 17.4 μM, RES có IC50 = 22 38.9 μM. Hoạt tính ức chế gốc tự do yếu nhất trong 5 chất chính là PTS với giá trị IC50 = 59.5 μM. Thứ tự giảm dần khả năng ức chế gốc tự do DPPH đƣợc thể hiện trên đồ thị 1 nhƣ sau: ITR > SSR > PI > RES > PTS. 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120 I% C (μM) Resveratrol piceatannol pterostilbene isotaxiresinol secoisolarciresinol Quercetin Đồ thị 1. Biễu diễn % ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ các chất. Nhận xét Nhƣ vậy khả năng ức chế gốc tự do DPPH của nhóm lignan mạnh hơn so với nhóm stilbene. Điều này do cấu trúc của từng nhóm chất và số nhóm hydroxyl của các hợp chất quyết định. Tuy nhiên, kết quả cho thấy vị trí của nhóm hydroxyl (-OH) quan trọng hơn so với số nhóm hydroxyl có trong hợp chất. Theo các nghiên cứu trƣớc đây, cơ chế kháng gốc tự do của hợp chất phenol đều do khả năng cho hydrogen của nhóm hydroxyl (-OH) gắn trên vòng thơm quyết định. Nhƣng khả năng cho hydrogen của nhóm hydroxyl (-OH) ƣu 23 tiên hơn tại vị trí –orto và –para, nhóm –OH tại vị trí –meta thì hầu nhƣ không có khả năng kháng gốc tự do 20,36,43. Lý thuyết này đúng cho trƣờng hợp của RES, nhiều tài liệu công bố cho thấy rằng phần tử quyết định chủ yếu hoạt tính chống oxy hóa của RES là do nhóm –OH trên vòng B (nhóm –OH tại vị trí –para trên vòng) quyết định 27,30,43. Khi so sánh RES và PTS, 2 hợp chất có cấu trúc tƣơng tự nhau, có cùng một nhóm –OH trên vòng B ta thấy: hoạt tính chống oxy hóa của PTS yếu hơn so với RES điều này là do sự thay thế 2 nhóm –OH trên vòng A của RES thành 2 nhóm –OMe trên vòng A của PTS. Hoạt tính kháng oxy hóa của PI mạnh hơn RES và PTS là do PI có 2 nhóm –OH kế cận nhau trên vòng B (tạo thành cấu trúc diol). HO OH OH E B A RES Nhóm –OH quyết định hoạt tính chống oxi hoá HO OH OH E B A RES MeO OMe OH B A PTS 24 Đối với nhóm lignan, cả 2 hợp chất khảo sát đều có hoạt tính ức chế gốc tự do cao (ITR; IC50 = 7.1 M và SSR; IC50 = 9.2 M), cao hơn cả nhóm stilbene là do cấu trúc lignan có 2 nhóm –OH tại vị trí –para trong khi nhóm stilbene chỉ chứa 1 nhóm –OH tại vị trí –para. Ngoài lý do trên thì hoạt tính chống oxy hóa cao của lignan còn do sự kết hợp của nhóm -OH tại vị trí –para với nhóm –OH hay nhóm methoxy (-OMe) tại vị trí –meta gây ra 19,20,36,43,56. Quan sát 2 hợp chất của lignan ta thấy, khi thay thế 1 nhóm –OH trong cấu trúc diol bằng 1 nhóm -OMe thì khả năng ức chế gốc tự do sẽ yếu hơn: ITR (IC50 = 7.1 M) > SSR (IC50 = 9.2M). OH OH MeO HO OMe OH SSR OH OH OH MeO HO OH ITR HO OH OH OH E PI 25 5.1.2 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO của năm chất cho kết quả ở bảng 3 và đƣợc biễu diễn trên đồ thị 2 nhƣ sau : Chất % ức chế NO IC50(M) 100μM 50μM 25μM 10μM PI 73.6 ± 0.6 54.4 ± 0.3 12.8 ± 0.5 3.7 ± 0.8 47.4 RES 32.5 ± 0.4 9.9 ± 0.3 2.0 ± 0.3 -3.1 ± 0.4 - PTS 3.8 ± 1.0 1.8 ± 0.1 1.2 ± 0.3 2.5 ± 0.5 - ITR 69.6 ± 0.8 65.3 ± 2.2 37.7 ± 0.3 19.2 ± 1.2 36.2 SSR 58.4 ± 0.5 47.4 ± 2.3 22.9 ± 1.2 9.3 ± 2.5 61.9 Quercetin 68.8 ± 0.4 75.8 ± 0.4 74.8 ± 1.1 20.3 ± 2.3 18.2 Bảng 3. Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO. Trong 5 chất khảo sát chỉ có 3 chất có hoạt tính ức chế gốc tự do NO. Trong đó ITR có hoạt tính mạnh nhất với IC50 = 36.2 M, PI có hoạt tính vừa phải IC50 = 47.4 M, tiếp đến SSR có hoạt tính hơi yếu với IC50 = 61.9M. 26 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 20 40 60 80 100 120 I% C(μM) Quercetin piceatannol resveratrol pterostilbene Isotaxiresinol secoisolarciresinol Đồ thị 2. Biễu diễn % ức chế gốc tự do NO theo nồng độ các chất. Nhận xét: Thứ tự giảm dần khả năng kháng gốc tự do NO nhƣ sau: ITR > PI > SSR > RES > PTS Nhìn chung, khả năng ức chế gốc tự do NO của 5 chất có thứ tự giống nhƣ khả năng ức chế gốc DPPH nên có thể giải thích mối quan hệ của cấu trúc lên hoạt tính ức chế gốc tự do NO giống nhƣ đã giải thích mối quan hệ của cấu trúc lên hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH. Tuy nhiên, có một sự thay đổi nhỏ giữa thứ tự của SSR và PI là trong phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế DPPH, SSR mạnh hơn PI với giá trị IC50 lần lƣợt là 9.2 μM và 17.4 μM, còn trong phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO thì PI có khả năng ức chế gốc NO tốt hơn SSR. Sự thay đổi này là do cấu trúc diol trong hai chất PI và SSR 33,39. 27 5.1.3 Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme XO Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme XO của các mẫu đƣợc thể hiện trong bảng 4 và đồ thị 3. Chất % ức chế XO IC50 (M) 100 (M) 50 (M) 25 (M) 10 (M) PI 78.93 ± 0.2 3.15 ± 0.2 60.32 ± 0.2 37.9 ± 1.7 18.1 RES 38.3 ± 8.4 1.9 ± 7.5 1.4 ± 5.2 5.8 ± 7.9 - PTS 29.1 ± 2.8 33.3 ± 2.3 34.2 ± 1.7 20.9 ± 1.3 - ITR -10.3 ± 4.0 -26.9 ± 3.6 -23.9 ± 8.8 -26.6 ± 4.8 - SSR 30.3 ± 1.0 35.8 ± 7.7 31.4 ± 1.2 39.36 ± 0.7 - Allopurinol 104.9  4.0 100.7  7.8 99.5  3.2 95.38  1.4 < 10 Bảng 4. Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc enzyme XO. Do allopurinol có hoạt tính ức chế XO rất mạnh, nên tiếp tục đƣợc thử ở các nồng độ nhỏ hơn kết quả thử hoạt tính của allopurinol đƣợc cho trong bảng 5 dƣới đây. Chất % ức chế IC50 (M) 5 (M) 2 (M) 1 (M) 0.5 (M) 0.2 (M) Allopurinol 88.6  2.4 85.9  2.1 74.8  1.8 54.7 3.3 16.6  2.2 0.46 Bảng 5. Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc enzyme XO của Allopurinol ở nồng độ từ 0.2 đến 5M. 28 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120 I% C (μM) piceatannol resveratrol pterostilbene isotaxiresinol secoisolarciresinol allopurinol Đồ thị 3. Biễu diễn % ức chế enzyme XO theo nồng độ các chất. Nhận xét: Trong 5 chất khảo sát chỉ có PI là có hoạt tính ức chế emzym XO, hoạt tính ức chế này khá mạnh với IC50=18.1M. Nhƣ vậy chỉ có PI có khả năng ức chế enzyme XO, vì cơ chế ức chế enzyme XO hoàn toàn khác với cơ chế bắt gốc tự do nên chúng tôi chƣa thể giải thích kết quả này. 5.1.4 Tóm tắt kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa Kết quả khi thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH, NO và hoạt tính ức chế enzyme XO đƣợc sắp xếp trong bảng 6. 29 Chất Cấu trúc DPPH IC50(µM) NO IC50(M) XO IC50(M) ITR OH OH OH MeO HO OH 7.1 36.2 - SSR OH OH MeO HO OMe OH 9.3 61.9 - RES 38.9 - - PTS 59.5 - - MeO OMe OH HO OH OH E 30 PI 17.4 47.4 18.1 Bảng 6. Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH, gốc tự do NO và enzyme XO của các chất. Kết quả cho thấy 2 lignan có khả năng làm giảm bệnh tiểu đƣờng, viêm gan, …là do khả năng kháng gốc tự do của chúng. Stilbene có nhiều hoạt tính sinh học nhƣ chống ung thƣ, tiểu đƣờng, tim mạch cũng là do hoạt tính chống oxy hóa mạnh của chúng. So với resveratrol, một hoạt chất có rất nhiều hoạt tính sinh học, đƣợc nhiều nhà khoa học trên thế giới cho rằng là nguyên nhân của “nghịch lý Pháp” (French Paradox), một hiện tƣợng nghịch lý khi mà tỉ lệ mắc bệnh tim của ngƣời Pháp rất thấp ngay cả khi chế độ ăn của họ rất nhiều thịt, bơ, bánh mì…, thì piceatannol có hoạt tính chống oxy hóa mạnh hơn. Bên cạnh đó, nghiên cứu trên dòng tế bào RAW 264.7 của chuột theo phƣơng pháp trypan (trypan blue dye exclusion), PI và RES cho giá trị LC50 lần lƣợt là 1.3  0.12 M, và 8.93  0.61M, hay hoạt tính ức chế dòng tế bào HL-60 của PI (IC50 = 9  0.11M ) > RES (IC50 = 12.1  0.17M) 13 . Chính vì vậy cần có những nghiên cứu sâu hơn về các hoạt tính sinh học khác của PI để có thể sử dụng chất này làm thuốc cũng nhƣ làm các sản phẩm thực phẩm chức năng để hổ trợ sức khỏe của con ngƣời. HO OH OH OH E 31 5.2 Kết quả nghiên cứu độc tính tế bào 5.2.1 Isotaxiresinol Kết quả thứ độc tính tế bào của ITR đƣợc khảo sát sử dụng phƣơng pháp đếm (đồ thị 4) và phƣơng pháp SRB (đồ thị 5). Kết quả phƣơng pháp đếm cho thấy không có sự thay đổi tế bào giữa giếng control và giếng có chứa ITR ở các nồng độ khác nhau. Điều này có nghĩa là ITR hầu nhƣ không ảnh hƣởng đến tế bào đến khoảng nồng độ 150 µM ở thời gian khảo sát là 24 và 48 giờ. Trong khi đó, ở nồng độ 300 µM cho thấy ảnh hƣởng rất rõ nét và số tế bào đếm đƣợc sau 24 giờ tƣơng đƣơng số tế bào đã cho vào giếng ban đầu, hình bên dƣới có thể chứng tỏ rằng hầu hết tất cả tế bào đã bị chết sau 24 giờ phơi nhiễm ITR. Số tế bào đếm đƣợc trong trƣờng hợp này có thể là tế bào chết hoặc các mảnh vỡ của tế bào, IC50 ở 48 giờ bằng phƣơng pháp đếm là 204.7 µM (bảng 7). Đồ thị 4. Sự phụ thuộc thời gian phơi nhiễm ITR trên số tế bào. 32 Đồ thị 5. Sự phụ thuộc nồng độ ITR trên sự phát triển tế bào theo SRB. Kết quả hiển thị trong phân tích SRB (hình 5) cho thấy ảnh hƣởng của ITR trên dòng tế bào DLD-1 là không đáng kể cho đến nồng độ khoảng 150 µM, và ảnh hƣởng rất mạnh ở nồng độ 300 µM, điều này phù hợp với kết quả trong phƣơng pháp đếm. IC50 tính toán từ phƣơng pháp SRB là 225.4 µM (đồ thị 5). Hình ảnh tế bào chụp đƣợc thông qua hệ thống kính hiển vi tƣơng phản pha cho thấy hình dạng tế bào cũng không có sự thay đổi giữa giếng control và giếng có chứa chất khảo sát ở các nồng độ đến 150 µM, tuy nhiên hình dạng tế bào bị thay đổi thành các dạng cầu ở nồng độ ITR 300 µM. Kết quả đƣợc tóm tắt ở bảng 7, bảng 8 và đồ thị 6 có thể chứng tỏ rằng tất cả các tế bào đã bị chết ở nồng độ ITR 300 µM. Tuy nhiên, đƣờng kính của tế bào lại hầu nhƣ không có sự thay đổi nào ở tất cả các nồng độ. 33 0 giờ 24 giờ 48 giờ ITR 300µM Bảng 7. Kết quả ảnh hƣởng của ITR 300µM lên hình dạng tế bào. DMSO ITR 150µM 48 giờ Diện tích (µm)2 462 ± 71 465 ± 59 Bảng 8. Kết quả ảnh hƣởng của ITR lên dạng hình học của tế bào. 34 Đồ thị 6. Biễu diễn ảnh hƣởng của ITR lên đƣờng kính tế bào. 5.2.2 Secoisolariciresinol Kết quả phƣơng pháp đếm tế bào cho thấy SSR không có ảnh hƣởng đến dòng tế bào DLD-1 cho tới nồng độ 160 µM (đồ thị 7), tƣơng tự với phƣơng pháp SRB (đồ thị 8), cũng không quan sát thấy ảnh hƣởng của SSR lên dòng tế bào này. Và qua hình ảnh đã chụp đƣợc bằng kính hiển vi cũng cho thấy không có sự ảnh hƣởng của SSR lên dạng hình học của tế bào, diện tích và đƣờng kính tế bào không bị thay đổi đƣợc thể hiện ở đồ thị 7, 8, 9 và bảng 9. Đồ thị 7. Sự phụ thuộc thời gian phơi nhiễm SSR trên số tế bào theo CC. 35 Đồ thị 8. Sự phụ thuộc nồng độ SSR trên số tế bào theo SRB. DMSO SSR 160 µM 48 giờ Diện tích (µm)2 473 ± 66 586 ± 75 Bảng 9. Kết quả ảnh hƣởng của SSR lên dạng hình học của tế bào. 36 Đồ thị 9. Ảnh hƣởng của SSR lên đƣờng kính của dòng tế bào. 37 5.2.3 Resveratrol, Pterostilbene và Piceatannol Ảnh hƣởng của các stilbene lên độc tính tế bào cũng đƣợc khảo sát bằng hai phƣơng pháp đếm (đồ thị 10) và SRB (đồ thị 11), kết quả cho thấy ảnh hƣởng mạnh của các chất RES và PTS lên dòng tế bào DLD-1, ngƣợc lại PI cho ảnh hƣởng rõ nét khi nồng độ lên tới 60 µM. Kết quả phân tích bằng phƣơng pháp đếm cho thấy ảnh hƣởng đáng kể của RES 120 µM, PTS 60 µM, và PI 120 µM ở thời gian khảo sát là 24 giờ. Kéo dài thời gian ủ tới 48 giờ, RES 30 µM, PTS 15 µM, PI 60 µM thể hiện ảnh hƣởng đáng kể tới dòng tế bào DLD-1 (kết quả thể hiện ở hình 11). Thứ tự kết quả trên cũng phù hợp với phƣơng pháp SRB, giá trị IC50 ở 48 giờ của RES, PTS, và PI đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đếm lần lƣợt là 30.8 µM, 29.0 µM, và 64.3µM. Và kết quả này hơi khác so với phƣơng pháp SRB có IC50 lần lƣợt là 76.3 µM, 44.6 µM, và 117.9 µM. 38 Đồ thị 10. Sự phụ thuộc thời gian vào số tế bào phát triển dƣới sự phơi nhiễm các chất RES, PTS, PI tƣơng ứng với hình (A), (B), (C) theo phƣơng pháp CC. 39 Đồ thị 11. Sự phụ thuộc nồng độ của các chất phơi nhiễm RES, PTS và PI vào số tế bào tƣơng ứng ở các hình (A), (B), (C) theo phƣơng pháp SRB. 40 Khảo sát ảnh hƣởng của các chất lên dạng hình học của tế bào, kết quả bảng 10 và đồ thị 12 cho thấy ảnh hƣởng rõ nét của RES lên đƣờng kính tế bào. Hình dạng tế bào bị dãn rộng ra, nên diện tích tế bào cũng tăng lên. 48 giờ DMSO RES 30 µM Diện tích (µm)2 468 ± 46 1070 ± 93 Bảng 10. Ảnh hƣởng của RES lên dạng hình học của tế bào. Đồ thị 12. Ảnh hƣởng của RES trên đƣờng kính của tế bào. 41 Trong khi đó, PTS cho thấy sự ảnh hƣởng lên hình dạng tế bào, làm tăng kích thƣớc tế bào, tuy nhiên đƣờng kính không có sự thay đổi đáng kể đƣợc thể hiện qua bảng kết quả 11 và đồ thị 13 bên dƣới. 48 giờ DMSO PTS 30 µM Diện tích (µm)2 433 ± 32 718 ± 28 Bảng 11. Ảnh hƣởng của PTS lên dạng hình học của tế bào. Đồ thị 13. Ảnh hƣởng của PTS lên đƣờng kính của tế bào. Ngƣợc lại, PI cho thấy có ít ảnh hƣởng lên hình dạng và kích thƣớc tế bào ở bảng 12 và đồ thị 14. 42 48 hr DMSO PI 60 µM Area(µm)2 513 ± 33 604 ± 74 Bảng 12. Ảnh hƣởng của PI lên dạng hình học của tế bào. Đồ thị 14. Ảnh hƣởng của PI lên đƣờng kính của tế bào. 5.2.4 Tóm tắt kết quả nghiên cứu độc tính tế bào Kết quả nghiên cứu độc tính tế bào trên 2 phƣơng pháp CC và SRB đƣợc tóm tắt ở bảng 13 sau: 43 Chất Cấu trúc hóa học CC IC50 (µM) SRB IC50 (µM) Isotaxiresinol CTPT: C19H2206 KLPT: 346.37 OMe HO HO OH OH OH R S R 204.7 225.4 Secoisolariciresinol CTPT: C20H2606 KLPT: 362.42 OMe OMe OH HO OH HO R R KPH KPH Resveratrol CTPT: C14H1203 KLPT: 228.24 OH HO OH E 30.8 76.3±2.6 Pterostilbene CTPT: C16H1603 KLPT: 256.30 OMe MeO OH E 32.8±4.3 44.6±1.9 44 Piceatannol CTPT: C19H2206 KLPT: 346.37 OH OH OH HO E 64.3 117.9±7.9 Bảng 13. Tóm tắt kết quả nghiên cứu độc tính tế bào theo phƣơng pháp CC và SRB. Nhận xét:  Độc tính tế bào của các chất ITR, SSR, RES, PTS, PI đƣợc liệt kê ở bảng tóm tắt kết quả nghiên cứu độc tính tế bào. Trong hai hợp chất lignan nghiên cứu, chỉ có ITR ảnh hƣởng lên sự phát triển của tế bào nhƣng ở nồng độ khá lớn. Do đó, ảnh hƣởng này đƣợc xem xét là không đáng kể. Bên cạnh đó, SSR cũng không cho thấy sự ảnh hƣởng lên quá trình phát triển của tế nào.  Cả ba stilbene khảo sát trong nghiên cứu này đều có cấu trúc mang nhóm hydroxyl ở vị trí 4’ trên vòng B, do đó có thể khẳng định nhóm có vai trò quan trọng đối với hoạt tính sinh học của các chất này. Bên cạnh đó, hoạt tính của PTS mạnh hơn RES là do sự methyl hóa các nhóm hydroxyl ở các vị trí 3,5 trên vòng A. Các nhóm này có thể đóng góp chủ yếu cho hoạt tính tiền chu trình chết của tế bào. Hai nhóm thế dimethoxy này làm giảm khả năng phân cực của PTS so với RES. Điều này có thể đƣợc chứng minh qua giá trị hệ số phân bố octanol-nƣớc (Log P) cho PS (LogP = 4.23) cao hơn RES (LogP = 4.01). Do đó, độ không phân cực của PTS càng lớn thì có thể dễ dàng thẩm thấu qua màng tế bào hơn so với RES, điều này liên quan tới khả năng gây độc đối với tế bào. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây, và chứng tỏ rằng cấu trúc dimethoxy làm tăng đáng kể khả năng gây độc cho tế bào trong cấu trúc stilbene.