Luận văn Nghiên cứu nhân giống vô tính cây tiêu (piper nigrum) bằng phương pháp nuôi cấy mô

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC    KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY TIÊU (Piper nigrum) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2001-2005 Sinh viên thực hiện : NGUYỄN HỮU ĐỊNH Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 7/2005 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC    KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY TIÊU (Piper nigrum) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. Trần Thị Dung Nguyễn Hữu Định KS. Nguyễn Thị Kim Linh Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 7/2005 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn  Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh  Quí thầy cô trƣờng Đại học Nông Lâm, đặc biệt là các quí thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trƣờng.  Các quí thầy, cô, cán bộ, công nhân viên của khoa Công Nghệ Sinh Học của trƣờng đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khoá luận này. Đặc biệt, tôi xin đƣợc tỏ lòng biết ơn chân thành đến o Tiến sĩ Trần Thị Dung o Kỹ sƣ Nguyễn Thị Kim Linh  Đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khoá luận.  Xin đƣợc gửi lời cám ơn đến tất cả các bạn bè, các anh chị em trong và ngoài lớp Công Nghệ Sinh Học 27 dã góp ý, động viên và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trƣờng  Cuối cùng xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và thành kính tới cha mẹ, anh chị em trong gia đình và ngƣời thân. ii TÓM TẮT NGUYỄN HỮU ĐỊNH, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2005. “NGHIÊN CỨU NHÂN GIÔNG VÔ TÍNH CÂY TIÊU (Piper nigrum) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ”. Giáo viên hƣớng dẫn: Tiến sĩ TRẦN THỊ DUNG Kỹ sƣ NGUYỄN THỊ KIM LINH Thí nghiệm “Bƣớc đầu nghiên cứu nhân giống vô tính cây tiêu (Piper nigrum) bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô” đƣợc tiến hành tại bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trƣờng Đại Học Nông Lâm – TP.HCM từ ngày 3 tháng 3 năm 2005 đến ngày 15 tháng 8 năm 2005. Gồm 3 thí nghiệm. 1. Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu cấy Thí nghiệm 1a: Khảo sát việc khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch chất kháng sinh Tetracylin. Thí nghiệm 1b: Khảo sát việc khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch chất kháng sinh Streptomycin. Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên môi trƣờng MS. Kết quả đạt đƣợc: sau 15 ngày nuôi cấy kết quả cho thấy thời gian khử trùng mẫu tốt nhất là 6 giờ và Tetracylin cho hiệu quả khử trùng tốt hơn Streptomycin. 2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA kết hợp với IBA lên sự tạo mô sẹo từ lá Nghiệm thức BA (mg/L) IBA (mg/L) Số chai Số mẫu MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 MS6 MS7 MS8 MS9 0 0 0 1 1 1 3 3 3 0 1 2 0 1 2 0 1 2 9 9 9 9 9 9 9 9 9 36 36 36 36 36 36 36 36 36 iii Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên môi trƣờng MS có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng BA và IBA có hàm lƣợng thay đổi theo 9 nghiệm thức đƣợc bố trí theo bảng trên. Kết quả đạt đƣợc: sau 45 ngày nuôi cấy mẫu lá cho thấy môi trƣờng có 3mg/L BA + 1mg/L IBA cho mô sẹo mọc sớm nhất (7 ngày sau cấy) và có khả năng phát triển chồi. Ngoài ra, môi trƣờng có 3mg/L BA + 2mg/L IBA và môi trƣờng có 1mg/L BA + 1mg/L IBA cũng cho mô sẹo phát triển tốt. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên môi trƣờng MS có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng 3mg/L BA và hàm lƣợng TDZ hoặc Ki thay đổi theo 5 nghiệm thức đƣợc bố trí theo bảng sau: Nghiệm thức BA (mg/L) TDZ (mg/L) Ki (mg/L) Số bình Số mẫu C1 C2 C3 C4 C5 3 3 3 3 3 0,1 0,3 0,5 0 0 0 0 0 1 0 15 15 15 15 15 45 45 45 45 45 Kết quả đạt đƣợc: Sau 60 ngày nuôi cấy mô sẹo kết quả cho thấy môi trƣờng có 0,3mg/L TDZ cho hiệu quả nhân chồi tốt nhất. Ngoài ra, môi trƣờng có 0,1mg/L TDZ và môi trƣờng có 0,5 mg/L TDZ cũng cho hiệu quả nhân chồi khá cao. iv MỤC LỤC Nội dung Trang Lời cảm ơn ...................................................................................................................... i Tóm tắt ........................................................................................................................... ii Mục lục ......................................................................................................................... iv Danh mục các từ viết tắt .............................................................................................. vii Danh mục các bảng ..................................................................................................... viii Danh mục các hình ....................................................................................................... ix PHẦN 1. GIỚI THIỆU ................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1 1.2 Mục đích .................................................................................................................. 2 1.3 Yêu cầu .................................................................................................................... 2 1.4 Giới hạn đề tài ......................................................................................................... 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3 2.1 Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................ 3 2.1.1 Giai đoạn khởi xƣớng (1898-1930) ....................................................................... 3 2.1.2 Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930-1950) ............................................................ 3 2.1.3 Giai đoạn nghiên cứu phát sinh hình thái (1950-1960) ......................................... 4 2.1.4 Giai đoạn triển khai nuôi cấy mô vào công nghệ sinh học thực vật ...................... 4 2.2 Tổng quan về cây tiêu ............................................................................................... 5 2.2.1 Nguồn gốc và lịch sử phát triển cây tiêu ............................................................... 5 2.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ hạt tiêu trên thế giới và Việt Nam ........................ 5 2.2.2.1 Thế giới ............................................................................................................... 5 2.2.2.2 Việt Nam............................................................................................................. 7 2.3 Tình hình nuôi cấy mô cây tiêu .............................................................................. 10 2.3.1 Công trình nghiên cứu nuôi cấy cây hồ tiêu ở trong nƣớc .................................. 11 2.3.2 Một số công trình nghiên cứu nuôi cấy cây hồ tiêu ở nƣớc ngoài ...................... 12 2.4 Nhóm các chất điều hòa tăng trƣởng ảnh hƣởng tới quá trình nuôi cấy mô .......... 12 2.4.1 Auxin ................................................................................................................... 12 2.4.1.1 Tính chất sinh lý của Auxin.............................................................................. 13 2.4.1.2 Auxin trong cây trồng ....................................................................................... 13 v 2.4.1.3 Các chất auxin tổng hợp ................................................................................... 14 2.4.2 Gibbérelline ......................................................................................................... 14 2.4.2.1 Tính chất sinh lý của Gibbérelline.................................................................... 14 2.4.2.2 Gibbérelline trong cây trồng ............................................................................. 15 2.4.3 Cytokinine ........................................................................................................... 15 2.4.3.1 Tính chất sinh lý của Cytokinine ...................................................................... 15 2.4.3.2 Cytokinine trong cây trồng ............................................................................... 16 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 17 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 17 3.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ............................................................................... 17 3.2.1 Phòng chuẩn bị .................................................................................................... 17 3.2.2 Phòng cấy ............................................................................................................ 17 3.2.3 Phòng nuôi cây .................................................................................................... 17 3.2.4 Môi trƣờng cơ bản dùng trong thí nghiệm .......................................................... 17 3.3. Vật liệu nuôi cấy .................................................................................................... 18 3.4. Phƣơng pháp thí nghiệm ........................................................................................ 18 3.4.1. Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu cấy ..................................................................... 19 3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA kết hợp với IBA lên sự tạo mô sẹo từ lá ............................................................................................................. 21 3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo ................................. 23 3.5 Phân tích thống kê .................................................................................................. 24 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 25 4.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu cấy ......................................................................... 25 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA kết hợp với IBA lên sự tạo mô sẹo từ lá ................................................................................................................... 27 4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự tái sinh chồi từ mô sẹo ................................................ 29 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 34 5.1 Kết luận................................................................................................................... 34 5.2 Đề nghị ................................................................................................................... 34 PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 35 PHẦN 7. PHỤ LỤC ..................................................................................................... 37 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT NT: Nghiệm thức T2: Thời gian xử lí mẫu 2 giờ bằng Tetracylin T6: Thời gian xử lí mẫu 6 giờ bằng Tetracylin T10: Thời gian xử lí mẫu 10 giờ bằng Tetracylin S2: Thời gian xử lí mẫu 2 giờ bằng Streptomycin S6: Thời gian xử lí mẫu 6 giờ bằng Streptomycin S10: Thời gian xử lí mẫu 10 giờ bằng Streptomycin TLMS: Trọng lƣợng mô sẹo HSTTMS: Hệ số tăng trƣởng mô sẹo HSNC: Hệ số nhân chồi TLTCC: Trọng lƣợng tƣơi cụm chồi NSC: Ngày sau cấy TDZ: Thidiazuron BA: Benzyladenine IBA: Indolylbutyrique acid Ki: Kinetine vii DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 2.1 Sản lƣợng tiêu của những quốc gia sản xuất tiêu từ 1991-1996 (đơn vị: tấn) 6 Bảng 2.2 Tình hình sản xuất hồ tiêu các tỉnh trọng điểm (1997 - 1999) ........................ 8 Bảng 2.3 Tình hình sản xuất - xuất khẩu hạt tiêu của Việt Nam và thƣơng mại quốc tế9 Bảng 2.4 Thị trƣờng và số lƣợng hạt tiêu xuất khẩu từ 1996 – 6 tháng đầu năm 200010 Bảng 3.1 Mô tả thí nghiệm 1a ...................................................................................... 19 Bảng 3.2 Mô tả thí nghiệm 1b ...................................................................................... 19 Bảng 3.3 Mô tả thí nghiệm 2 ........................................................................................ 22 Bảng 3.4 Mô tả thí nghiệm 3 ........................................................................................ 23 Bảng 4.1 Kết quả xử lí mẫu với kháng sinh Tetracylin ................................................ 25 Bảng 4.2 Kết quả xử lí mẫu với kháng sinh Streptomycin ........................................... 26 Bảng 4.3 Tỉ lệ mẫu sống và mẫu sạch xử lí kháng sinh Tetracylin và Streptomycin trong thời gian 6 giờ ..................................................................................................... 26 Bảng 4.4 Thời gian xuất hiện mô sẹo của cây tiêu nuôi cấy từ mô lá .......................... 27 Bảng 4.5 Bảng trọng lƣợng tƣơi của mô sẹo và hệ số tăng trƣởng của mô sẹo vào ngày thứ 45 sau cấy ............................................................................................................... 28 Bảng 4.6 Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng hình thành chồi của cây tiêu nuôi cấy từ lá sau 60 ngày ............................................................................... 29 DANH MỤC CÁC HÌNH viii Tên hình Trang Hình 4.1 Mô sẹo mọc trên môi trƣờng Khoáng MS + 8,5g Agar + 10g Đƣờng saccharose + 3mgBA/L + 1mgIBA/L (nghiệm thức thứ 8) sau 7 ngày nuôi cấy. ........ 31 Hình 4.2 Mô sẹo mọc trên môi trƣờng Khoáng MS + 8,5g Agar + 10g Đƣờng saccharose + 3mgBA/L + 2mgIBA/L (nghiệm thức thứ 9) sau 16 ngày nuôi cấy. ...... 31 Hình 4.3 Mô sẹo mọc trên môi trƣờng Khoáng MS + 8,5g Agar + 10g Đƣờng saccharose + 1mgBA/L + 1mgIBA/L (nghiệm thức thứ 5) sau 17 ngày nuôi cấy. ...... 32 Hình 4.4 Chồi mọc trên môi trƣờng Khoáng MS + 8,5g Agar + 30g Đƣờng saccharose + 3mgBA/L + 0.3mgTDZ/L (nghiệm thức 2) sau 60 ngày nuôi cấy. .......................... 32 Hình 4.5 Chồi mọc trên môi trƣờng Khoáng MS + 8,5g Agar + 30g Đƣờng saccharose + 3mgBA/L + 0.1mgTDZ/L (nghiệm thức1) sau 60 ngày nuôi cấy. ............................ 33 Hình 4.6 Chồi mọc trên môi trƣờng Khoáng MS + 8,5g Agar + 30g Đƣờng saccharose + 3mgBA/L + 0.5mgTDZ/L (nghiệm thức 3) sau 60 ngày nuôi cấy. .......................... 33 1 PHẦN 1. GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Điều kiện khí hậu nƣớc ta nhìn chung rất thích hợp cho việc phát triển cây hồ tiêu.Tuy nhiên, do nƣớc ta có mùa mƣa rất tập trung và có mùa nắng kéo dài nên đây sẽ là điều kiện rất thuận lợi cho sâu bệnh phát triển và đây sẽ là nguyên nhân gây giảm năng suất, sản lƣợng và phẩm chất cho cây tiêu. Bên cạnh các loại sâu hại (rầy, rệp sáp, tuyến trùng...) còn có cả virus gây bệnh tiêu điên, thối rễ, rụng đốt. Đây là các nhân tố gây bệnh cho cây tiêu mà nó có thể ẩn tích trong thân của cây tiêu. Bởi vậy, bằng phƣơng pháp nhân giống thông thƣờng nhƣ: Chiết, ghép, giâm cành hoặc trồng bằng hạt thì hệ số nhân giống sẽ thấp mà cây giống khi đem trồng sẽ vẫn mang theo mầm bệnh thông qua các thao tác nhân giống này và sẽ gây hại cho cây giống. Vì vậy, hiện nay việc nhân giống vô tính cây tiêu bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô thực sự cần thiết vì cho hệ số nhân giống cao đồng thời sẽ làm giảm đƣợc tác nhân gây hại cho cây giống và đã đem lại hiệu quả rất thiết thực trong việc nâng cao chất lƣợng giống cây con. Hiện nay đã có một số công trình nghiên cứu nhân giống in vitro hồ tiêu để kháng nấm bệnh Phytophthora. Đặc biệt, công tác nhân giống in vitro còn là tiền đề thuận lợi cho việc nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng hay xử lí nhiệt để tạo các giống tiêu sạch bệnh để nâng cao năng suất, phẩm chất cho cây tiêu. Ngoài ra, công tác nhân giống in vitro cây tiêu có thể nhân giống đƣợc hàng loạt các cây con giống có năng suất và phẩm chất tốt nhƣ các cây bố mẹ đã chọn lọc cũng nhƣ có thể cung cấp nhiều giống tiêu thích hợp cho năng suất theo từng vùng để phục vụ cho nhu cầu sản xuất của nông dân. Trƣớc thực trạng trên và đặc biệt để tận dụng điều kiện khí hậu, địa lí của nƣớc ta để phát triển, nâng cao năng suất, phẩm chất và sản lƣợng cho cây tiêu; đồng thời nhằm từng bƣớc đƣa nƣớc ta lên vị trí cao nhất trong các nƣớc sản xuất và xuất khẩu tiêu trên thế giới, đƣợc sự đồng ý của bộ môn Công Nghệ Sinh Học chúng tôi đã tiến hành đề tài “NGHIÊN CỨU NHÂN GIÔNG VÔ TÍNH CÂY TIÊU (Piper nigrum) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ”. 1.2 Mục đích: 2 Tìm ra công thức khử trùng mẫu cấy ban đầu đạt hiệu quả cao. Khảo sát khả năng tạo mô sẹo từ lá. Tìm ra môi trƣờng thích hợp tái sinh chồi tiêu từ mô sẹo. 1.3 Yêu cầu: Ghi nhận các chỉ tiêu về số mẫu sống, số mẫu sạch để xác định công thức khử trùng hiệu quả. Theo dõi và ghi nhận về thời gian xuất hiện mô sẹo, trọng lƣợng và hệ số tăng trƣởng của mô sẹo sau 45 ngày nuôi cấy. Theo dõi và ghi nhận số chồi và trọng lƣợng chồi và hệ số nhân chồi sau 60 ngày nuôi cấy. 1.4 Giới hạn đề tài: Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn nên chúng tôi chƣa thực hiện đƣợc các thí nghiệm nhân nhanh chồi và tạo cây hoàn chỉnh. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trải qua gần trăm năm phát triển, và có thể phân chia ra thành 4 giai đoạn phát triển nhƣ sau: 2.1.1 Giai đoạn khởi xƣớng (1898-1930) Đầu tiên là các thí nghiệm của Haberlandt (1898) khi ông đề xƣớng ra tính toàn thế của tế bào và tìm cách nuôi cấy tế bào phân lập từ tầng tế bào lƣợc, tế bào tầng nhu mô, tầng biểu bì và lông hút của thực vật để minh chứng cho luận điểm của ông nhƣng không thành công. Tiếp theo Haberlandt còn có các thí nghiệm khác của Winkler (1902), Thielmann (1924) và Kuster (1928) tiến hành tƣơng tự nhƣng không nhận đƣợc tế bào phân chia nào. Phải đến những năm 30 của thế kỷ thứ 20 ngƣời ta mới đạt đƣợc những tiến bộ thực sự: Schmucker (1929), Scheitterer (1931), Pfeiffer (1931, 1933), Larue (1933) thông báo về nuôi cấy thành công đoạn đầu rễ riêng rẽ. Trong môi trƣờng nhân tạo những đoạn rễ này đã phát triển thành những chiếc rễ hoàn chỉnh. Đây là một tiến bộ đánh dấu một giai đoạn phát triển mới. 2.1.2 Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930-1950) Bắt đầu bằng thành công của White (1934) nuôi cấy đƣợc một dòng rễ cà chua sinh trƣởng mạnh và liên tục. Năm 1934 Gautheret thông báo thành công trong việc nuôi cấy mô tách từ tƣợng tầng của cây Salix apraea và cây Populus nigra. Mô nuôi cấy đã liên tục phân chia trong nhiều tháng trên môi trƣờng Knop bổ sung glucose và cysteinhyochloride. Trong thời kỳ này Went và Thimann (1937) đã phát hiện ra IAA là một auxin tồn tại tự nhiên trong cơ thể thực vật. IAA đã đƣợc Gautheret sử dụng vào môi trƣờng nuôi cấy, kết quả thu đƣợc mới chỉ hạn chế ở mô tƣợng tầng của cây Salix. Năm 1938 Nobecourt nhận đƣợc phân bào ở mô củ cà rốt Daucus carota. Cùng năm 1938, White đã nuôi cấy đƣợc mô tƣợng tầng của cây thuốc lá lai Nicotiana 4 glauca lai với N.langsdorffi. Vào cuối thời kỳ này đã có những quan sát về sự phân hóa cơ quan rễ, lá trong mô nuôi cấy của cây cà rốt hoặc cây thuốc lá lai. 2.1.3 Giai đoạn nghiên cứu phát sinh hình thái (1950-1960) Đại diện cho giai đoạn này là: Miller, Skoog, Steward, Reinert. Giai đoạn phát sinh hình thái bắt đầu bằng công trình của Camus (1949) ghép chồi lên khối mô nuôi cấy và thấy quá trình phân hóa ống mạch xảy ra trong khối mô. Năm 1956 Miller và Skoog đã tạo chồi thành công từ mô thuốc lá nuôi cấy. Trong giai đoạn này Skoog đã phát hiện ra kinetin là một chất điều khiển quá