Luận văn Nghiên cứu khả năng đáp ứng phát sinh hình thái của lát mỏng tế bào phát hoa đồng tiền (gerbera jamesonii) trong điều kiện in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------------o0o----------- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG PHÁT SINH HÌNH THÁI CỦA LÁT MỎNG TẾ BÀO PHÁT HOA ĐỒNG TIỀN (Gerbera jamesonii) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã ngành : 111 GVHD: CN. BÙI VĂN THẾ VINH SVTH : ĐẶNG LÂM TRÚC MSSV : 105111070 Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2009 1. Đầu đề Đồ án tốt nghiệp: “Nghiên cứu khả năng đáp ứng phát sinh hình thái của lát mỏng tế bào phát hoa đồng tiền (Gerbera jamesonii) trong điều kiện in vitro” 2. Nhiệm vụ (yêu cầu về nội dung và số liệu ban đầu): ™ Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch Javel. ™ Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy phát hoa Đồng tiền. ™ Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy phát hoa Đồng tiền. ™ Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA lên khả năng tái sinh chồi 3. Ngày giao Đồ án tốt nghiệp: 01/04/2009 4. Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 24/06/2009 5. Họ tên người hướng dẫn Phần hướng dẫn CN. Bùi Văn Thế Vinh Toàn bộ Nội dung và yêu cầu LVTN đã được thông qua Bộ môn. Ngày tháng năm 2009 CHỦ NHIỆM BỘ MÔN NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC KTCN TPHCM CỘNG HOÀ Xà HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP - TỰ DO – HẠNH PHÚC ------------------------ KHOA : MÔI TRƯỜNG & CNSH BỘ MÔN : CNSH NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HỌ VÀ TÊN : ĐẶNG LÂM TRÚC MSSV : 105111070 NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP : 05DSH PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN Người duyệt (chấm sơ bộ): ……………………… Đơn vị:…………………………………………… Ngày bảo vệ:…………………………………….. Điểm tổng kết:…………………………………… Nơi lưu trữ Đồ án tốt nghiệp: Lời cảm ơn Cuối cùng tôi cũng được đặt chân vào trường Đại học, đó không chỉ là mong ước của chính bản thân mà còn là điều kỳ vọng của những người thân của tôi. Và mục tiêu kế tiếp là được như các đàn anh được làm luận văn tốt nghiệp. Ngay lúc này đây, tôi vẫn còn đang “sợ” vì không biết mình có được bảo vệ đề tài hay không? Đơn giản, chỉ vì khả năng làm luận văn còn quá tệ để mà … Câu viết xin được bỏ ngõ, thay vào đó tôi sẽ cố gắng – cố gắng hơn nữa. Đề tài của mình sẽ là gì ??? Tôi vẫn chưa biết chính xác trong khi luôn ao ước là được làm luận văn. Nhưng thật may mắn, Đại học năm thứ 3 tôi cũng đã chọn được cho mình hướng đi khi được học môn Công nghệ thực vật. Biết được Thầy, người truyền đạt kiến thức và khơi dậy niềm yêu thích từ lâu trong bản thân mình. Không biết nói gì hơn, người học trò này xin chân thành cảm ơn thầy –Tiến sĩ Dương Tấn Nhựt, tuy chưa lần nào được gọi trực tiếp là thầy, nhưng tôi vẫn luôn mong mỏi điều đó. Vì thầy đã là người khơi dậy niềm đam mê nghiên cứu khoa học từ một người học trò mà lẽ ra chỉ yêu thích Công nghệ thông tin… Chính nhờ thầy mà giờ đây, em đã may mắn được học hỏi từ người học trò ấy. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến Thầy – Bùi Văn Thế Vinh, người hiện đang dẫn dắt và hướng dẫn tận tình không những cho em mà còn 3 người học trò khác nữa. Để có thể viết ra cuốn luận văn này, em xin cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Kỹ Tthuật Công Nghệ và thầy cô phòng thí nghiệm đã tạo mọi điều kiện để em có thể hoàn thành đề tài này. Tôi cũng cám ơn các bạn, những người đã gắn bó cùng tôi trong những tháng vừa qua tại phòng thí nghiệm, đó sẽ luôn là kỷ niệm hạnh phúc trong tôi : Hiền, Xuân, Quyên cám ơn các bạn nhé. Ngoài ra, người đã luôn ủng hộ tôi trong những lúc chán nản sau khi gặp nhiều thất bại khi làm luận văn, đó là Phúc, người bạn thân nhất của tôi. Vẫn còn nhiều lời cảm ơn mà tôi thực sự muốn gủi đến như bạn Trinh, Cẩm, Khánh Linh và thầy Thành nữa, nhờ thầy mà không khí ở phòng thí nghiệm thực vật “bùn tẻ” này đã trở nên vui nhộn và ấm áp. Cuối cùng, con xin cảm ơn ba mẹ nhiều lắm, điều mà có lẽ con chưa bao giờ nói ra : con yêu ba mẹ và nhóc con “lớn xác”- nhỏ em cũng như người bạn của tôi. Đồng Nai, tp. Biên Hòa ngày 29 tháng 6 năm 2009 Đặng Lâm Trúc MỤC LỤC Lời cảm ơn Mục lục Danh mục chữ viết tắt .............................................................................................. i Danh mục bảng ........................................................................................................ii Danh mục hình........................................................................................................iii Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề ...................................................................................................1 1.2. Mục đích, nội dung nghiên cứu ......................................................................1 1.2.1. Mục đích ........................................................................................................1 1.2.2. .Nội dung ........................................................................................................1 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Khái quát về kỹ thuật vi nhân giống..............................................................2 2.1.1. Khái niệm.......................................................................................................2 2.1.2. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô ...............................................................2 2.1.3. Các bước nhân giống in vitro..........................................................................2 2.1.4. Quá trình tái sinh cơ quan trong vi nhân giống in vitro ...................................6 2.1.4.1. Sự hình thành chồi bất định ..........................................................................7 2.1.4.2. Sự hình thành rễ bất định..............................................................................9 2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái in vitro ..............................11 2.1.5.1. Ảnh hưởng của mẫu cấy.............................................................................11 2.1.5.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và phát triển của thực vật ..........14 2.1.6. Các chất khử trùng hóa học được dùng trong nuôi cấy mô............................15 2.2. Kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào ..............................................................17 2.2.1. Giới thiệu .....................................................................................................17 2.2.2. Định nghĩa hệ thống lớp mỏng tế bào ...........................................................17 2.2.3. Một số nghiên cứu ứng dụng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào...........19 2.3. Giới thiệu chung về cây hoa Đồng tiền ........................................................21 2.3.1. Các đặc điểm quan trọng của cây hoa Đồng tiền ..........................................22 2.3.1.1. Vị trí phân loại ...........................................................................................22 2.3.1.2. Đặc điểm hình thái .....................................................................................22 2.3.1.3. Điều kiện trồng trọt ....................................................................................23 2.3.2. Một số phương pháp vi nhân giống đối với cây hoa Đồng tiền .....................25 Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. Vật liệu ......................................................................................................... 30 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................. 30 3.1.2. Mẫu cấy....................................................................................................... 30 3.1.3. Các loại môi trường..................................................................................... 30 3.1.4. Điều kiện nuôi cấy....................................................................................... 30 3.2. Phương pháp thí nghiệm............................................................................. 31 3.2.1. Khử trùng mẫu ............................................................................................ 31 3.2.2. Bố trí thí nghiệm ......................................................................................... 32 3.2.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch Javel ... 3.2.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền.......................................................................... 32 3.2.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền.......................................................................... 33 3.2.2.4. Thí nghiệm 4: : Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA lên khả năng tái sinh chồi............................................................................................................ 34 3.2.3. Phân tích thống kê ....................................................................................... 34 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch Javel 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền .......................................................................38 4.3. Thí nghiệm 3: Môi trường khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền ................................................41 4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA lên khả năng tái sinh chồi............................................................................................................44 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận.........................................................................................................48 5.2. Đề Nghị..........................................................................................................48 Phần 6 : TÀI LIỆU THAM KHẢO 6.1. Tài liệu tham khảo trong nước.......................................................................a 6.2. Tài liệu tham khảo nước ngoài.......................................................................a e Danh mục chữ viết tắt f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh e i f # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH Danh mục chữ viết tắt ¾ MS : MS medium (Murashige và Skoog, 1962) ¾ TCL : Thin cell layer ¾ tTCL : Transverse thin cell layer ¾ lTCL : Long thin cell layer ¾ ELS : Embro-like structure ¾ NAA : Naphthalene acetic acid ¾ BA : 6-benzylladenine acid ¾ TDZ : N-phenyl-N’-1,2,3-thidiazol-5-ylurea e Danh mục bảng f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh e ii f #Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH Danh mục bảng Bảng 3.1. Nồng độ Javel và thời gian khử trùng mẫu cấy Bảng3. 2. Môi trường khảo sát nồng độ BA ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền. Bảng 3.3. Môi trường khảo sát nồng độ NAA ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền. Bảng 3.4. Khảo sát nồng độ BA kết hợp với NAA đến sự ti sinh chồi của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền. Bảng 4.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian và nồng độ Javel lên mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền. Bảng 4.2. Kết quả ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền. Bảng 4.3. Kết quả ảnh hưởng của NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền. e Danh mục hình f Danh mục hình Hình 2.1. Mười hai loài thuộc họ Cúc (Asteraceae), từ các phân họ Asteroideae, Cichoriodeae và Carduoideae. Hình 2.2. Cây hoa Đồng tiền (Gerbera jamesonii) Hình 2.3. Một số loài hoa Đồng tiền trên thế giới. Hình 2.4. Cụm hoa đầu (B - C) và hoa Đồng tiền. Hình 4.1. Ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng lên sự phát sinh hình thái tTCL phát hoa Đồng tiền (Gerbera jamesonii) GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh e iii f # Đặng Lâm Trúc Khoa MT & CNSH 05DSH e Phần 1 – Mở đầu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH Phaàn 1: MÔÛ ÑAÀU e Phần 1 – Mở đầu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 1 - 1.1. Đặt vấn đề Hoa Đồng tiền (Gerbera jamesonii) là cây cảnh thuộc họ cúc (Asteraceae). Cây rất phổ biến được dùng làm cây trang trí trong sân vườn hay dùng làm cây cắt cành. Nên có tầm quan trọng về mặt thương mại, hoa Đồng tiền đứng hàng thứ năm trong số các loại hoa được cắt để bán trên thế giới (chỉ sau hoa hồng, cẩm chướng, cúc đại đóa và tulip). Ngoài ra cây còn chứa các dẫn xuất của comarin nguồn gốc tự nhiên – có tính chất chống đông máu. Nhân giống in vitro là một công cụ kỹ thuật quan trọng nhằm tạo một số lượng cây lớn mà vẫn giữ được đặc tính di truyền như cây mẹ. Trên thế giới cũng như Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về cây hoa Đồng tiền trong lĩnh vực nuôi cấy in vitro, và đã thiết kế được nhiều quy trình nhân giống số lượng lớn và đồng nhất từ mẫu ban đầu là chồi đỉnh, cuống lá, mặt lá, rễ, đế hoa, và cánh hoa. Đề tài “Nghiên cứu khả năng đáp ứng phát sinh hình thái của lát mỏng tế bào phát hoa Đồng tiền (Gerbera jamesonii) trong điều kiện in vtro” nhằm bổ sung thêm nguồn mẫu ban đầu để xây dựng một quy trình nhân giống mới từ tế bào phát hoa. Trong nghiên cứu này, mẫu cấy sử dụng là các lát mỏng tTCL được cắt từ phát hoa cây Đồng tiền. Các kết quả cho thấy được kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng tế bào phát hoa tương lai có thể dùng để nhân giống cây hoa Đồng tiền cùng với các kỹ thuật khác đã nghiên cứu thành công 1.2. Mục đích, nội dung nghiên cứu 1.2.1. Mục đích Bước đầu thực hiện nghiên cứu khả năng đáp ứng phát sinh hình thái của lát mỏng tế bào phát hoa Đồng tiền (Gerbera jamesonii) trong điều kiện in vitro . 1.2.2. Nội dung Nghiên cứu khử trùng mẫu cấy để xác định nồng độ hóa chất, thời gian khử trùng tối ưu. Nghiên cứu các nồng độ của chất điều hòa sinh trưởng ảnh hưởng lên mẫu cấy. e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH Phaàn 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 2 - 2.1. Khái quát về kỹ thuật vi nhân giống 2.1.1. Khái niệm Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng. Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hormone tăng trưởng và đường (Dương Công Kiên, 2002). 2.1.2. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa vô cùng to lớn đối với nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời nó có giá trị đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống. Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật được ứng dụng trong một số lĩnh vực như: 9 Lai tạo giữa những loài xa nhau về di truyền bằng phương pháp dung hợp (nuôi cấy tế bào trần). 9 Nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường lỏng (nuôi cầy huyền phù tế bào) trên quy mô lớn để sản xuất các hợp chất thứ cấp như alkaloid, glycoside, các steroid (dùng trong y học), chất dính dùng trong công nghiệp thực phẩm, những chất kìm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn dùng trong nông nghiệp. 9 Chọn lọc tế bào có những đặc tính mong muốn, cho phát triển thành cây con thay vì chọn lọc cây ngoài đồng ruộng (nuôi cấy tế bào đơn). 9 Sản xuất dòng cây đồng hợp tử (nuôi cấy bao phấn và túi phấn). 9 Vi nhân giống những giống cây có giá trị khoa học và thương mại. 9 Bảo quản phôi và cơ quan trong điều kiện nhiệt độ thấp. 9 Nuôi cấy phôi sinh dưỡng, phôi hợp tử. 9 Nuôi cấy quang tự dưỡng. 2.1.3. Các bước nhân giống in vitro Quá trình nhân giống in vitro được chia thành các giai đoạn sau: ¾ Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy Khi chọn cây mẹ phải chú ý xác định đúng cây cần nhân giống. Cây mẹ phải sạch bệnh và tốt nhất là chọn cây trồng trong nhà kính hoặc trong phòng tăng trưởng. e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 3 - Kết quả nhân giống tốt nhất có thể đạt được khi mẫu cấy được lấy vào thời điểm tăng trưởng mạnh nhất của cây mẹ. Mục tiêu của việc khử trùng mẫu cấy là thu được một lượng lớn các mẫu cấy vô trùng và vẫn còn khả năng tăng trưởng. Khử trùng bề mặt mẫu cấy bao gồm rửa mẫu và khử trùng mẫu cấy. Mẫu thu được phải rửa dưới vòi nước chảy từ 30 phút – 2 giờ, sau đó rửa mẫu bằng xà phòng sẽ làm giảm đáng kể nguồn lây nhiễm trên mẫu cấy. Mẫu sau khi rửa sạch sẽ được ngâm chìm trong dung dịch khử trùng để khử các nguồn lây nhiễm trên bề mặt mẫu cấy. Dung dịch thường được sử dụng để khử trùng mẫu là hypochlorite sodium 0,5 – 5,25%, cồn, hypochlorite calcium, oxy già, nitrate bạc, dung dịch bromine, chlorur thủy ngân. Khi thêm Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate) vào dung dịch khử trùng thì sẽ làm tăng hiệu quả khử trùng vì làm giảm sức căng bề mặt giữa nước và mô thực vật như vậy bề mặt mẫu tiếp xúc với chất khử trùng tốt hơn. Sau khi khử trùng mẫu cấy phải được rửa lại vài lần bằng nước cất vô trùng trong tủ cấy để rửa sạch các chất khử trùng còn bám trên bề mặt mẫu, những phần bị tổn thương phải được cắt bỏ, đồng thời mẫu cấy phải được cắt theo kích thước thích hợp. Mẫu thực vật thường bị nhiễm bên trong và có thể được khử trùng bằng cách bổ sung benomyl hoặc benlate 10mg/l trong môi trường nuôi cấy hoặc xử lý mẫu bằng các chất này trước khi khử trùng. Mẫu cấy của vài loài thực vật có thể hóa nâu hoặc đen sau vài ngày kể từ khi bắt đầu nuôi cấy. Khi bị hóa nâu thì sự tăng sinh của mẫu sẽ bị ức chế và lâu ngày mẫu sẽ chết. Hiện tượng hóa nâu này xảy ra khi trong mẫu cấy có chứa một lượng lớn tannin hoặc các hợp chất hydroxyphenol. Các mô non thường ít bị hóa nâu hơn mô trưởng thành hay mô già. Hiện tượng hoại tử hoặc hóa nâu là do hoạt động của enzyme oxidase có nhân Cu (ví dụ như polyphenoloxidase và tryosinase), nó được tổng hợp và phóng thích tùy thuộc vào vết thương trong suốt quá trình cắt và khử trùng mẫu. e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 4 - Phương pháp thường được sử dụng nhiều nhất để ngăn cản hiện tượng hóa nâu là dùng than hoạt tính để hấp thụ bớt các hợp chất phenol được tiết ra. Lượng thường dùng 0,5 – 5 g/l. Ngoài ra còn có một số chất khác như: polyvinyl pyrolidone (PVP), acid ascorbic, acid citric, L–cystein, hydrochlorite, 1,4 – ditheithreitol, glutathione và mercaptoethanol. Khi nghiên cứu enzyme phenolase người ta thấy rằng enzyme này hoạt động mạnh ở pH 6,5 và hoạt động yếu ở pH thấp. Vì vậy, nếu giảm pH thì sẽ giảm được hiện tượng hóa nâu. Tóm lại, từ kinh nghiệm thực tiễn người ta rút ra rằng để làm giảm hiện tượng hóa nâu của mẫu cấy nên: Sử dụng mẫu cấy nhỏ ở mô non. Gây vết thương trên mẫu với kích thước nhỏ nhất. Ngâm mẫu vào dung dịch acid ascorbic trong vài giờ trước khi cấy vào môi trường. Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng có lượng O2 thấp, không có ánh sáng trong 1 – 2 tuần đầu. Chuyển mẫu từ môi trường có chất kích thích sinh trưởng nồng độ thấp sang môi trường có chất kích thích sinh trưởng nồng độ cao. Chuyển mẫu liên tục trong khoảng thời gian 2 – 4 tuần kể từ khi bắt đầu nuôi cấy thì một lượng lớn các hợp chất phenol sẽ không tích tụ. Tạo thể nhân giống in vitro Mẫu nuôi cấy được cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo thể nhân giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro: thể chồi, thể cắt đốt. Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Tuy nhiên, có những loài cây trồng không có khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo. Để nhân giống, trong môi trường nuôi cấy thường bổ sung c