Luận văn Nghiên cứu phương pháp chiết xuất dịch từ sinh khối vi khuẩn lam spirulina platensis bổ sung vào nước giải khát

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT DỊCH TỪ SINH KHỐI VI KHUẨN LAM Spirulina platensis BỔ SUNG VÀO NƢỚC GIẢI KHÁT Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: THANH GIA NGỌC HÂN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************* NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT DỊCH TỪ SINH KHỐI VI KHUẨN LAM Spirulina platensis BỔ SUNG VÀO NƢỚC GIẢI KHÁT Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: Th.S. Nguyễn Tiến Dũng Thanh Gia Ngọc Hân K.S. Lƣơng Đình Quát Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 i LỜI CẢM ƠN Hoàn thành khóa luận tốt nghiệp niên khóa 2003-2007, em chân thành gởi lời cảm ơn sâu sắc: Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học. Thầy Nguyễn Tiến Dũng. Anh Lƣơng Đình Quát – Chi cục Đo lƣờng Tiêu chuẩn Chất lƣợng tỉnh Bình Thuận. Anh Nguyễn Văn Tân – Chi cục Đo lƣờng Tiêu chuẩn Chất lƣợng tỉnh Bình Thuận. Chị Nguyễn Thị Thu Hƣơng – Chi cục Đo lƣờng Tiêu chuẩn Chất lƣợng tỉnh Bình Thuận. Đã tận tâm dạy dỗ, truyền đạt những tri thức khoa học, hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, rèn luyện tại trƣờng và thực tập tốt nghiệp. Đặc biệt xin gởi lời cảm ơn gia đình, những ngƣời thân và những bạn bè thân yêu của lớp Công nghệ sinh học 29 đã quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận này. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2007 Sinh viên Thanh Gia Ngọc Hân ii TÓM TẮT THANH GIA NGỌC HÂN, Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. Đề tài “NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG SINH KHỐI VI KHUẨN LAM Spirulina platensis BỔ SUNG VÀO NƢỚC GIẢI KHÁT” đƣợc tiến hành tại Chi cục Đo lƣờng Tiêu chuẩn Chất lƣợng tỉnh Bình Thuận, thời gian thực hiện từ tháng 4 đến tháng 8 năm 2007. GVHD: Th.S. Nguyễn Tiến Dũng. Ngày nay thực phẩm không chỉ đáp ứng cho việc ăn và uống mà còn đƣợc dùng để chữa bệnh. Vì vậy con ngƣời đã không ngừng nghiên cứu để tìm ra các loại thực phẩm có đủ các yêu cầu trên. Một trong những đối tƣợng đang đƣợc chú ý hiện nay là loài vi khuẩn lam Spirulina, với đặc điểm ƣu việt là chứa nguồn protein dồi dào, hấp thu dễ, có 18/22 loại axit amin không thay thế và các chất dinh dƣỡng có giá trị khác. Trên cơ sở đó, những đề tài tốt nghiệp này nhằm mục đích bƣớc đầu nghiên cứu bổ sung vi khuẩn lam Spirulina platensis vào một số thực phẩm nhƣ: nƣớc khoáng, nƣớc tinh khiết và rƣợu trái cây. Kết quả khảo sát ban đầu cho thấy thành phần dinh dƣỡng trong các mẫu tảo là: hàm lƣợng protein khoảng 60 %, hàm lƣợng tro khoảng 10 - 12 %. Trong các mẫu tảo thí nghiệm không phát hiện có vi sinh vật có hại. Cùng với việc khảo sát thành phần dinh dƣỡng của tảo, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các phƣơng pháp phá vỡ tế bào để thu đƣợc lƣợng protein hoà tan lớn nhất. Khảo sát đƣợc thực hiện với hai phƣơng pháp: phƣơng pháp khuếch tán (PPKT) và phuơng pháp vật lý (PPVL). Kết quả khảo sát cho thấy PPKT có hiệu suất cao hơn so với PPVL, trong đó hiệu suất phá vỡ cao nhất là ở nồng độ đƣờng 0,4 %. Đề tài cũng đã tiến hành thử nghiệm các tỉ lệ bổ sung dịch tảo vào một số loại nƣớc uống. Kết quả khảo sát cho thấy tỉ lệ bổ sung thích hợp là 1:17. Do thời gian có hạn, nên nghiên cứu vẫn chƣa đi đến kết quả cuối cùng. Tuy vậy kết quả bƣớc đầu này cũng tạo đƣợc cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo. iii SUMMARY Full name: THANH GIA NGOC HAN, Nong Lam University Ho Chi Minh City. Thesis “STUDYING FOR USING EXTRACTION OF Spirulina platensis TO COMPLETE IN DRINKING WATER”. This subject was conducted at Standard and Quality measurement Department of Binh Thuan province from April to August, 2007. Supervisor: Nguyen Tien Dung, M.D. Today, food not only uses to eat or drink but also use such as drug. Therefore, scientist is continuous research to find out object which have all above attribute. Spirilina have caught food researcher’s attention, because this alga contains more than 70% easily absorption protein, and 18/22 human essential amino acid and other nutrients. The goal of this thesis is initially studying for using extraction of Spirulina platensis to complete into some kind of drinking water such as fresh water, mineral water or wine. First result showed that protein content in Vinh Hảo’s Spirulina is 60% and ash content is about 10-12%. There is no harmful bacteria were detected in the algae samples. For algae extraction, we studied two methods: by endosmosis and physical. The result showed that the endosmosis method with 0,4% sucrose gave the highest protein content in extraction. We also research to find out the algae extraction rate to complete into any drinking water. The result showed that the rate 1:17 is the best. Because of the short time to research, the results are not going to the end, but these are base to later experiment. iv MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ơn ................................................................................................... iii Tóm tắt ..........................................................................................................iv Summary ........................................................................................................ v Mục lục ..........................................................................................................vi Danh sách các chữ viết tắt .............................................................................. x Danh sách các hình ........................................................................................xi Danh mục các bảng ..................................................................................... xii Chƣơng 1. MỞ ĐẦU ...................................................................................... 1 Chƣơng 2.TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 3 2.1. Lịch sử phát hiện và sử dụng Spirulina platensis .............................. 3 2.1.1. Lịch sử phát hiện .......................................................................... 3 2.1.2. Tình hình nghiên cứu Spirulina platensis trong – ngoài nƣớc .... 4 2.1.2.1. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ....................................... 4 2.1.2.2. Tình hình nghiên cứu trên Thế Giới ..................................... 5 2.2. Spirulina và những vấn đề liên quan ................................................. 7 2.2.1. Giới thiệu về Spirulina................................................................. 7 2.2.2. Đặc điểm sinh lí của Spirulina platensis .................................... 8 2.2.2..1 Phân loại ................................................................................. 8 2.2.2.2. Đặc điểm sinh lý .................................................................... 9 2.3. Kỹ thuật sản xuất Spirulina platensis .............................................. 11 2.3.1. Sơ đồ qui trình sản xuất Spirulina platensis .............................. 11 2.3.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến Spirulina.......................................... 11 2.4. Thành phần dinh dƣỡng và công dụng của Spirulina platensis ...... 17 2.4.1. Thành phần dinh dƣỡng ............................................................. 17 v 2.4.2. Công dụng của vi khuẩn lam Spirulina platensis ...................... 18 2.5. Ứng dụng Spirulina platensis trong thực phẩm, xử lý môi trƣờng y học và mỹ phẩm .................................................................................. 20 2.5.1. Ứng dụng trong thực phẩm ........................................................ 20 2.5.2. Ứng dụng trong xử lí môi trƣờng .............................................. 21 2.5.3. Ứng dụng trong y học ................................................................ 23 2.5.4. Ứng dụng trong mỹ phẩm .......................................................... 24 2.6. Kỹ thuật sản xuất nƣớc giải khát .................................................... 24 2.6.1 Khái niệm về nƣớc giải khát ....................................................... 24 2.6.2 Quy trình sản xuất nƣớc giải khát ............................................. 25 2.6.2.1 Nguyên liệu ........................................................................... 25 2.6.2.2 Diễn giải quy trình công nghệ ............................................... 26 2.6.3. Kỹ thuật sản xuất nƣớc khoáng Vĩnh Hảo ................................. 27 2.6.4. Kỹ thuật sản xuất nƣớc tinh khiết .............................................. 27 2.6.5. Kỹ thuật sản xuất rƣợu trái cây .................................................. 27 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................. 28 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành đề tài ............................................ 28 3.1.1. Thời gian .................................................................................... 28 3.1.2. Địa điểm ..................................................................................... 28 3.2. Nguồn cung cấp nguyên liệu ........................................................... 28 3.3. Đối tƣợng nghiên cứu ...................................................................... 28 3.4. Vật liệu ............................................................................................ 28 3.4.1. Thiết bị ....................................................................................... 28 3.4.2. Hoá chất ..................................................................................... 29 3.5. Các phƣơng pháp phân tích ............................................................. 29 3.5.1. Phƣơng pháp xác định nitơ tổng số bằng phƣơng pháp Kjeldahl 3.5.1.1. Nguyên tắc ........................................................................... 29 3.5.1.2. Quá trình thực hiện .............................................................. 30 3.5.2. Phƣơng pháp xác định protein bằng phƣơng pháp Lowry ........ 33 vi 3.5.2.1. Nguyên tắc ........................................................................... 33 3.5.2.2. Thực hành............................................................................. 34 3.5.3. Phƣơng pháp xác định tro tổng số ............................................. 35 3.5.3.1. Nguyên tắc ........................................................................... 35 3.5.3.2. Thực hành............................................................................. 35 3.5.4. Phƣơng pháp phân tích vi sinh................................................... 36 3.5.4.1. TPC ...................................................................................... 36 3.5.4.2. Coliforms .............................................................................. 37 3.5.4.3. E.coli .................................................................................... 37 3.5.4.4. Staphylococcus aureus ......................................................... 37 3.5.4.5. Salmonella ............................................................................ 37 3.6. Phƣơng pháp phá vỡ tế bào ............................................................. 38 3.6.1. Phƣơng pháp vật lí ..................................................................... 38 3.6.2. Phƣơng pháp khuếch tán ............................................................ 38 3.7. Phƣơng pháp bổ sung ...................................................................... 39 3.8. Phƣơng pháp cảm quan ................................................................... 39 3.9. Bố trí thí nghiệm .............................................................................. 39 3.10. Phƣơng pháp xử lý số liệu ............................................................. 39 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 40 4.1. Thành phần dinh dƣỡng vi khuẩn lam Spirulina platensis ............. 40 4.1.1. Xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Kjeldahl ........ 40 4.1.1.1. Xác định hàm lƣợng protein trong bột tảo khô .................... 40 4.1.1.2. Xác định hàm lƣợng protein trong bã tảo ............................ 41 4.1.2. Xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Lowry ........... 41 4.1.2.1. Protein Chuẩn ....................................................................... 41 4.1.2.2. Hàm lƣợng protein trong dịch tảo ........................................ 43 4.1.3. Xác định hàm lƣợng tro tổng số trong bột tảo khô .................... 44 4.2. Nghiên cứu các phƣơng pháp phá vỡ tế bào ................................... 45 vii 4.2.1. Đánh giá hiệu quả phá vỡ tế bảo bằng cách xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Kieldahl .......................................... 45 4.2.1.1. Phá vỡ tế bào theo phƣơng pháp khuếch tán (PPKT) .......... 45 4.2.1.2. Theo phƣơng pháp vật lý (PPVL) ........................................ 45 4.2.2. Đánh giá hiệu quả phá vỡ tế bào bằng cách xác định hàm lƣợng protein theo kết quả thu nhận protein theo phƣơng pháp Lowry .............................................................................................................. 46 4.2.2.1. Phá vỡ tế bào theo phƣơng pháp khuếch tán ....................... 46 4.2.2.2. Phá vỡ tế bào theo phƣơng pháp vật lý ............................... 48 4.3. So Sánh Kết Quả Protein ................................................................. 51 4.3.1. Phá vỡ và không phá vỡ tế bào .................................................. 51 4.3.2. Phá vỡ theo nồng độ đƣờng và thời gian .................................. 53 4.3.3. Phá vỡ theo nồng độ đƣờng (phƣơng pháp khuếch tán) ............ 54 4.3.4. Phá vỡ theo thời gian (phƣơng pháp vật lí) ............................... 55 4.4. Kết quả phân tích vi sinh ................................................................. 55 4.5. Hiệu suất phá vỡ tế bào tảo Spirulina platensis .............................. 56 4.6. Nghiên cứu chọn tỉ lệ bổ sung vi khuẩn lam Spirulina platensis .... 58 4.7. Đánh giá chất lƣợng sản phẩm ........................................................ 59 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................ 60 Chƣơng 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................... 61 Phụ Lục ........................................................................................................ 64 viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BGBL Brilliant Green Bile Lactose BPA Baird Parker Agar CTV Cộng tác viên Ecoli Escherichia coli EMB Eosin Methylene Blue lactose F.A.O Food Agriculture Organization NU Nƣớc uống PCA Plate Count Agar PPKT Phƣơng pháp khuếch tán PPVL Phƣơng pháp vật lí PV Phá vỡ RV Rappaport – Vassiliadis soya pepton S. aureus Staphylococcus aureus SPW Saline Pepton Water TPC Tổng vi sinh vật hiếu khí VRB Violet Red Bile agar WTO World Trade Organization ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Hình dạng của vi khuẩn lam Spirulina platensis .......................... 7 Hình 2.2. Hình dạng của vi khuẩn lam Spirulina platensis đƣợc nhìn dƣới kính hiển vi ........................................................................... 9 Hình 2.3. Hình dạng của vi khuẩn lam Spirulina platensis dƣới kính hiển vi ..................................................................................................... 9 Hình 2.4. Các mô hình nuôi tảo Spirulina công nghiệp ............................. 14 Hình 2.5. Nuôi Spirulina trong phòng thí nghiệm ....................................... 14 Hình 2.6. Các sản phẩm có bổ sung tảo trong thực phẩm ........................... 20 Hình 2.7. Các sản phẩm từ tảo trong y học ................................................. 23 Hình 2.8. Các sản phẩm từ tảo trong mỹ phẩm ........................................... 24 Hình 3.9. Máy cất đạm ................................................................................ 30 Biểu đồ 4.1. Đƣờng chuẩn protein trong dịch tảo ....................................... 42 Biểu Đồ 4.2. Nồng độ protein ứng với chỉ số OD xác định của tảo ............ 43 Biểu Đồ 4.3. Nồng độ protein thu đƣợc tƣơng ứng với hàm lƣợng đƣờng sử dụng trong thí nghiệm ............................................................................ 47 Biểu Đồ 4.4. Nồng độ protein ứng với OD xác định của tảo ở các thời gian khác nhau ............................................................................................. 49 Biểu đồ 4.5. Hàm lƣợng protein trong mẫu tảo trƣớc và sau khi phá vỡ .... 52 Biểu đồ 4.6. Hiệu suất phá vỡ tế bào giữa PPKT và PPVL ........................ 57 x DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn .............................................. 34 Bảng 4.2. Hàm lƣợng protein trong tảo ....................................................... 40 Bảng 4.3. Kết quả chỉ số OD tƣơng ứng với nồng độ protein chuẩn .......... 42 Bảng 4.4. Giá trị OD – protein trong 0,2g bột tảo ....................................... 43 Bảng 4.5. Hàm lƣợng tro theo phần trăm có trong tảo ................................ 44 Bảng 4.6. Lƣợng protein trong bã tảo sau khi phá vỡ theo PPKT ............. 45 Bảng 4.7. Hàm lƣợng protein trong bã tảo sau khi phá vỡ theo PPVL ...... 46 Bảng 4.8. Giá trị OD – protein trong dịch tảo phá vỡ theo nồng độ đƣờng ............................................................................................................ 48 Bảng 4.9. Giá trị OD – protein trong dịch tảo phá vỡ theo PPVL .............. 50 Bảng 4.10. So sánh kết quả protein khi phá vỡ và không phá vỡ tế bào tảo ...................................................................................................... 51 Bảng 4.11. So sánh kết quả protein khi phá vỡ tế bào theo nồng độ đƣờng và theo thời gian .......................................................................................... 53 Bảng 4.12. So sánh kết quả protein khi phá vỡ tế bào theo nồng độ đƣờng ...................................................................................................................... 54 Bảng 4.13. So sánh kết quả protein khi phá vỡ tế bào theo thời gian ......... 55 Bảng 4.14. Kết quả phân tích vi sinh các sản phẩm nghiên cứu ................. 56 Bảng 4.15. Hiệu suất phá vỡ tế bào trong mẫu tảo ...................................... 57 Bảng 4.16. Chất lƣợng sản phẩm về mặt cảm quan .................................... 58 B ảng 4.17. Chất lƣợng sản phẩm về mặt vi sinh ........................................ 59 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Trong hàng nghìn năm nay, cũng nhƣ trong tƣơng lai, để trái đất và loài ngƣời chúng ta tồn tại và phát triển. Đó chính là nhờ vào sự tuần hoàn của một chu trình đặc biệt quan trọng, thiếu nó trái đất sẽ trở thành một kho rác khổng lồ, loài ngƣời chúng ta sẽ không còn khoảng không riêng của mình, mà nơi ăn, chốn ở, chốn ngủ sẽ đƣợc bao quanh chỉ là "rác với rác". Vậy chu trình nào mang tính thiết yếu nhƣ thế ? Đó chính là chu trình vật chất. Nó bao gồm ba đối tƣợng cấu kết mà thành, đó là động vật - thực vật - vi sinh vật, ba đối tƣợng này có mối quan hệ gắn bó và tác động qua lại với nhau. Nhìn chung, một trong ba đối tƣợng trên không thể tách rời và chúng là nguồn sống, nguồn năng lƣợng của chúng ta. Một minh chứng điển hình là, cùng với sự phát triển nhƣ vũ bão của khoa học và công nghệ, loài ngƣời chúng ta đã không ngừng nghỉ để kiếm tìm và tạo ra các sản phẩm mới có giá trị cao cung cấp cho con ngƣời, đó chính là việc sử dụng sinh khối của vi khuẩn lam Spirulina platensis hay còn gọi là tảo xoắn Spirulina