Luận văn Nghiên cứu phân lập các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin từ hai loại bèo tấm lemna aequinoctialis db1 và spirodela polyrhyza db2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------- TRẦN THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC YẾU TỐ ĐIỀU KHIỂN BIỂU HIỆN GEN UBIQUITIN TỪ HAI LOẠI BÈO TẤM LEMNA AEQUINOCTIALIS DB1 VÀ SPIRODELA POLYRHYZA DB2 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Thái Nguyên – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------- TRẦN THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC YẾU TỐ ĐIỀU KHIỂN BIỂU HIỆN GEN UBIQUITIN TỪ HAI LOẠI BÈO TẤM LEMNA AEQUINOCTIALIS DB1 VÀ SPIRODELA POLYRHYZA DB2 Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN THỊ PHƢƠNG LIÊN Thái Nguyên – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Trần Thị Phương Liên – phòng Công nghệ ADN Ứng dụng – Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình hoàn thành luận văn. Luận văn này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen với sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài nhánh: “Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen H5N1 để chuyển vào bèo tấm” thuộc đề tài: Nghiên cứu tạo giống bèo tấm mang gen kháng nguyên H5N1 phòng chống bệnh cúm ở gia cầm thuộc Chương trình Công nghệ Sinh học Nông nghiệp 2007-2010. Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học và các thầy cô giáo trong khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên , Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điểu kiện cho tôi học tập và thực hiện luận văn. Tôi xin bày tỏ biết ơn tới toàn thể các cán bộ Phòng Công nghệ ADN Ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học , đặc biệt là PGS.TS. Nông Văn Hải – Trưởng phòng Công nghệ ADN Ứng dụng , KS. Hà Hồng Hạnh đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi rất tận tình trong suốt thời gian tôi thực tập và thực hiện luận văn vừa qua. Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Di truyền Nông nghiệp đã cung cấp nguyên liệu bèo tấm cho luận văn. Cuối cùng , tôi xin dành cho gia đình và bạn bè lòng biết ơn sâu sắc vì sự quan tâm, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận. Học viên Trần Thị Kim Dung Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Thái Nguyên, ngày tháng năm 2009 Tác giả luận văn Trần Thị Kim Dung Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên NHƢ̃NG TƢ̀ VIẾT TẮT Amp Ampicilin DNA Deoxyribonucleic acid ATP Adenosine triphosphate bp Base pair (cặp bazơ) dNTP Deoxynucleoside triphosphate ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate E. coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid epp Eppendorf EtBr Ethidium bromide IPTG Isopropyl thio-β-D-galactoside kb Kilo base LB Luria – Bertani PCR Polymerase Chain Reaction RNase Ribonuclease RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulphate SHPT Sinh học phân tử TAE Tris – acetate – EDTA X - gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactocide v/p vòng/phút Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Kích thước gen nhân của một số loài bèo tấm 8 1.2 Thành phần và hàm lượng các hợp chất hữu cơ có trong cánh bèo 9 3.1 Các vị trí nucleotide khác biệt giữa Sp-Ubi-pin (Mỹ) với pJETSpUbipin6 và pJETSpUbipin6R 43 3.2 Các vị trí nucleotide khác biệt giữa La-Ubi-pin (Mỹ) với La-Ubi-10F 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Hoa của Lemna gibba 5 1.2 Cây phân loại bèo tấm theo Landolt và cộng sự 5 1.3 Sinh sản vô tính bằng hình thức nảy chồi ở S. polyrrhiza 6 1.4 Sơ đồ cấu trúc gen điển hình 11 1.5 Sơ đồ cấu tạo promoter nhóm II ở sinh vật nhân chuẩn 12 1.6 Cấu trúc hệ thống điều khiển Ubiquitin ở thực vật 14 2.1 1. Lemna aequinoctialis DB1; 2. Spirodela polyrrhiza DB2 21 3.1 Điện di DNA tổng số trên gel agarose 0,8% 33 3.2 Sơ đồ cấu trúc đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin của loài bèo tấm Spirodela polyrrhiza DB2 (Mỹ) và vị trí các mồi. 34 3.3 Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% 36 3.4 Điện di plasmid trên gel agarose 0,8% 38 3.5 Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid bằng enzyme 39 3.6 Trình tự đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin của loài bèo tấm Spirodela polyrrhiza DB2 với dự đoán các vùng chức năng promoter 40 3.7 Sơ đồ cấu trúc đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin của loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và vị trí các mồi. 44 3.8 Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% 45 3.9 Điện di plasmid trên gel agarose 0,8% 47 3.10 Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid bằng enzyme 48 3.11 Trình tự đoạn promoter của loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 với dự đoán các vùng chức năng promoter 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC Lời cam đoan Những từ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình Mục lục Trang MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu chung về cây bèo tấm 3 1.1.1. Phân bố của bèo tấm 3 1.1.2. Đặc điểm hình thái bèo tấm 3 1.1.3. Cây phân loại bèo tấm 5 1.1.4. Hình thức sinh sản của bèo tấm 5 1.1.5. Hệ gen của bèo tấm 7 1.1.6. Giá trị dinh dưỡng 8 1.1.7. Tiềm năng sử dụng bèo tấm trong công nghệ sinh học 9 1.2. Promoter và ứng dụng trong công nghệ gen thực vật 10 1.2.1. Cấu trúc gen sinh vật 10 1.2.2. Cấu trúc promoter 11 1.2.3. Vai trò biểu hiện gen của promoter 13 1.2.4. Phân loại promoter 13 1.2.5. Ứng dụng promoter trong công nghệ gen thực vật 15 1.3. Tình hình nghiên cứu chuyển gen ở bèo tấm 17 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 17 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 19 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U 21 2.1. Nguyên liệu 21 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.1.1. Nguyên liệu thực vật 21 2.1.2. Hóa chất 21 2.1.3. Thiết bị 22 2.2. Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ thực vật 22 2.2.2. Phương pháp điện di DNA trên gel Agarose 24 2.2.3. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR 24 2.2.4. Các phương pháp sử dụng để tách dòng gen 26 2.2.5. Xác định trình tự gen 30 2.2.6. Xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng 30 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1. Tách chiết DNA tổng số từ bèo tấm 31 3.2. Phân lập đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ở loài S. polyrhiza 33 3.2.1. Thiết kế và tổng hợp cặp mồi đặc hiệu cho đoạn promoter 33 3.2.2. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR và tách dòng trong vector pJET1.2 33 3.2.3. Xác định đoạn điều khiển biểu hiện gen bằng RE 38 3.2.4. Xác định và phân tích trình tự đoạn promoter. 39 3.3. Phân lập đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ở loài L. aequinoctialis 43 3.3.1. Thiết kế và tổng hợp cặp mồi đặc hiệu cho đoạn promoter 43 3.3.2. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR và tách dòng trong vector pCR1.2 44 3.3.3. Xác định đoạn điều khiển biểu hiện gen bằng RE 46 3.3.4. Xác định và phân tích trình tự đoạn promoter. 48 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU Khi con người có cuộc sống định cư, khoảng 8000 năm trước Công nguyên, ở khu vực Tiểu Á và lưu vực sông Nin người ta đã bắt đầu việc trồng trọt truyền thống với mục đích duy trì và cải thiện chất lượng giống cây trồng nhằm thỏa mãn yêu cầu của con người ngày một tốt hơn. Con người đã biết tạo ra giống cây trồng mang các đặc tính mong muốn bằng phương pháp lai tạo giống (lai hữu tính giữa hai dòng cây trồng). Phương pháp này cần nhiều thời gian, công sức và trong nhiều trường hợp cây lai thu được kèm theo cả tính trạng không mong muốn. Ngày nay, công nghệ gen sử dụng các phương pháp hiện đại đã khắc phục được các hạn chế đó. Công nghệ gen cho phép các nhà di truyền và chọn giống thực vật xác định và thiết kế các gen đặc hiệu cho các mục tiêu mong muốn (kể cả các gen có nguồn gốc từ các sinh vật khác loài) rồi chuyển các gen này vào các giống đang sử dụng, tạo ra những giống cây trồng biến đổi gen mang những đặc tính mới đáp ứng yêu cầu của con người và có thể đem lại lợi ích quan trọng như tăng tính chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi, tăng năng suất và chất lượng, cải thiện môi trường nhờ giảm lượng thuốc trừ sâu hoá học cần sử dụng. Công nghệ gen thực vật còn mở ra một khả năng mới là sử dụng thực vật như một nhà máy sản xuất các loại thuốc cần thiết cho con người như vitamin, enzyme, kháng thể, vacxin và các loại thuốc chữa bệnh khác [3]. Trong nghiên cứu chuyển gen thực vật, bên cạnh những gen có giá trị mã hoá cho các tính trạng mong muốn, các promoter cần thiết cho sự biểu hiện của các gen cũng nhận được sự quan tâm đặc biệt của các nhà nghiên cứu công nghệ gen thực vật. Promoter là thành phần quan trọng trong cấu trúc của tất cả các gen, khởi đầu cho sự phiên mã, đóng vai trò then chốt trong việc biểu hiện gen. Việc phân lập các promoter biểu hiện gen hữu hiệu trên cây trồng, đặc biệt là promoter đặc hiệu cho từng loại cây, biểu hiện trong các loại mô tế bào khác nhau ngày càng được quan tâm đến. Nhiều promoter từ các gen ở thực vật được phân lập trong số đó phải kể đến promoter ubiquitin gen ngô, promoter gen rbcS (ribulose – 1,5-bisphosphate carboxylase small subunit), promoter của gen mã hóa sucrose synthase...[4]. Ubiquitin - protein sốc nhiệt (heat shock protein - HSP) với phân tử lượng nhỏ, có Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 mặt trong mọi tế bào ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng, protein này tham gia vào quá trình phân giải polypeptide trong tế bào chất, đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào và chuyển hóa các chất trong tế bào. Promoter của Ubiquitin gen từ cây ngô được sử dụng rộng rãi trong công nghệ gen thực vật [22], [41], [53]. Bèo tấm là cây một lá mầm nhỏ nhất, có hàm lượng protein và polysaccharide cao. Với đặc thù cấu trúc và quá trình trao đổi chất, bèo tấm được sử dụng trong công nghệ gen thực vật như nhà máy sản xuất protein tái tổ hợp. Một số promoter bèo tấm đã được phân lập như promoter của các gen SSU5A, SSU5B, promoter của gen NPR1 (negatively phytochrome regulated1)... có phản ứng với điều kiện chiếu sáng hoặc cảm ứng ABA trong các nghiên cứu về quá trình quang hợp ở cây [18], [61]. Để tăng cường hiệu quả chuyển gen, ngoài sử dụng promoter truyền thống như promoter 35S CAMV, promoter Ubiquitin từ loài bèo tấm Lemna minor đã phân lập, nghiên cứu và hoàn thiện ở Mỹ, đã được đánh giá có hiệu quả cao hơn và đăng ký thành patent [24]. Ở Việt nam có 3 loài bèo tấm được phát hiện thấy là Lemna aequinoctialis, Spirodela polyrrhiza và Wolffia globosa ở nhiều vùng khác nhau Nhằm mục đích nghiên cứu phân lập promoter đặc hiệu từ các loài bèo tấm Việt Nam phục vụ cho việc thiết kế tiếp theo các vector mang những gen đem lại lợi ích cho con người để chuyển vào bèo tấm, chúng tôi xin đăng ký thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân lập các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin từ hai loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và Spirodela polyrrhiza DB2” với các nội dung chính sau đây: 1. Hoàn thiện các phương pháp tách DNA tổng số từ hai loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và Spirodela polyrrhiza DB2; 2. Nghiên cứu thiết kế các mồi đặc hiệu và nhân đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen đặc hiệu từ hai loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và Spirodela polyrrhiza DB2 bằng PCR; 3. Tách dòng và xác định trình tự đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen đặc hiệu từ hai loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và Spirodela polyrrhiza DB2. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về cây bèo tấm 1.1.1. Phân bố của bèo tấm Bèo tấm với tên khoa học Lemnaceae là loài sinh vật thủy sinh có khả năng tồn tại và phát triển ở nhiều nơi trên thế giới, trừ những vùng cực bắc và cực nam quanh năm giá lạnh. Ở vùng sa mạc và vùng ẩm ướt thì sự có mặt của bèo tấm cũng ít hơn. Trong các chi thuộc loài bèo tấm thì 3 chi (Spirodela, Lemna, Wolffia) được phân bố khắp thế giới, trong khi đó Wolffia ít tìm thấy ở châu Mỹ và châu Phi. Spirodela có tâm phân bố ở Nam Mỹ. Chi Lemna có tính đa dạng cao nhất ở Bắc Mỹ và Đông Nam Á. Wolffiella phân bố chủ yếu ở vùng ven nhiệt đới của châu Mỹ và châu Phi. Wolffia tồn tại chủ yếu ở châu Mỹ, Đông Nam Á và châu Úc. Lemna aequinoctialis được phân bố rộng rãi ở các vùng có khí hậu ấm áp trên thế giới. Cùng với nghề trồng lúa nước, chúng có mặt rộng rãi ở nhiều vùng khác nhau như: Nam Âu, vùng trung tâm Bắc Mỹ, Bắc Trung Quốc, Bắc Nhật Bản…[36]. Ở Việt Nam, đã phát hiện thấy có 3 loài bèo tấm thuộc 3 chi khác nhau (Spirodela, Lemna, Wolffia) đó là loài L. aequinoctialli, S. polyrrhiza và W. globosa [36]. Hiện nay, các loài bèo này phân bố khá phổ biến trên các vùng mặt nước, ao hồ đồng ruộng và tập trung nhiều ở khu vực đồng bằng Bắc Bộ và Nam bộ [7], [36]. 1.1.2. Đặc điểm hình thái bèo tấm Lemnaceae thuộc nhóm cây một lá mầm nhỏ nhất phần lớn có cả lá, rễ, hoa, quả, những cây trưởng thành không có thân cây. Lá (cánh bèo) có kích thước khác nhau phụ thuộc vào từng chi, từng loài. 1.1.2.1. Đặc điểm cánh bèo Dạng thân giống lá của các loài Lemnaceae được gọi là “frond” (cánh bèo), là một tập hợp của các mô có sự biệt hóa hạn chế. Mức độ tổ chức của mô cánh bèo trong họ Lemnaceae giảm từ Spirodela tới Lemna, Wolffiella và Wolffia [36]. Cánh bèo không ở dạng phẳng mà tồn tại các u lồi đặc trưng trên đó có định vị các gân lá, cây trưởng thành thường có từ 4-7 gân lá trong khi các cây non chỉ có 3 gân lá. Đa số bèo tấm có cánh mỏng giống lá. Một số loài có cánh không dẹt do có xoang khí Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 lớn. Cánh bèo có hình ô van (hoặc tròn) dài tới 1,5 cm và rộng tới 1 cm (S. polyrrhiza, L. trisulca). Loài nhỏ nhất có cánh đạt kích thước 3 mm ở điều kiện tối ưu. Ở điều kiện thường có thể nhỏ hơn 1 mm (Wolffia). Kích thước và hình dạng của cánh bèo phụ thuộc nhiều vào các điều kiện bên ngoài và kiểu gen của chúng. Các yếu tố ngoại cảnh này bao gồm: ánh sáng, hàm lượng đường, hàm lượng nitơ, phospho, kali, canxi và magie, nhiệt độ…[36]. 1.1.2.2. Đặc điểm rễ bèo Kích thước và số lượng rễ trên 1 cánh bèo ở các loài bèo tấm không giống nhau và phụ thuộc vào từng loài [36]. Đa số các loài thuộc họ Lemna chỉ có một rễ, S. polyrrhiza có từ 7-12 rễ hoặc nhiều hơn và có thể dài đến 10 mm, Landoltia có 2- 3 rễ và có thể lên đến 5 rễ với chiều dài tối đa có thể đạt được là 6 mm. Ngoại trừ điều kiện khắc nghiệt, trong điều kiện thiếu nitơ, phosphate hay các chất khoáng, rễ sẽ dài hơn. Trong khi đó, trong môi trường dinh dưỡng thuận lợi, rễ ngắn hơn và thậm chí có loại không hình thành rễ. Cấu trúc rễ của bèo tấm cũng hết sức đơn giản, không có các rễ con và không phản ánh sự tăng trưởng cũng như sự tạo nhánh. Vì lẽ đó, rễ của bèo tấm rất mảnh và nhỏ. Cũng giống như các loại rễ phổ biến khác, rễ bèo tấm có cấu tạo gồm 4 phần chính: Đỉnh rễ, vùng mô phân sinh, vùng kéo dài, và vùng các tế bào thuần thục. 1.1.2.3. Hoa và quả bèo Hoa của các loài bèo tấm đã được nghiên cứu tương đối kĩ. Chúng thường hình thành và tồn tại trong thời gian ngắn và hiếm khi được quan sát thấy. Hoa của các loài bèo có thể hình thành trong thời gian ngắn hay dài khác nhau tuỳ thuộc vào loài. Mỗi hoa thường có 2 nhị hoa và 1 vòi nhụy hoa duy nhất. Các nhụy hoa thường ngắn và khó quan sát hơn. Quả của bèo tấm đa phần là nhỏ, có lớp vỏ ngoài khô, một số trong đó có thể được quan sát thấy bằng mắt thường. Quả bèo thường có dạng như một túi có răng cưa, đôi khi có dạng dọc hơi phẳng, và thường chứa từ 1-6 hạt [36]. Hình 1.1 thể hiện một số đặc điểm của hoa bèo tấm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 Hình 1.1. Hoa của Lemna gibba 1.1.3. Cây phân loại bèo tấm Hình 1.2. Cây phân loại bèo tấm theo Landolt và cộng sự Theo Landolt, bèo tấm thuộc giới thực vật, ngành Magnoliophyta, lớp Liliopsida, bộ Arales, họ Lemnaceae gồm các chi Lemna, Spirodela, Wolffia, Woffiela với trên 40 loài khác nhau [36]. Ông đã phân loại bèo tấm dựa trên số rễ và kích thước của cánh bèo: Lemna (1 rễ); Spirodela (7-12) rễ; cánh bèo từ 10 mm trở lên); Landoltia (2-3 rễ, cánh bèo 3-6 mm); Wolffia (không có rễ, cánh bèo 0,6-1,2 mm)… Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 Năm 2002, Les và cộng sự đã dựa trên đặc điểm về hình thái nhiễm sắc thể và vi phân tử (DNA của nhân và lục lạp) đề ra giả thiết về cây phân loại của bèo tấm gồm 5 chi tức là có thêm một chi mới là Landoltia [38]. Một số nghiên cứu gần đây của Rothwell và cộng sự, dựa trên sự so sánh trình tự đoạn intron tRNALeu UAA (trnL) và tRNAPhe UAA (trnF) của bộ gen lục lạp đã xác định rằng họ Lemnaceae và Pisita cùng thuộc họ ráy Araceae [48]. Hình 1.2 biểu thị cây phân loại bèo tấm [37]. 1.1.4. Hình thức sinh sản của bèo tấm Bèo tấm có hai phương thức sinh sản để duy trì nòi giống: Sinh sản hữu tính và sinh sản vô tính. Sinh sản vô tính chiếm ưu thế so với sinh sản hữu tính. Hình thức sinh sản hữu tính của bèo tấm chỉ xảy ra khi chúng gặp điều kiện bất lợi để bảo tồn nòi giống [36], [37]. 1.1.4.1. Sinh sản vô tính Bèo tấm sinh sản vô tính bằng hình thức nảy chồi từ vùng đỉnh phân sinh nằm trong xoang ở vùng gốc cánh. Hình 1.3 thể hiện quá trình sinh sản vô tính bằng hình thức nảy chồi của S. polyrrhiza. Hình 1.3. Sinh sản vô tính bằng hình thức nảy chồi ở S. polyrrhiza Ở điều kiện tối ưu, tốc độ sinh sản vô tính của bèo tấm gần đạt mức tăng theo hàm số mũ. Lượng cánh bèo có thể tăng gấp đôi chỉ sau 24 giờ nuôi cấy ở các loài sinh trưởng nhanh như L. aequinoctialis, W. microscopica. Với hình thức sinh sản vô tính thì thời gian một vòng đời của cánh bèo chỉ vài tuần. Theo nhiều tác giả cho biết, vòng đời của một cánh bèo phụ thuộc vào nhiệt độ nuôi, ở 30oC vòng đời giảm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 một nửa so với ở 20oC. Trong giai đoạn ngủ, nghỉ và ở nhiệt độ thấp, cánh bèo có thể tồn tại trong vài tháng. Điều kiện dinh dưỡng cũng có ảnh hưởng đến vòng đời của cánh bèo. Sự thiếu hụt các chất dinh dưỡng có thể làm cánh bèo già hoá nhanh và chết chỉ sau 1 đến 2 tuần. Có thể nói, vòng đời sẽ dài hơn khi tốc độ nhân lên của cánh bèo nhỏ. Khi nồng độ dinh dưỡng giảm dưới ngưỡng tối thiểu thì cánh bèo bị tổn thương và chết nhanh hơn bình thường [36]. 1.1.4.2. Sinh sản hữu tính Sinh sản hữu tính được thực hiện thông qua sự ra hoa và tạo hạt tương tự như các loài thực vật hạt kín khác. Với kích thước cánh bèo, hoa và hạt nhỏ bé, bèo tấm được coi là loài thực vật hạt kín nhỏ bé nhất trong giới thực vật. Sinh sản hữu tính ở bèo tấm bao gồm 2 giai đoạn: (i) Ra hoa và (ii) Tạo quả và hạt. * Giai đoạn ra hoa: Cơ quan ra hoa ở bèo tấm L. aequinoctialis gồm các thành phần: 1 lá bắc, 2 nhị hoa, 1 nhụy hoa. Ở Spirodela và Lemna, các cơ quan của hoa phát sinh trong xoang phát sinh cánh con. Ở Wolffiella và Wolffia, hoa phát sinh trong 1 xoang ở bề mặt trên của cánh bèo và không ở cung xoang phát sinh cánh con. Hoa của Wolffia nằm dọc theo đường trung tâm cánh. Hoa của Wolffiella nằm ở cạnh đường trung tâm của cánh [36]. * Giai đoạn tạo quả và hạt: Sau khoảng thời gian từ 2 đến 5 tuần tính từ lúc thụ tinh thì quả chín. Mỗi quả có lá bao khô và thường có 1 - 6 hạt. Ở hầu hết các loài, quả gần như đối xứng ngoại trừ L. valdiviana và L. perpusilla. Quả thường dài từ 0,35 mm đến 2,75 mm. Hạt bèo tấm có dạng hình trứng