Luận văn Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải coker312 và vn36p bằng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

1 CHƢƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Bông vải (Gossypium hirsutum.L) là cây trồng lấy sợi quan trọng hàng đầu để thoả mãn một trong những nhu cầu bức thiết của con người là mặc, đồng thời cũng là cây lấy dầu từ hạt quan trọng thứ hai trên thế giới sau cây đậu tương (Nobre và ctv, 2001). Cây bông vải được trồng khắp nơi trên thế giới. Trong các nước trồng bông vải thì Ấn Độ là nước sản xuất bông vải lớn nhất, đứng đầu về diện tích (khoảng 9,7 triệu ha) chiếm 32%, kế đến là Mỹ chiếm 24% và Trung Quốc chiếm 20% diện tích trồng bông vải toàn cầu (Satyavathi và ctv, 2002). Ở Việt Nam nghề trồng bông vải có từ ngàn xưa và từng là loại cây trồng quan trọng ở vùng Duyên Hải Trung Bộ trong thời kỳ kháng chiến chống Pháp. Sau năm 1975, nhà nước ta nhiều lần cố gắng tổ chức trồng bông ở đây nhưng không thành công do giá cả thị trường bấp bênh và không phòng trừ được sậu đục quả bông một cách hiệu quả dẫn đến người trồng bông thua lỗ, diện tích trồng bông không thể phát triển được. Trong những năm gần đây, do áp dụng những tiến bộ khoa học và công nghệ đã cho ra đời các giống bông lai kháng sâu và có năng suất cao để đưa vào sản xuất. Tuy nhiên sản lượng bông xơ chỉ đáp ứng một phần nhỏ (10 - 15%) nhu cầu nguyên liệu cho ngành dệt may. Dự kiến đến năm 2010, sản lượng bông xơ đáp ứng 20% nhu cầu trong nước, đưa diện tích trồng bông tăng lên 1 triệu ha, tập trung ở vùng Duyên Hải Miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ và Đồng Bằng Sông Cửu Long ( Bộ Nông Nghiệp và PTNT, 2003). Từ lâu người ta đã quan tâm nhiều đến việc cải thiện đặc tính di truyền của các loài cây bông vải. Mặc dù có nhiều giống bông vải tốt được tạo ra theo các phương pháp lai tạo và chọn lọc truyền thống, nhưng dường như các giống bông đó khó có thể khai thác được các nguồn gen có lợi một cách hiệu quả. Việc ứng dụng công nghệ di truyền thực vật có thể thúc đẩy việc tạo ra các giống cây bông có nhiều đặc tính ưu việt về đặc tính nông học như tính kháng sâu bệnh hại, thuốc diệt cỏ và tính chống chịu với các đều kiện bất lợi của môi trường (rét, khô hạn, phèn, mặn…) và các tính trạng số lượng cũng như chất lượng của bông và sợi (Gasser và Fraley, 1992). 2 Trong thập kỷ qua, các nổ lực nghiên cứu chuyên sâu đã từng tập trung trên cây bông vải và các gen quy định các đặc tính nông học tốt đã được chuyển nạp bằng phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium (Perlak và ctv, 1990; Thomas và ctv, 1995; Satyavathi và ctv, 2000). Cây bông vải đã được xem là cây khó có thể chuyển nạp gen và chỉ sau khi các giống nhóm bông vải Coker được phát hiện là đáp ứng tốt cho sự chuyển nạp gen (Nobre và ctv, 2001) thì các gen mong muốn đều được chuyển vào nhóm giống này và sau đó hồi giao với các giống bông khác. Ngoài sự giới hạn về kiểu gen, một số cây tái sinh từ mô sẹo có hình thái dị thường do biến dị soma cho nên sự cải tiến phương pháp nuôi cấy để tạo ra hệ thống tái sinh hiệu quả là cần thiết. Các phương pháp chọn tạo giống truyền thống và các kỹ thuật công nghệ sinh học tiến bộ gần đây (bao gồm các quy trình nuôi cấy mô và chuyển nạp gen) đã và đang được ứng dụng vào việc chọn tạo giống bông vải (Nobre và ctv, 2001). Trong chuyển nạp gen ở cây trồng, hệ thống thanh lọc cây biến đổi gen thông dụng nhất là sử dụng thuốc kháng sinh và thuốc diệt cỏ (Christou, 1997). Việc sử dụng các hệ thống chọn lọc này gây nhiều lo ngại về tính an toàn của cây trồng biến đổi gen đối với con người và môi trường. Nhằm khắc phục vấn đề này, phương pháp chọn lọc mới thộng qua thanh lọc bằng đường mannose được áp dụng. Hệ thống thanh lọc này dựa trên enzyme phosphomannose isomerase mã hoá bởi gen pmi được phân lập từ vi khuẩn E. coli. Enzyme này đóng vai trò trong việc chuyển hóa đường mannose làm nguồn carbon cho các hoạt động biến dưỡng trong sinh vật và các tế bào thực vật biến đổi gen (Hoa và Bong, 2003). Hiện nay ở Việt Nam, các hệ thống tái sinh cây bông vải qua mô sẹo chưa được thực hiện thành công và việc chuyển gen chỉ được thực hiện bằng vi tiêm vào ống phấn và chuyển trực tiếp trên đỉnh chồi (Lê Trần Bình, 2001). Phương pháp chuyển gen này tuy có hiệu quả nhưng sự biểu hiện của các gen chuyển nạp trên cây không được hoàn toàn, tạo ra các thể khảm gây khó khăn cho việc phân tích và thu nhận cây chuyển gen sau này. Sự thu nhận cây chuyển gen tái sinh qua con đường sinh phôi thể hệ từ các tế bào sinh phôi là các phương pháp được ưu chuộng hiện nay (Chen và ctv, 2000). Cho đến nay chưa có một nghiên cứu nào được thực hiện để tìm hiểu khả năng chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên các giống bông vải đang trồng ở Việt Nam. Vì vậy việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của ba giống bông vải Coker 312 và VN36P bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ” là một vấn đề cần thiết 3 1.2. Mục tiêu của khóa luận Tìm hiểu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải Coker 312 và VN36P bằng phương pháp vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và hệ thống chọn lọc bằng mannose để thanh lọc mô sẹo sau khi được chuyển nạp. 1.3. Hạn chế của khóa luận Do thời gian thực hiện ngắn nên khóa luận chỉ thực hiện xong giai đoạn thanh lọc (qua 3 vòng) mô sẹo đã được chuyển nạp gen trên hai giống Coker312 và VN36P. Giai đoạn thử nghiệm sự biểu hiện gen chỉ thị gus (β-glucuronidase) tạm thời các mô sẹo đã qua thanh lọc chưa có điều kiện thực hiện. 4 CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Sơ lƣợc về cây bông vải 2.1.1. Vị trí phân loại Cây bông vải thuộc Ngành hiển hoa bí tử (Angiospermatophyta), Lớp song tử diệp (Dicotyledoneae), Họ Malvaceae, Chi Gossypium (Hộ, 1997). 2.1.2. Tính đa dạng, nguồn gốc và phân bố Chi Gossypium rất đa dạng, có 39 loài, trong đó có 5 loài được trồng phổ biến trên thế giới (Hộ, 1997), và có 3 loài được trồng ở Việt Nam: G. arboreum, G. hirsutum, G. barbadense. 2.1.2.1. Gossypium arboreum Loài G. arboretum (loài bông Cỏ) có nguồn gốc từ châu Á, có mặt và gắn liền với nghề trồng bông ở nước ta từ lâu. Các giống bông Cỏ có dạng hình thoáng, thân mảnh, lá nhỏ, lông ít, rễ cộc nhỏ với bộ rễ ăn nông, chịu được mưa, cuống quả dài rủ xuống, đầu quả quay xuống đất, vỏ quả mỏng, chín sớm, hạn chế được hiện tượng thối quả khi gặp mưa lúc bông nở. Về phẩm chất xơ bông Cỏ : thô, tỉ lệ xơ thấp, độ mịn kém. Trong khoảng thế kỷ XIII – XIV, loài bông này được trồng phổ biến khắp mọi miền đất nước. Các giống bông Cỏ hiện có ở Việt Nam thuộc 2 loài phụ: G. arboreum ssp neglectum và G.arboreum ssp nanking (Lê Quang Quyến, 2004). 2.1.2.2. Gossypium hirsutum Loài Gossypium hirsutum (loài bông Luồi) thường là cây hàng năm, cây cao, lá to, mặt lá phẳng. Cành lá khỏe, số lượng lá nhiều, quả tròn, mặt quả nhẵn, trọng lượng hạt bông trung bình trong một quả đạt 5 - 6g. Loài G. hirsutum xuất xứ từ Trung Mỹ, du nhập vào Việt Nam khoảng cuối thế kỷ XIX đầu thế kỷ XX. Loài này có khả năng thích ứng rộng, phù hợp với đều kiện trồng nhờ nước trời ở nước ta, với tiềm năng cho năng suất cao và có chất lương xơ tốt, các giống bông này dần thay thế các giống bông Cỏ trước đó. Bông Luồi được trồng nhiều nhất ở Mỹ, Nga, Ấn Độ, Mêhico, Trung Quốc, Braxin… Bông Luồi 5 có nhiều loài phụ như : G.hirsutum ssp. Mexicanum, G.hirsutum ssp. punctatum, G.hirsutum ssp. panicultum… 2.1.2.3. Gossypium barbadense Loài Gossypium barbadense còn gọi là bông Hải Đảo, cây tương đối to, chín muộn, lá to, khía sâu, màu xanh đậm. Thân cành lá gần như không có lông, đài không có răng cưa rõ rệt và thường chỉ gợn hình làn sóng. Hạt thường nhẵn, không có xơ ngắn, xơ dài màu trắng hoặc cà phê sữa. Loài G. barbadense có nguồn gốc từ Nam Mỹ, nay được trồng nhiều ở Nga, Mỹ, Ai Cập và một số nước khác. Loài này thường gặp dưới dạng cây bông lâu năm ở trong các vườn hoang và bờ dậu. Bông Hải Đảo chỉ thích hợp trong vụ khô có tưới, không thích hợp với đều kiện mưa nhiều, độ ẩm cao. Bông Hải Đảo có nhiều loài phụ như: G. barbadense ssp. darwinii, G. barbadense ssp. ruderale, G. barbadense ssp. ventiforlum. Hiện nay loài này được nghiên cứu trong chương trình tạo giống bông lai giữa bông Luồi với bông Hải Đảo nhằm mục đích khai thác khả năng cho năng suất cao của bông Luồi kết hợp với chất lượng xơ tốt của bông Hải Đảo. 2.1.2.4. Gossypium herbaceum Loài này phân bố chủ yếu ở các sa mạc, khí hậu khô nóng như vùng Trung Á, Tây Bắc Trung Quốc, Châu Phi, chưa thấy trồng ở Việt Nam. 2.1.2.5. Gossypium tricuspidatum Loài này khá giống loài G. hirsutum, cây và lá to, chín hơi muộn, xơ dài và mịn. Loài này đòi hỏi đất tốt, nhiều nước, nhiệt độ cao, chống chịu sâu bệnh khá và được trồng nhiều ở Nam Mỹ. Loài bông này không có ở Việt Nam 2.1.3. Tình hình sản xuất bông vải ở Việt Nam Trước thời Pháp thuộc, giống bông vải được sử dụng chủ yếu là các giống bông Cỏ địa phương (Gossypium arboreum). Giống bông này cho năng suất thấp. Một số ít diện tích ở Trung Bộ và Nam Bộ đã được trồng các giống bông Luồi (Gossypium hirsutum) nhập nội với năng suất đạt 300 – 500 kg/ha. Đầu thế kỷ 20, nước ta đã xuất khẩu bông sang Nhật, Hồng Kông. Trong thời kỳ kháng chiến chống Pháp, diện tích trồng bông đã được phát triển mạnh, trong đó liên khu V đạt khoảng 10000 ha và liên khu IV đạt khoảng 13000 ha. 6 Sau năm 1954, các giống bông Luồi nhập nội được thay thế một phần cho giống bông Cỏ địa phương. Sau ngày đất nước thống nhất, xuất phát từ nhu cầu cấp thiết về nguyên liệu bông xơ cho ngành Dệt May, Đảng và nhà nước ta có chủ trương đẩy mạnh việc phát triển cây bông ở vùng Duyên hải Miền Trung và Tây Nguyên. Tuy nhiên việc phát triển bông theo kế hoạch không thưc hiện được do: i. Tổ chức sản xuất trên cơ sở kế hoạch tập trung giao cho Hợp tác xã Nông nghiệp và các Nông trường quốc doanh, theo cơ chế bao cấp, kém năng động, nên không phát huy hết sức mạnh và nguồn lực toàn dân. ii. Sâu bệnh gây hại ở tất cả các vùng trồng bông, mùa khô không đủ nước tưới, dẫn đến người trồng bông thua lỗ, các nông trường bị giải thể, diện tích bông không thể phát triển được. iii. Chưa có giống bông phù hợp với từng đều kiện sinh thái và kháng sâu bệnh. Chưa có hệ thống cơ sở hạ tầng cho việc phát triển bông, như hệ thống thuỷ lợi đồng bộ ( Lê Kim Hỷ, 2003; Lê Quang Quyến, 2004.). Sau năm 1990, Nhà nước ta chủ trương phát triển bông dựa vào các hộ nông dân, nền sản xuất bông chuyển hướng từ tập trung sang phân tán trong đều kiện mùa mưa nhờ nước tưới trời nhằm giảm áp lực sâu hại, do đó diện tích bông được nhanh chóng mở rộng và năng suất được nâng lên bình quân khoảng 7- 8 tạ/ha (Lê Kim Hỷ, 2003; Lê Quang Quyến, 2004). Từ sau những năm 1990, ngành bông Việt Nam có những bước thay đổi mạnh mẽ, chúng ta đã tạo được các giống bông, đặc biệt là các giống bông lai có năng suất cao, chất lượng xơ tốt, chống chịu được sâu bệnh. Hàng loạt các tiến bộ kỹ thuật được áp dụng như: áp dụng biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp giúp giảm chi phí thuốc bảo vệ thực vật, các biện pháp kỹ thuật canh tác khác như hệ thống luân canh xen canh hợp lý, phủ màng PE cho bông, phun các chất đều hòa tăng trưởng… chính vì vậy mà năng suất và chất lượng bông xơ tăng, nghề sản xuất bông cho hiệu quả kinh tế cao. Hiện nay, diện tích đã đạt hơn 35000 ha, năng suất đạt hơn 11 tạ/ha, tăng gấp hai lần so với bình quân trước đây (Bảng 2.1). 7 Bảng 2.1. Diễn biến tình hình sản xuất bông ở Việt Nam trong những năm qua. (Nguồn: Lê Quang Quyến, 2004). Niên Vụ Diện tích (ha) Năng suất (tạ/ha) Sản lượng (tấn) 1996/1997 1997/1998 1998/1999 1999/2000 2000/2001 2001/2002 2002/2003 10676 11716 19963 17705 13250 29573 35200 6 9 8 10 9 11 10,5 6866 10986 16245 17578 20340 32530 36960 2.1.4. Tình hình sản xuất bông trên thế giới Vụ bông 2001- 2002 tổng diện tích bông trên thế giới là 33,457 triệu ha, trong đó các nước đang phát triển chiếm 70% diện tích và các nước phát triển chỉ chiếm có 30% diện tích. Trong mười nước có diện tích trồng bông lớn nhất thế giới (Bảng 2.2), thì Ấn Độ dẫn đầu với diện tích là 8,7 triệu ha, tiếp theo là Mỹ 5,6 triệu ha, Trung Quốc 4,8 triệu ha và Pakistan 3,1 triệu ha (ISAAA, 2002). Sản lượng bông thế giới đã tăng từ 9,8 triệu tấn niên vụ 1960/1961 lên 21,2 triệu tấn niên vụ 2001/2002. Trong mười nước có sản lượng bông lớn nhất thế giới (bảng 2.3) thì Trung Quốc dẫn đầu với 5,3 triệu tấn, tiếp theo là Mỹ 4,4 triệu tấn, Ấn Độ 2,5 triệu tấn. Điều đặc biệt là trong mười nước có sản lượng bông cao nhất thế giới thì có sáu nước là các nước đang phát triển. Về năng suất Australia dẫn đầu với năng suất là 1658 kg bông xơ/ha, tiếp theo là Syria 1303 kg bông xơ/ha và Trung Quốc 1103 kg bông xơ/ha (ISAAA, 2002). Trong khi đó, diện tích trồng bông chuyển gen trên thế giới ngày càng gia tăng. Diện tích trồng bông trên thế giới năm 2004 là 32 triệu ha, trong đó bông chuyển gen chiếm 28% . So với năm 2003 diện tích bông chuyển gen tăng 11% (9 triệu ha trong năm 2004 so với 7,2 triệu ha trong năm 2003). Trong số các nước trồng bông chuyển gen, Ấn Độ là nước có diện tích trồng bông chuyển gen tăng nhanh nhất thế giới (tăng 400% so với năm 2003). Năm 2003, Ấn Độ chỉ có 100 ngàn ha bông chuyển gen nhưng năm 2004 diện tích bông chuyển gen tăng lên 500 ngàn ha. Trung Quốc cũng là nước có sự gia tăng diện tích trồng bông chuyển gen đáng chú ý: năm 2003 có 2,8 triệu ha nhưng năm 2004 đã tăng lên 3,7 triệu ha (chiếm 60% diện tích bông). Theo dự báo của các chuyên gia thì diện tích trồng 8 bông chuyển gen trên thế giới sẽ tiếp tục gia tăng trong những năm tới và hướng chuyển gen vào cây bông sẽ tập trung vào việc tạo ra các giống bông kháng sâu bệnh là chủ yếu (James, 2004) Bảng 2.2. Mười nước có diện tích trồng bông lớn nhất thế giới năm 2001- 2002. (ISAAA, 2002) STT Quốc gia Triệu ha 1 Ấn Độ 8,730 2 Mỹ 5,596 3 Trung Quốc 4,824 4 Pakistan 3,125 5 Uzbekistan 1,453 6 Brazil 0,750 7 Thổ Nhĩ Kỳ 0,654 8 Turkmenistan 0,550 9 Mali 0,516 10 Benin 0,415 TỔNG CỘNG 26,613 Diện tích trồng bông của thế giới 33,457 Nguồn: ICAC, 2002 ( 9 Bảng 2.3. Mười nước có sản lượng bông cao nhất thế giới năm 2001 – 2002. (ISAAA, 2002) STT Quốc gia Sản lượng (triệu tấn) Năng suất bông xơ (Kg/ha) 1 Trung Quốc 5,320 1103 2 Mỹ 4,420 790 3 Ấn Độ 2,508 287 4 Pakistan 1,853 593 5 Uzbekistan 1,055 726 6 Thổ Nhĩ Kỳ 0,880 1345 7 Brazil 0,750 999 8 Úc 0,670 1658 9 Syria 0,335 1303 10 Ai Cập 0,314 944 Tổng Cộng 18,105 980 Các quốc gia khác 3,132 Sản lượng toàn thế giới 21,237 635 Nguồn: ICAC, 2002 2.2. Một số nghiên cứu chuyển nạp gen ở bông vải Hiện nay có nhiều phương pháp chuyển nạp gen khác nhau nhưng phổ biến là chuyển nạp gen trực tiếp bằng súng bắn gen với vật liệu nuôi cấy là đỉnh chồi phân sinh hoặc từ tế bào huyền phù (McCabe và Martinell, 1993; Rajasekaran và ctv, 2000), phương pháp chuyển nạp gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens (Umbeck và ctv, 1987; Rajasekaran và ctv, 1996; Satyavathi và ctv, 2002). Chuyển nạp gen nhờ Agrobacterium tumefaciens ở bông vải thành công đã được công bố lần đầu tiên vào những năm 1980 (Firoozabady và ctv, 1987; Umbeck và ctv, 1987) với mẫu cấy là trụ hạ diệp và tử diệp. Từ đó nhiều gen được chuyển thành công vào cây bông nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, bao gồm các gen kháng côn trùng và gen kháng thuốc diệt cỏ (Perlak và ctv, 1990; Chen và ctv, 1994). Các loại mẫu cấy như trụ hạ diệp, tử diệp, mô sẹo từ trụ hạ diệp và tử diệp cũng như phôi non đã được dùng trong việc chuyển 10 gen nhờ Agrobacterium tumefaciens hay nhờ súng bắn gen (Firoozabady và ctv, 1987; Perlak và ctv, 1990). Ngoài ra còn có các mô phân sinh phân lập từ trục phôi đã được sử dụng cho việc chuyển gen bằng súng bắn gen ở bông vải (Chlan và ctv, 1995). Tuy nhiên tỉ lệ chuyển gen thường khá thấp, khoảng 20 - 30% khi trụ hạ diệp được dùng làm mẫu cấy (Firoozabady và ctv, 1987; Rajasekaran và ctv, 1996). Một hiệu quả chuyển gen cao hơn có ý nghĩa (đến 60%) đã được công bố khi trụ hạ diệp được dùng làm mẫu cấy và gen onc (mã hóa cho enzyme tổng hợp octopin-octopin synthase) được dùng làm gen chỉ thị (Firoozabady và ctv, 1987). Nhưng chỉ là kết quả của sự thử nghiệm sự biểu hiện gen tạm thời của gen onc. Một báo cáo gần đây cho rằng hiệu quả chuyển nạp gen ở song tử diệp chỉ khoảng 20 -30% (Cousins và ctv,1991), hiệu quả chuyển nạp gen thậm chí còn thấp khi sử dụng phương pháp bắn gen (Keller và ctv, 1997. Sự khác biệt giữa các loại mẫu cấy được dùng trong chuyển nạp gen có thể ảnh hưởng có ý nghĩa đến hiệu quả của chuyển nạp gen và sự tái sinh, một số nhà nghiên cứu cho rằng để giảm thiểu các thể chuyển nạp gen dương tính giả, tử diệp là mẫu cấy tốt hơn trụ hạ diệp (Firoozabady và ctv, 1987). Sunilkumar và Rathore (2001) đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển nạp gen trên cây bông vải bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho thấy các yếu tố như chủng vi khuẩn, acetosyringone và nhiệt độ trong chuyển gen có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả chuyển gen. Thêm vào đó kích thước mẫu cấy cũng ảnh hưởng đến sự sống sót của các mẫu cấy trên môi trường chọn lọc (Sunilkumar và Rathore, 2001). Sự chuyển nạp gen cũng phụ thuộc vào kiểu gen. Chỉ có một số giống nhất định mới có khả năng tái sinh và chuyển nạp như giống bông Luồi Coker 312 và Jin 7, còn hầu hết các giống khác thường khó có thể tái sinh và chuyển nạp được. Thiếu phương pháp tái sinh cây hiệu quả cũng được xem như là một rào cản chính cho việc áp dụng phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens ở bông vải (Firoobady và ctv, 1987). Để cải tiến phương pháp chuyển nạp, một quy trình chuyển gen hiệu quả cao dùng cuống lá và trụ hạ diệp cây mầm làm mẫu cấy được phát triển, cùng với môi trường nuôi cấy được cải tiến thích hợp. Hiện nay, Trung Quốc đã thành công trong việc chuyển nạp gen vào cây bông vải bằng phương pháp tiêm DNA qua ống phấn, nhưng phương pháp này gặp khó khăn trong việc xác định cây chuyển gen vì rất nhiều cây được tạo thành nhưng chỉ một số ít cây được chuyển nạp gen (Chen và ctv, 2000). 11 2.3. Chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Chuyển nạp gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào bộ gen của sinh vật đang nghiên cứu. Những thành tựu của kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã mở ra triển vọng đối với chuyển nạp gen ở thực vật bậc cao, tạo ra những tính trạng di truyền mới như kháng sâu bệnh hại, thuốc diệt cỏ… Sự chuyển nạp gen thành công trên cây trồng đã được ghi nhận bằng cách sử dụng plasmid Ti, thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để đưa gen mong muốn vào trong bộ gen cây trồng. Phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để chuyển nạp gen còn được gọi là phương pháp chuyển nạp gen gián tiếp. 2.3.1. Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Giống Agrobacterium được chia làm một số loài dựa trên triệu chứng gây bệnh và kí chủ. Một số loài thuộc chi Agrobacterium như: A. radiobacter ( loài nay không gây bệnh cho cây), A. tumefaciens và A. rhizogens gây bệnh khối u và bệnh cổ rễ… (Jiang, 2004) Hình 2.1. Khối u do Agrobacterium tumefaciens gây ra trên thực vật. A: một khối u lớn trên thân cây hoa Hồng; B: các khối u trên cành Nho (Deacon và ctv, 2005). Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hình que, gram âm, có khả năng di động, không sinh bào tử và có quan hệ gần gũi với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium (Deacon và ctv, 2005). Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hiếu khí, có 5- 11 lông roi, vi khuẩn này phát triển tối ưu ở nhiệt 29oC trong môi trường có bổ sung mangan và succinate như là nguồn cacbon duy nhất (Domer, 1999). Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn gây bệnh khối u trên cây (chủ yếu là cây hai lá mầm) khi xâm nhiễm vào cây. Bộ nhiễm sắc thể vi khuẩn Agrobacterium tumefa