Luận văn Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan vanda

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TẠO HẠT NHÂN TẠO TỪ PHÔI CÂY LAN VANDA NỘI DUNG 2: KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA MYCORRHIZA TRÊN MỘT SỐ GIỐNG LAN Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003-2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HOÀNG QUÂN Thành phố Hồ Chí Minh -2007- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TẠO HẠT NHÂN TẠO TỪ PHÔI CÂY LAN VANDA NỘI DUNG 2: KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA MYCORRHIZA TRÊN MỘT SỐ GIỐNG LAN Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS.TRẦN THỊ DUNG NGUYỄN HOÀNG QUÂN ThS.TỪ THỊ MỸ THUẬN Thành phố Hồ Chí Minh -2007- ii LỜI CẢM ƠN Thành kính khắc ghi công ơn cha mẹ đã tận tụy suốt đời vì con để con có được ngày hôm nay. Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thị Dung và ThS. Từ Thị Mỹ Thuận đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm - Quý thầy cô trường Đại Học Nông Lâm - Quý thầy cô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học. Đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện luận văn này. Xin gởi lời cảm ơn đến: KS Nguyễn Thị Thu Hằng, KS Lê Hồng Thuỷ Tiên cùng tập thể cán bộ nhân viên Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học và Phòng Thực Tập Bệnh Cây trường Đại Học Nông Lâm, cùng tất cả bạn bè trong và ngoài lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài. TP. Hồ Chí Minh, Ngày 25 tháng 8 năm 2007 Sinh viên Nguyễn Hoàng Quân iii TÓM TẮT NGUYỄN HOÀNG QUÂN, sinh viên bộ môn Công Nghệ Sinh Học khoá 29, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2007 ĐỀ TÀI: NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TẠO HẠT NHÂN TẠO TỪ PHÔI CÂY LAN VANDA. NỘI DUNG 2: KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA MYCORRHIZA TRÊN MỘT SỐ GIỐNG LAN Giảng viên hƣớng dẫn: TS. TRẦN THỊ DUNG ThS. TỪ THỊ MỸ THUẬN Đề tài đƣợc tiến hành tại Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học- Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, thời gian thực hiện từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan Vanda Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ sodium alginate đến sự hình thành hạt nhân tạo. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, gồm 5 nghiệm thức, lặp lại 3 lần. Kết quả thu đƣợc ở nồng độ 30 g/l cho vỏ hạt nhân tạo tròn, đều, đẹp và tỷ lệ nẩy mầm cao. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng tạo hạt nhân tạo Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, gồm 4 nghiệm thức, lăp lại 3 lần Kết quả thu đƣợc ở môi trƣờng dinh dƣỡng ½ MS, hạt nhân tạo c ủa phôi lan Vanda cho tỷ lệ sống sót và nẩy mầm cao. iv Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trƣờng bảo quản hạt nhân tạo Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, gồm 6 nghiệm thức, 3 lần lặp lại. Môi trƣờng MS bảo quản hạt tốt nhất, cho hạt nhân tạo có tỷ lệ nẩy mầm cao nhất sau khi bảo quản. Thí nghiệm 4: Khảo sát sự nẩy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, gồm 3 nghiệm thức, 3 lần lặp lại. Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm trên bông gòn cao nhất (khoảng 100%) Nội dung 2: Khảo sát sự hiện diện của mycorrhiza trên một số giống lan Kết quả khảo sát cho thấy mycorrhiza có các dạng sau: -Sợi nấm ăn màu xanh, phân nhiều nhánh ăn xuyên qua nhiều lớp tế bào -Sợi nấm cuộn tròn trong 1 tế bào -Sợi nấm là các cuộn tròn nằm ở các tế bào, nối với nhau bằng sợi nấm Giữa các giống lan trồng, tỷ lệ hiện diện của mycorrhiza có sự khác nhau do nguồn gốc của giống v SUMMARY NGUYEN HOANG QUAN, student of Biotechnological faculty chronology 29, Nong Lam University of Ho Chi Minh City, 8 -2007. TOPIC: CONTENT 1: RESEACHING TECHNOLOGY DOES ARTIFICIAL SEED FROM SOMATIC EMBRYONIC VANDA ORCHID. CONTENT 2: EXAMINING PRESENCE OF MYCORRHIZA ON SOME ORCHID GENUS Supervisor: TRAN THI DUNG, ph.D TU THI MY THUAN, M.D Topic was doen at Biotechnological Centre- Nong Lam University of Ho Chi Minh City, doen from 3-2007 to 8-2007. CONTENT 1: RESEACHING TECHNOLOGY DOES ARTIFICIAL SEED FROM SOMATIC EMBRYONIC VANDA ORCHID. Experiment 1: Examining sodium alginate strength influenced artificial seed formation. Experimentation was set quite accident one factor, include 5 assays, 3 times repetition. Resulting in 30 g/l strength gave full, nice artificial seed shell and ratio of germination highly Experiment 2: Examining influence of nutritional environment do artificial seed. Experimentation was set quite accident one factor, include 4 assays, 3 times repetition. vi Resulting in ½ MS nutritional environment gave ratio of life and germination highly, consist with artificial seed from embryonic Vanda. Experiment 3: Examining maintainable environment arfiticial seed. Experimentation was set quite accident one factor, include 6 assays, 3 times repetition. MS environment maintained seed better, gave germinant ratio higher after maintenance. Experiment 4: Examining germination of arfiticial seed on different substances. Experimentation was set quite accident one factor, include 3 assays, 3 times repetition. Ratio of germinant arfiticial seed on the silk- coton was highest. CONTENT 2: EXAMINING PRESENCE OF MYCORRHIZA ON SOME ORCHID GENUS. Resulting in mycorrhiza had forms: - The hyphae was dyed with blue, divided many branches across root cells. - The hyphae scrolled in one cell. - Hypha cirumvolutions entered into cells, allyed each other by the hyphae. The present ratio of mycorrhiza had difference among orchid genus because of growing simulant origin. vii MỤC LỤC Trang Trang tựa .......................................................................................................... i Lời cảm ơn ....................................................................................................... ii Tóm tắt ............................................................................................................. iii Summary .......................................................................................................... v Mục lục ............................................................................................................. vii Danh sách các bảng .......................................................................................... x Danh sách các biểu đồ ...................................................................................... xi Danh sách các hình ........................................................................................... xii 1 GIỚI THIỆU ................................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................. 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................... 2 1.2.1 Mục đích .................................................................................................. 2 1.2.2 Yêu cầu .................................................................................................... 3 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 4 2.1 Khái quát về cây lan ................................................................................... 4 2.1.1 Phân loại thực vật học ............................................................................. 4 2.1.2 Lịch sử cây lan ....................................................................................... 4 2.1.3 Tình hình sản xuất lan ............................................................................. 5 2.1.4 Đặc điểm thực vật học của cây lan .......................................................... 6 2.1.4.1 Cơ quan dinh dƣỡng ............................................................................. 6 2.1.4.2 Cơ quan sinh dục của lan- tổ chức hoa ................................................ 7 2.1.5 Các điều kiện cơ bản cho cây lan ............................................................ 8 2.1.6 Các phƣơng pháp nhân giống lan ............................................................ 8 2.1.6.1 Gieo hột ................................................................................................ 8 2.1.6.2 Tách chiết ............................................................................................. 9 viii 2.2 Phƣơng pháp nuôi cấy mô lan …………………………………………...10 2.2.1 Khái quát về lịch sử nuôi cấy mô ............................................................ 10 2.2.2 Các phƣơng pháp nuôi cấy ...................................................................... 10 2.2.3 Chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng nuôi cấy in vitro .............................. 12 2.2.4 Các bƣớc nhân giống in vitro .................................................................. 14 2.2.5 Các yếu tố ảnh hƣởng nhân giống in vitro .............................................. 15 2.3 Công nghệ tạo hạt nhân tạo……………………………………….. 16 2.3.1 Khái niệm ................................................................................................ 16 2.3.2 Mục đích .................................................................................................. 16 2.3.3 Các nhân tố tạo hạt nhân tạo ................................................................... 17 2.3.3.1 Tạo phôi vô tính ................................................................................... 17 2.3.3.2 Cơ chế phát sinh phôi soma ................................................................. 18 2.3.3.3 Tạo vỏ bọc bằng sodium alginate ........................................................ 19 2.3.3.4 Quy trình tạo hạt nhân tạo .................................................................... 21 2.4 Nấm rễ cộng sinh- mycorrhiza………………………………………….. 22 2.4.1 Khái niệm ................................................................................................ 22 2.4.2 Các dạng mycorrhiza ............................................................................... 23 2.4.2.1 Ectomycorrhiza ................................................................................... 23 2.4.2.2 Endomycorrhiza ................................................................................... 23 2.4.3 Tác động có ích của mycorrhiza ............................................................. 24 2.4.3.1 Mở rộng diện tích hấp thu của rễ cây ................................................... 24 2.4.3.2 Sự trao đổi dinh dƣỡng ......................................................................... 24 2.4.3.3 Sự hình thành chất kích thích sinh trƣởng mycorrhiza ........................ 24 2.4.3.4 Nâng cao sức chống chịu của cây ........................................................ 25 2.4.3.5 Tăng khả năng kháng bệnh của cây trồng ............................................ 25 2.4.4 Sự xâm nhập của mycorrhiza .................................................................. 25 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 26 3.1 Đối tƣợng thí nghiệm .................................................................................. 26 3.2 Thời gian thực hiện ..................................................................................... 26 3.3 Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 26 3.4 Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................... 27 ix 3.4.1 Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu………………………………. 27 3.4.2 Mẫu sử dụng và điều kiện nuôi cấy………………………………….. 27 3.4.3 Môi trƣờng sử dụng……………………………………………… 27 3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 28 3.5.1 Chuẩn bị môi trƣờng……………………………………………….. 28 3.5.2 Bố trí thí nghiệm ……………………………………………………29 3.6 Xử lý số liệu …………………………………………………………..32 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 33 4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan ............ 33 4.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ sodium alginate đến sự hình thành hạt nhân tạo .............................................................................. 36 4.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng tạo hạt nhân tạo… 39 4.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trƣờng bảo quản……………………. 41 4.1.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng nẩy mầm của hạt……………. 43 4.2 Nội dung 2: Khảo sát sự hiện diện của mycorrhiza ở các giống lan........... 45 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 49 5.1 Kết luận ...................................................................................................... 49 5.2 Đề nghị ....................................................................................................... 50 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 51 7 PHỤ LỤC ...................................................................................................... 53 x DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Sự phát triển của mô trên môi trƣờng nuôi cấy ....................................... 17 Bảng 4.1: Nồng độ alginate ảnh hƣởng lên hình thái vỏ hạt nhân tạo ..................... 36 Bảng 4.2: Tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate ................................ 38 Bảng 4.3: Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate khácnhau… .... 39 Bảng 4.4: Tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các môi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau… 40 Bảng 4.5: Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo ở các môi trƣờng dinh dƣỡng .............. 42 Bảng 4.6: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng bảo quản hạt nhân tạo ................... 42 Bảng 4.7: Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo sau khi bảo quản .................................. 43 Bảng 4.8: Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm trên các giá thể ........................................... 44 Bảng 4.9: Sự hiện diện của mycorrhiza trên các giống lan ..................................... 45 xi DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4-1: Tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate khác nhau . 38 Biểu đồ 4-2: Tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo ở môi trƣờng khác nhau .......... 40 Biểu đồ 4-3: Sự hiện diện của mycorrhiza trên các giống lan ........................ 46 xii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2-1: Cấu tạo hoa lan ............................................................................... 8 Hình 2-2: Cấu tạo hạt nhân tạo ....................................................................... 16 Hình 2-3: Các giai đoạn phát sinh phôi soma ................................................. 19 Hình 2-4: Công thức hoá học của alginate ...................................................... 20 Hình 2-5: Các dạng phôi soma ............................................................................................ 21 Hình 2-6: Quy trình tạo hạt nhân tạo .............................................................. 22 Hình 4-1: Các dạng phôi vô tính ..................................................................... 33 Hình 4-2: Cấu trúc của phôi vô tính ................................................................. 34 Hình 4-3: Môi trƣờng tạo hạt nhân tạo ............................................................ 34 Hình 4-4: Các bƣớc tạo hạt nhân tạo................................................................ 35 Hình 4-5: Sự hình thành hạt nhân tạo ............................................................. 35 Hình 4-6: Cấu tạo vi thể của hạt nhân tạo ........................................................ 36 Hình 4-7: Hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate ............................................... 37 Hình 4-8: Hạt nhân tạo nẩy mầm .................................................................... 39 Hình 4-9: Hạt nhân tạo trên các môi trƣờng bảo quản .................................... 42 Hình 4-10: Hạt nhân tạo nẩy mầm trên các giá thể ......................................... 44 Hình 4-11: Vùng mô có mycorrhiza ................................................................ 47 Hình 4-13: Các dạng mycorrhiza .................................................................... 47 Hình 4-12: Dạng mycorrhiza cuộn tròn .......................................................... 48 1 CHƢƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Hiện nay, xã hội chúng ta ngày càng phát triển và hiện đại. Cuộc sống thƣờng bị áp lực nặng nề từ công việc.Vì vậy nhu cầu giải trí và vui chơi lành mạnh là rất cần thiết đối với mỗi ngƣời. Trong đó chơi hoa, cây cảnh cũng là một thú vui tao nhã, giúp chúng ta hoà quyện vào thiên nhiên, nâng cao chất lƣợng đời sống, giúp ta sống lâu sống khoẻ. Hoa là biểu tƣợng cho vẻ đẹp và điều thánh thiện. Mỗi loài hoa có màu sắc, hƣơng thơm đặc trƣng cho từng loài, cho từng vùng, từng miền.Từng loài hoa lại tƣợng trƣng cho tính cách của mỗi ngƣời, mỗi biểu tƣợng trong cuộc sống, đại diện cho tình yêu, tình bạn, tình cảm con ngƣời. Hiện nay hoa đã trở nên phổ biến rộng rãi đối với tất cả mỗi ngƣời, là món quà, là thông điệp trao nhau trong những ngày lễ, ngày kỉ niệm, ngày họp mặt. Hoa cũng đƣợc xem nhƣ một vật trang trí trong nhà tăng vẻ mỹ quan, gần gũi với thiên nhiên. Nhiều lễ hội về hoa đã đƣợc tổ chức ở các quốc gia. Trong đó, hoa lan hiện đƣợc nhiều ngƣời rất quan tâm và không những cảm mến trƣớc vẻ đẹp của hoa mà còn thắc mắc, tìm hiểu cách sinh tồn của lan trong tự nhiên. Lan rất đa dạng phong phú về màu sắc, hƣơng thơm, chủng loại và đặc biệt là phân bổ rộng khắp thế giới. Ngƣời trồng lan thƣờng đƣợc ví nhƣ một nghệ nhân, còn ngƣời thƣởng thức vẻ đẹp của chúng đƣợc xem nhƣ là nghệ sĩ. Về mặt kinh tế, trồng và kinh doanh hoa lan là một ngành đem lại lợi nhuận cao. Giá trị sản lƣợng hoa lan thế giới ngày nay lên tới hàng tỷ đô la. Vì vậy các nƣớc Hà Lan, Đức, Thái Lan, Philippin, Malaysia… vốn đã nổi tiếng về nghề trồng lan thì nay họ phát triển hơn nữa quy trình sản xuất lan nhanh hiệu quả hơn. Đồng 2 thời, đẩy mạnh lai tạo giống để chọn ra những giống mới lạ, khả năng chịu đựng với hoàn cảnh khắc nghiệt của tự nhiên.Việt Nam chúng ta cũng nghiên cứu rất nhiều về lan, đặc biệt là kỹ thuật nhân giống nhanh bằng kĩ thuật nuôi cấy mô. Đặc biệt, cây lan rất khó gieo hạt ngoài tự nhiên, đa phần muốn nhân giống nhanh thƣờng áp dụng tách chiết hoặc nuôi cấy in vitro. Với sự phát triển của kỹ thuật tạo hạt nhân tạo, chúng ta có thể ứng dụng lấy phôi soma cho bọc vỏ nhân tạo có chứa môi trƣờng dinh dƣỡng, nhằm bảo quản phôi và tạo điều kiện cho hạt nhân tạo nẩy mầm. Với kỹ thuật này, thì khắc phục hạn chế nẩy mầm của hạt lan trong tự nhiên, và giúp nhân nhanh các giống lan trồng và các loài thực vật khó nẩy mầm trong tự nhiên. Trong hệ sinh thái nông nghiệp, rất nhiều nấm có lợi cho cây trồng, nấm cộng sinh với rễ là rất phổ biến, chúng giúp cây nhận đƣợc một số chất khoáng từ đất, nhất là tăng cƣờng hấp thụ photpho dễ dàng, giúp cây tăng trƣởng nhanh, đồng thời cây lại cung cấp nguồn cacbon cho nấm, thƣờng đƣợc gọi là mycorrhiza. Nắm bắt đƣợc mối quan hệ đó, chúng ta có thể ứng dụng vào lĩnh vực sản xuất cây in vitro. Vì vậy, cần phải có nhiều nghiên cứu hơn nữa về mycorrhiza, đặc biệt là trên rễ lan. Đƣợc sự đồng ý của bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng với sự hƣớng dẫn tận tình của TS Trần Thị Dung, ThS Từ Thị Mỹ Thuận, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề