Luận văn Nghiên cứu qui trình phân tích 6-Benzylaminopurine trong giá (đỗ) bằng HPLC đầu dò UV

Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 28 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TRÊN DUNG DỊCH CHUẨN BA 3.1.1. Kết quả khảo sát bước sóng hấp thu: Tiến hành khảo sát bước sóng hấp thu theo (2.2.1), chúng tôi thu được phổ đồ như hình 6: Hình 6. Sắc kí đồ kết quả khảo sát bước sóng hấp thu của BA trên máy tử ngoại GBC Centra. 1. Peak dung môi MeOH 2. Peak chất phân tích BA Sau khi tiến hành quét phổ hấp thu của BA ở λ từ 200-600nm, thì chúng tôi nhận thấy rằng BA hấp thu cực đại ở bước sóng λ = 270nm. Vì vậy, lựa chọn bước sóng này trong các nghiên cứu tiếp theo. Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 29 3.1.2.Kết quả khảo sát thành phần pha động Tiến hành khảo sát thành phần pha động theo(2.2.2), thu được hình 7.1: Hình 7.1: Sắc kí đồ biểu diễn ảnh hưởng của thành phần pha động. (1): Tỉ lệ MeOH: H2O (70:30;v:v); thời gian lưu 2.635 (2): Tỉ lệ MeOH: H2O (60:40;v:v); thời gian lưu 3.347 (3): Tỉ lệ MeOH: H2O (50:50;v:v); thời gian lưu 4.929 (4): Tỉ lệ MeOH: H2O (40:60;v:v); thời gian lưu 8.649 (5): Tỉ lệ MeOH: H2O (30:70;v:v); thời gian lưu 18.117 Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 30 Bảng 4: Kết quả khảo sát thời gian lưu, chiều cao, diện tích peak khi thay đổi tỉ lệ thể tích pha động: Thành phần Thời gian lưu (phút) Diện tích Tín hiệu đo (mV) 70/30 2.635±0.01 157830.9±30.47 21082.3±40.32 60/40 3.347±0.01 154654.3±7.53 17660.0±12.29 50/50 4.929±0.02 152889.1±26.71 13693.8±22.26 40/60 8.649±0.02 151367.8±39.91 11069.3±12.52 30/70 18.117±0.01 146190.5±17.25 4738.5±21.64 140000 145000 150000 155000 160000 70/30 60/40 50/50 40/60 30/70 v/v di ện tí ch Hình 7.2: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa thành phần pha động và diện tích Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 31 Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy tỉ lệ MeOH trong hỗn hợp pha động càng nhỏ độ phân cực của pha động càng tăng khả năng lôi kéo các chất trong cột càng kém làm cho BA giữ lại trong cột lâu, hình dạng peak bị tù không sắc nhọn. Khi tỉ lệ MeOH trong hỗn hợp pha động lớn độ phân cực giảm, khả năng lôi kéo các chất tăng làm cho peak của BA xuất hiện sớm và hình dạng peak sắc nhọn. Nhưng khi peak của BA xuất hiện sớm thì dễ bị ảnh hưởng của các peak tạp có trong nền mẫu . Do vậy, dựa vào sắc kí đồ và thời gian lưu thì tỉ lệ MeOH/H2O(40/60,v/v) thích hợp để phân tích BA trong nền mẫu giá. 3.1.3. Kết quả khảo sát tốc độ dòng pha động: Tiến hành khảo sát tốc độ dòng theo (2.2.3), chúng tôi thu được sắc kí đồ hình 8.1 như sau: Hình 8.1: Sắc kí đồ biểu diễn ảnh hưởng của tốc độ dòng Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 32 Bảng 3: Kết quả khảo sát thời gian lưu, chiều cao, diện tích peak khi thay đổi tốc độ dòng. Tốc độ dòng Thời gian lưu (phút) Bề rộng đáy,Δt (phút) Tín hiệu đo (mV) 0.5 ml/phút 16.967±0.04 2.20±0.00 13789.9±23.71 0.8 ml/phút 11.016±0.03 1.80±0.00 18413.3±18.72 1.0 ml/phút 8.649±0.01 1.20±0.00 19511.4±34.84 1.2 ml/phút 7.551±0.01 1.20±0.00 20118.7±80.40 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 ml/phút ph út Hình 8.2: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa tốc độ dòng và bề rộng đáy. Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 33 0 5000 10000 15000 20000 25000 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 ml/phút m V Hình 8.3: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa tốc độ dòng và tín hiệu đo Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy vận tốc pha động càng nhỏ ái lực giữa chất phân tích với pha tĩnh càng lớn chất bị giữ lại trong cột càng lâu. Như vậy, khi tốc độ pha động nhỏ mất nhiều thời gian phân tích và làm cho hình dạng peak bị tù không sắc nhọn. Càng tăng tốc độ pha động thì sự tương tác giữa chất phân tích với pha tĩnh càng ít, nên thời gian lưu ngắn. Nhưng khi tốc độ pha động cao thì thời gian lưu ngắn chất phân tích dễ bị ảnh hưởng bởi tạp chất ở nền mẫu và áp suất cột cao rất dễ hỏng cột. Khi nghiên cứu ở tốc độ dòng pha động từ 0.5 đến 1.2 ml/phút thời gian lưu giảm dần và bề rồng đáy giảm dần, peak càng sắc nhọn. Ở tốc độ dòng pha động 1.2 ml/phút và 1.0ml/phút thì có bề rộng đáy như nhau là 1.2 phút, thời gian lưu cũng gần nhau. Nhưng ở tốc độ dòng pha động 1.2 ml/phút thì áp suất cột 193 kgP lớn hơn so với tốc độ dòng 1.0 ml/phút là 124 kgP nên trong nghiên cứu này chúng tôi chọn tốc độ dòng pha động 1.0 ml/phút. Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 34 3.1.4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính và dựng đường chuẩn: Sau khi tiến hành tiêm BA chuẩn ở các nồng độ theo (2.2.5) vào máy HPLC với các thông số ở trên và thu được sắc kí đồ hình 9.1: Hình 9.1a: Sắc kí đồ BA chuẩn 0.5mg/L Hình 9.1b: Sắc kí đồ BA chuẩn 1.0 mg/L Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 35 Hình 9.1c: Sắc kí đồ BA chuẩn 2.0 mg/L Hình 9.1d: Sắc kí đồ BA chuẩn 4.0 mg/L Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 36 Hình 9.1e: Sắc kí đồ BA chuẩn 7.0 mg/L Hình 9.1f: Sắc kí đồ BA chuẩn 10.0 mg/L Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 37 Hình 9.1g: Sắc kí đồ BA chuẩn 25.0 mg/L Bảng 5: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính (số liệu lấy theo diện tích) Nồng độ (mg/L) Diện tích 0.5 56215.4 ± 13353.7 1.0 78698.0 ± 22887.2 2.0 129389.6 ± 12747.9 4.0 247269.2 ± 1104.5 7.0 442071.7 ± 30025.5 10.0 498742.4 ± 49.8 25.0 1263819.8 ± 25350.5 Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 38 Hình 9.2: Đồ thị biểu diễn khoảng tuyến tính của BA Nhận xét: từ đồ thị cho thấy khoảng tuyến tính khi phân tích BA trên HPLC/UV tương đối rộng ( từ 0.5 mg/L đến 25 mg/L) với hệ số tương quan r2=0.9987 3.1.5. Khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng: Sau khi tiến hành khảo sát nồng độ chuẩn BA từ cao xuống thấp từ 500 đến 100 µg/L theo (2.2.6), xác định được giá trị Cmin là 100µg/L. Giá trị LOD và LOQ được tính dựa trên sắc kí đồ chuẩn 100 µg/L. Bảng 6: Kết quả khảo sát LOD, LOQ dựa theo chất chuẩn S N S\N LOD(µg/L) LOD(µg/L) TB LOQ(µg/L)TB RSD(%) 1 40.6 4.7 8.64 34.72 2 42.8 4.3 9.96 30.12 3 39.9 5.0 7.98 37.59 34.15±9.36 113.8±31.18 11.04 ĐỒ THỊ ĐƯỜNG CHUẨN BA y = 49028x + 34895 R2 = 0.9987 0 500000 1000000 1500000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 Nồng độ (ppm) D iện tíc h Nồng độ (mg/L) Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 39 3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TRÊN MẪU TRẮNG: (Các số liệu thực nghiệm được tính theo diện tích peak và dựa vào đường chuẩn) 3.2.1. Kết quả khảo sát thời gian ngâm mẫu và hệ dung môi chiết: Khi tiến hành ngâm mẫu với ba hệ dung môi và ở các thời gian khác nhau theo (2.3.2) chúng tôi thu được các sắc kí đồ ở hình 10.1 Hình10.1a:Sắc kí đồ biểu diễn khả năng chiết của hệ dung môi MeOH: H2O (80:20,v:v) (dm1) ở 24 giờ Hình10.1b: Sắc kí đồ biểu diễn khả năng chiết của hệ dung môi MeOH:HCOOH 99.9%:H2O (15:1:4,v:v:v) (dm2) ở 24 giờ (dd mẫu) (dd chuẩn) (dd mẫu) (dd chuẩn) Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 40 Hình10.1c: Sắc kí đồ biểu diễn khả năng chiết của hệ dung môi MeOH:CHCl3: HCOOH 99.9%:H2O (12:5:1:2,v:v:v:v) (dm3) ở 24 giờ. Bảng 7: Kết quả khảo sát thời gian ngâm mẫu và hệ dung môi chiết Thời gian ngâm mẫu 6h 12h 18h 24h 30h Nồng độ BA khi ngâm với hệ dm1 (mg/L) 0.58 ±0.09 1.34±0.16 1.72±0.21 2.40±0.16 2.42±0.12 Nồng độ BA khi ngâm với hệ dm2 (mg/L) 1.26±0.13 2.47±0.10 5.35±0.20 6.98±0.37 6.97±0.28 Nồng độ BA khi ngâm với hệ dm3 (mg/L) 0.89±0.15 1.82±0.37 3.40±0.36 5.52±0.45 5.49±0.99 (dd chuẩn) (dd mẫu) Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 41 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 6 12 18 24 30 h m g/ L Hình 10.2: Đồ thị biểu diễn thời gian ngâm mẫu (dm 2) 0 2 4 6 8 I II III dung môi m g/ L Hình 10.3 : Đồ thị biểu diễn khả năng tách của các hệ dung môi với thời gian ngâm mẫu 24h Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 42 Nhận xét: Qua kết quả khảo sát và đồ thị biểu diễn, thấy rằng khả năng chiết BA của hệ dung môi 2 là tốt nhất. Vì ở hệ dung môi 2 có thêm acid formit làm tăng khả năng tách BA trong mẫu, còn ở hệ dung môi 3 do có thêm CHCl3 thích hợp cho việc chiết các cytokinin riboside hơn [13]. Thời gian ngâm mẫu tăng từ 6h đến 24h thì hàm lượng BA thu được tăng dần, nhưng từ 24h đến 30h hàm lượng BA thay đổi không đáng kể. Có thể nói ở 24h BA đã được chiết ra hoàn toàn. Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 43 3.2.2. Kết quả khảo sát thể tích rửa giải: Khi tiến hành rửa giải BA trên cột SPE C18 lần lượt với từng ml MeOH theo(2.3.3), chúng tôi thu được sắc kí đồ ở hình 11.1: Hình 11.1a: Sắc kí đồ ứng với thể tích của 1ml MeOH rửa giải Hình 11.1b: Sắc kí đồ ứng với thể tích của 2ml MeOH rửa giải (dd chuẩn) (dd mẫu) (dd mẫu) (dd chuẩn) Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 44 Hình 11.1c: Sắc kí đồ ứng với thể tích của 3ml MeOH rửa giải Hình 11.1d: Sắc kí đồ ứng với thể tích của 4ml MeOH rửa giải (dd mẫu) (dd chuẩn) (dd mẫu) (dd chuẩn) Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 45 Bảng 8: Kết quả khảo sát thể tích rửa giải 0 2 4 6 8 0 1 2 3 4 5 ml m g/ L Hình 11.2: Đồ thị biểu diễn thể tích rửa giải Nhận xét: Qua kết quả khảo sát chúng tôi nhận thấy rằng rửa giải đến 3ml MeOH (CH3COOH 0.05%) thì nồng độ BA không thay đổi nữa, BA được tách ra hoàn toàn. Như vậy, chọn thể tích dung môi rửa giải là 3ml MeOH (CH3COOH 0.05%) là tối ưu cho qui trình phân tích. Thể tích dung môi rửa giải 1ml 2ml 3ml 4ml Nồng độ BA (mg/L ) 2.66±0.20 4.34±0.47 6.96±0.39 6.86±0.39 Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 46 3.2.3. Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của quy trình: Vì nồng độ BA trong mẫu giá trắng cao nên khi tiến hành khảo sát hiệu suất thu hồi của quy trình theo (2.3.4) chúng tôi thêm lần lược BA chuẩn ở ba nồng độ 10mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L. Và thu được sắc kí đồ hình 12 sau: Hình 12a Sắc kí đồ ứng với mẫu giá trắng Hình 12b: Sắc kí đồ ứng với mẫu giá trắng thêm 1ml BA (10 mg/L )chuẩn (dd mẫu) (dd mẫu) (dd chuẩn) (dd chuẩn) Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 47 Hình 12c: Sắc kí đồ ứng với mẫu giá trắng thêm 1ml BA (15 mg/L) chuẩn Hình 12d: Sắc kí đồ ứng với mẫu giá trắng thêm 1ml BA (20mg/L) chuẩn (dd chuẩn) (dd chuẩn) (dd mẫu) (dd mẫu) Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 48 Bảng 9: Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi Nồng độ BA chuẩn cho vào mẫu giá trắng(mg/L) 10 15 20 Hiệu suất thu hồi TB (%) 84.10±5.97 81.58±1.19 85.08±0.76 % RSD 2.77 0.59 0.36 Nhận xét: Kết quả thu được có hiệu suất thu hồi 84.10% (thêm chuẩn BA 10mg/L); 81.60% (thêm chuẩn BA 15 mg/L); 85.10% (thêm chuẩn BA 20 mg/L). Như vậy, ở các nồng độ khác nhau hiệu suất thu hồi của chúng không chênh lệch nhau nhiều. Có độ lặp lại khá tốt phù hợp cho việc phân tích BA trong nền mẫu giá. Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 49 Cân 5g mẫu+ 25ml dung môi (MeOH:HCOOH:H2O (15:1:4,v:v:v)), giữ trong 24h Hòa tan trong 8ml đệm Amoniumformat pH=3.7 Đánh siêu âm 5 phút,lọc,đuổi dung môi đến khô Cột SPE C18 Đuổi dung môi, định mức lại bằng 1ml MeOH, lọc qua màng lọc 45µm Hoạt hóa với 10ml MeOH Rửa giải với 3ml MeOH (HAc 0.05%) HPLC/UV 3.3. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TRÊN MẪU THẬT 3.3.1.Quy trình phân tích BA: Cân 5g mẫu và thêm 25ml hỗn hợp MeOH:HCOOH 99.9%:H2O (15:1:4,v:v:v), lắc đều, ngâm trong 24h. Mẫu được đánh siêu âm trong 5 phút, lọc. Dung dịch chiết được đuổi hết dung môi (đuổi khí hoặc đun cách thủy) đến khô. Hòa tan trong 8ml dung dịch đệm Amoniumformat (pH=3.7)[14]. Cho dung dịch thu được qua cột SPE (cột đã được hoạt hóa trong 10ml MeOH). Rửa giải bằng 3ml MeOH (HAc 0.05%), đuổi dung môi và định mức lại thành 1ml. Lọc qua màng lọc 0.45 µm, tiêm vào HPLC/UV, ghi diện tích peak. Hình 13: Sơ đồ quy trình xác định BA trên giá (đỗ) Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 50 3.3.2. Kết quả phân tích BA trên mẫu giá: Vì giá là thực phẩm mà có thể ăn sống, trụng hoặc chín. Nên chúng tôi tiến hành phân tích mẫu giá (chợ Xóm Thuốc ) ở cả ba trạng thái và thu được kết quả sau: Hình 14a: Sắc kí đồ ứng với mẫu giá sống Hình 14b: Sắc kí đồ ứng với mẫu giá trụng (dd mẫu) (dd chuẩn) (dd chuẩn) (dd mẫu) Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 51 Hình 14c: Sắc kí đồ ứng với mẫu giá chín Bảng 10: Kết quả phân tích trên nền mẫu giá Nhận xét : Như vậy, khi giá (đỗ) được luộc chín kỹ thì hàm lượng BA giảm rất đáng kể . 1 Xem các tính toán ở phần phụ lục. Mẫu Giá sống Giá trụng Giá chín Hàm lượng (ppm)1 4.52±0.19 1.63±0.05 0.44±0.06 (dd chuẩn) (dd mẫu) Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 52 3.3.3.Kết quả phân tích BA mẫu giá ở các chợ và siêu thị: Khi phân tích mẫu giá ở các chợ và siêu thị, chúng tôi thu được sắc kí đồ sau: Hình 15a: Sắc kí đồ ứng với mẫu giá ở chợ Xóm Thuốc Hình 15b: Sắc kí đồ ứng với mẫu giá ở chợ Gò Vấp (dd chuẩn) (dd mẫu) (dd chuẩn) (dd mẫu) Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 53 Hình 15c: Sắc kí đồ ứng với mẫu giá ở siêu thị Văn Hóa Văn Lang Hình 15d: Sắc kí đồ ứng với mẫu giá ở siêu thị Big C (dd mẫu) (dd chuẩn) (dd chuẩn) (dd mẫu) Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 54 Hình 15e: Sắc kí đồ ứng với mẫu giá ở siêu thị Co.op Bảng 11: Kết quả phân tích mẫu giá ở chợ và siêu thị STT Mẫu Hàm lượng (ppm)2 1 Giá trắng 1.38± 0.04 2 Chợ Gò Vấp 5.06± 0.14 3 Chợ Xóm Thuốc 4.52± 0.19 4 Siêu thị Big C 3.64± 0.10 5 Siêu thị Co.op 2.28± 0.09 6 Siêu thị Văn Lang 3.70 ±0.12 Nhận xét: Mẫu giá ở các chợ thì hàm lượng cao hơn gần 4 lần, còn ở các siêu thị cao hơn gần 2 lần so với giá tự trồng không sử dụng hóa chất. 2 Xem các công thức tính toán ở phần phụ lục. (dd mẫu) (dd chuẩn) Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 55 3.3.4. Kết quả phân tích BA trên các mẫu rau khác: Tiến hành xác định BA trên một số mẫu rau quả thường dùng hằng ngày, chúng tôi thu được sắc kí đồ sau: Hình 16a: Sắc kí đồ ứng với mẫu rau mầm Hình 16b: Sắc kí đồ ứng với mẫu khổ qua (dd mẫu) (dd mẫu) (dd chuẩn) (dd chuẩn) Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 56 Hình 16c: Sắc kí đồ ứng với mẫu rau muống Hình 16d: Sắc kí đồ ứng với mẫu rau xà lách (dd mẫu) (dd chuẩn) (dd mẫu) (dd chuẩn) Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 57 Bảng 12: Kết quả phân tích trên các nền mẫu rau quả khác TT Mẫu Hàm lượng(ppm)3 1 Giá trắng 1.38 ± 0.04 2 Rau mầm 1.97 ± 0.04 3 Khổ qua 0.87 ± 0.09 4 Rau muống 1.84 ± 0.08 5 Xà lách 1.89 ± 0.13 Nhận xét: Hàm lượng BA trong các mẫu rau, giá thì cao hơn trong mẫu khổ qua vì BA tác động mạnh lên quá trình hình thành chồi, kích thích sự nảy mầm của của hạt và củ, tạo ưu thế của hạt vì thế trong phần thịt không cho cao. 3 Xem kết quả tính toán ở phần phụ lục