Luận văn Nghiên cứu tạo cây dứa cayenne in vitro sạch virus gây bệnh héo đỏ đầu lá (pmwav- Pineapple mealybug wilt associated virus)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus) NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2001 – 2005 SINH VIÊN THỰC HIỆN: TÔN BẢO LINH Thành phố Hồ Chí Minh 2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus) GVHD: TS. TRẦN THỊ DUNG SVTH: TÔN BẢO LINH CN. LƢU PHÚC LỢI Thành phố Hồ Chí Minh 2005 iii LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. - Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua. - TS. Trần Thị Dung và CN. Lƣu Phúc Lợi đã tận tình hƣớng dẫn và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - TS. Bùi Minh Trí và các anh chị phụ trách phòng CNSH thuộc Trung tâm phân tích thí nghiệm Đại học Nông Lâm Tp. HCM. - Thầy Trần Ngọc Hùng cùng các chị thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học Đại học Nông Lâm Tp.HCM. - Trung tâm phân tích môi trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM. - Hai bạn Nguyễn Phú Dũng, Lê Thái Bảo Ngọc, chị Trƣơng Bùi Nguyệt Hảo cùng toàn thể lớp CNSH27 thân yêu đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Tháng 08 năm 2005 Tôn Bảo Linh iv TÓM TẮT TÔN BẢO LINH, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2005. “NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus)” Hội đồng hướng dẫn:  TS. Trần Thị Dung  CN. Lưu Phúc Lợi Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ sinh học và Trung tâm phân tích thí nghiệm Đại học Nông Lâm Tp. HCM trên đối tượng cây dứa Cayenne in vitro thuộc 3 giống Trung Quốc, Thái Lan và Lâm Đồng bắt nguồn từ chồi ban đầu nhiễm virus gây bệnh héo đỏ đầu lá (PMWaV). Tiến hành tạo chồi dứa Cayenne in vitro sạch PMWaV từ chồi in vitro bị nhiễm virus bằng phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (ĐST). Nguồn chồi tái sinh theo phương pháp tạo cây sạch virus sẽ được kiểm chứng bằng kĩ thuật RT-PCR với mồi đặc hiệu cho PMWaV. Trên cơ sở tạo chồi sạch virus, tiến hành nghiên cứu khả năng tái sinh của ĐST nuôi cấy với 12 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại với các chỉ tiêu theo dõi như thời gian tái sinh, tỉ lệ tái sinh và hệ số nhân chồi; nghiên cứu sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ ĐST với các chỉ tiêu theo dõi như chiều cao chồi, số lá, số rễ và chiều dài rễ. Bằng kĩ thuật RT – PCR, thực hiện kiểm tra PMWaV – 1 và PMWaV – 2 đối với 12 mẫu lá của chồi tái sinh từ ĐST sau 70 ngày nuôi cấy. Những kết quả thu được: 1. Khả năng tái sinh của ĐST: thời gian và tỉ lệ tái sinh chủ yếu do kích thước mẫu cấy quyết định. Mẫu cấy có kích thước từ 0,5 – 1 mm tái sinh trong vòng 14 – 15 ngày và tỉ lệ tái sinh vào khoảng 79,63%. 2. Sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ ĐST: sự khác biệt có ý nghĩa của các chỉ tiêu theo dõi chủ yếu do giống quyết định, giống Cayenne Trung Quốc và Thái Lan sinh trưởng nhanh hơn so với giống Cayenne Lâm Đồng. Nhìn chung, quá trình xử lí nhiệt (370C, 30 ngày) không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của chồi tái sinh. v 3. Việc tạo cây sạch virus bằng phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST hiệu quả hơn so với phương pháp đối chứng chỉ nuôi cấy ĐST. Với phương pháp kết hợp xử lí nhiệt và nuôi cấy ĐST, tỉ lệ cây sạch PMWaV -1 đạt 66,67% và PMWaV – 2 đạt 100%, trong khi chỉ nuôi cấy ĐST chồi tái sinh vẫn còn nhiễm PMWaV – 1. vi SUMMARY TON BAO LINH, Nong Lam University Ho Chi Minh City. August, 2005. “Study of producing in vitro free PMWaV (Pineapple mealybug wilt associated virus) Cayenne pineapple plants”. Two free – virus plant producing methods involving heat treatment followed by meristem culture and simply meristem culture were used to eliminate PMWaV-1 and PMWaV-2 from in vitro PMWaV infected pineapple plants. Three Smooth Cayenne cultivars originated from China, Thailand and Lam Dong were used as culturing materials. With the completely randomized design, factors that influenced on the regeneration and growth of propagated meristem tip, especially heat treatment at 37 0 C in 30 days was also studied. The experiment result showed that meristem regeneration was mainly influenced by the size of the excised tissue. Meanwhile, the growth of the regenerative shoots were influenced by cultivar factors. Heat treatment did not considerably influence on the regeneration and subsequent growth of propagated meristem. All samples (3/3) without heat treatment were still infected with PMWaV-1 and one third of samples (3/9) with heat treatment showed negative infection results with PMWaV-1. Finally, all samples (12/12) had negative results when tested for PMWaV-2 with RT-PCR. vii MỤC LỤC Trang tựa ...................................................................................................................... i Lời cảm ơn .................................................................................................................... iii Tóm tắt .......................................................................................................................... iv Summary ...................................................................................................................... vi Mục lục ...................................................................................................................... vii Danh sách các bảng ..................................................................................................... xi Danh sách các hình và sơ đồ ...................................................................................... xii Danh sách các chữ viết tắt xiii PHẦN 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1 1.1.Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu...................................................... 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2 1.3.Giới hạn của đề tài .............................................................................................. 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 2.1.Nguồn gốc của cây dứa ....................................................................................... 3 2.2. Đặc điểm thực vật học và sinh thái cây dứa .................................................... 3 2.2.1. Đặc điểm thực vật học .................................................................................... 3 2.2.2.Sinh thái cây dứa ............................................................................................. 4 2.3.Phân loại .............................................................................................................. 5 2.4.Các nhóm dứa chính và các giống dứa phổ biến ở Việt Nam ....................... 6 2.4.1.Các nhóm dứa chính ....................................................................................... 6 2.4.1.1. Nhóm Cayenne ............................................................................................. 6 2.4.1.2. Nhóm Queen ................................................................................................. 7 2.4.1.3. Nhóm Spanish .............................................................................................. 7 2.4.2. Các giống dứa phổ biến ở Việt Nam ............................................................. 7 viii 2.4.2.1. Dứa hoa Phú Thọ ......................................................................................... 7 2.4.2.2. Dứa hoa Na Hoa (Hoa Bali) ........................................................................ 8 2.4.2.3. Dứa Kiên Giang và dứa Bến Lức (từ địa phƣơng là “khóm”) ............... 8 2.4.2.4. Nhóm dứa Cayenne .................................................................................... 8 2.5. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa ............................................................. 9 2.5.1. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa trên thế giới .................................... 9 2.5.2. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa ở Việt Nam ...................................... 9 2.5.2.1. Tình hình sản xuất ...................................................................................... 9 2.5.2.2. Sản lƣợng dứa .............................................................................................. 10 2.6. Tình hình sâu bệnh trên cây dứa ..................................................................... 10 2.6.1. Các loại sâu hại dứa ....................................................................................... 10 2.6.2. Bệnh hại dứa và phòng trừ ............................................................................ 11 2.6.2.1. Bệnh thối lõi và thối rễ ............................................................................... 11 2.6.2.2. Bệnh thối mềm ............................................................................................ 11 2.6.2.3. Bệnh “luộc lá” .............................................................................................. 12 2.6.2.4. Tuyến trùng hại dứa .................................................................................... 12 2.7.Bệnh héo do virus ............................................................................................... 13 2.8. Phƣơng pháp tạo cây sạch virus ....................................................................... 14 2.8.1. Sơ lƣợc về hình thái, cấu tạo và sự di chuyển của virus thực vật ............. 14 2.8.2. Cơ sở của các phƣơng pháp tạo cây sạch virus ........................................... 15 2.8.3. Các phƣơng pháp tạo cây sạch virus ............................................................ 15 2.8.3.1. Xử lí nhiệt ..................................................................................................... 16 2.8.3.2. Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng .......................................................................... 16 ix 2.8.3.3 Xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST ............................................................... 19 2.8.3.4 Tạo chồi bất định kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng ............................... 20 2.8.3.5. Vi ghép .......................................................................................................... 21 2.9. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cây do virus ............................................. 21 2.9.1. Các phƣơng pháp kiểm tra dựa trên quá trình huyết thanh học ............. 21 2.9.1.1. Cơ sở khoa học của kĩ thuật huyết thanh học ........................................... 21 2.9.1.2. Phƣơng pháp ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) ............... 21 2.9.1.3. Phƣơng pháp TBIA (Tissue blot immunoassay) ...................................... 22 2.9.2. Phƣơng pháp hiển vi quang học và vi điện tử ............................................. 22 2.9.2.1. Quan sát bằng kính hiển vi quang học ..................................................... 22 2.9.2.2. Quan sát bằng kính hiển vi điện tử ............................................................ 22 2.9.3. Phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử ................................................... 23 2.9.3.1. Cơ sở khoa học của các phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử ....... 23 2.9.3.2. Polymerase chain reaction (PCR) và Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) .................................................................................................. 23 2.9.3.3. Phƣơng pháp sử dụng các đoạn đa dạng về chiều dài hạn chế (Restriction fragment length polymorphism – RFLP) .................................................. 23 2.9.3.4. Probe đánh dấu (Labelled probes) ............................................................. 24 2.10. Các nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá (bệnh wilt) ....................................... 24 2.10.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc ......................................................................... 24 2.10.2. Các nghiên cứu trong nƣớc ......................................................................... 26 PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 28 3.1. Nội dung.............................................................................................................. 28 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................... 28 x 3.3. Nội dung 1: Tạo cây dứa Cayenne in vitro sạch virus bằng cách kết hợp xử lí nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng ......................................................................... 28 3.3.1. Vật liệu ............................................................................................................. 28 3.3.1.1 Mẫu nuôi cấy ................................................................................................. 28 3.3.1.2. Thiết bị và dụng cụ ...................................................................................... 28 3.3.1.3. Hóa chất ........................................................................................................ 29 3.3.1.4. Phƣơng pháp tiến hành ............................................................................... 29 3.3.1.5. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 30 3.4. Nội dung 2: Kiểm tra PMWaV trên chồi dứa in vitro tái sinh từ đỉnh sinh trƣởng .................................................................................................................................... 32 3.4.1. Vật liệu ............................................................................................................. 32 3.4.2. Phƣơng pháp tiến hành .................................................................................. 32 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 35 4.1.Khảo sát khả năng tái sinh của ĐST nuôi cấy trên môi trƣờng MS .............. 35 4.1.1Thời gian tái sinh ............................................................................................. 35 4.1.2. Tỷ lệ tái sinh .................................................................................................... 36 4.1.3. Hệ số nhân chồi .............................................................................................. 36 4.2.Khảo sát ảnh hƣởng của giống và quá trình xử lí nhiệt lên sự sinh trƣởng của cây tái sinh từ ĐST .......................................................................................................... 38 4.2.1 Chiều cao chồi ............................................................................................... 38 4.2.2. Số lá .................................................................................................................. 39 4.2.3. Số rễ ................................................................................................................. 40 4.2.4 Chiều dài rễ ...................................................................................................... 41 4.3. Kết quả kiểm tra PMWaV chồi tái sinh từ ĐST ............................................ 43 4.3.1. Kết quả kiểm tra PMWaV-1 ......................................................................... 43 xi 4.3.2. Kết quả kiểm tra PMWaV-2 ........................................................................ 44 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 47 5.1.Kết luận ............................................................................................................... 47 5.2.Đề nghị ................................................................................................................. 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC xii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của ĐST chồi dứa Cayenne ........................................................................................... 30 Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của giống và quá trình xử lí nhiệt lên sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ ĐST ............................................................. 31 Bảng 3.3 Thành phần mix phản ứng RT – PCR .................................................... 33 Bảng 3.4 Các mẫu lá của chồi dứa tái sinh từ ĐST được kiểm tra PMWaV bằng kĩ thuật RT-PCR .......................................................................................................... 34 Bảng 4.1 Ảnh hưởng các yếu tố giống, xử lí nhiệt và kích thuớc mẫu đến TGTS của ĐST chồi dứa Cayenne ........................................................................................... 35 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của các yếu tố giống, xử lí nhiệt và kích thước mẫu đến tỉ lệ tái sinh (TLTS) của ĐST chồi dứa Cayenne ............................................................... 36 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của các yếu tố giống, xử lí nhiệt đến hệ số nhân chồi (HSNC) của ĐST chồi dứa Cayenne ................................................................................. 37 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của các yếu tố giống và xử lí nhiệt đến chiều cao chồi dứa tái sinh từ ĐST ............................................................................................................ 38 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của các yếu tố giống và xử lí nhiệt đến số lá của chồi dứa tái sinh từ ĐST ................................................................................................................ 40 Bảng 4.6 Ảnh hưởng của các yếu tố giống và xử lí nhiệt đến số rễ của chồi dứa tái sinh từ ĐST ................................................................................................................ 41 Bảng 4.7 Ảnh hưởng của các yếu tố giống và xử lí nhiệt đến số rễ của chồi dứa tái sinh từ ĐST ................................................................................................................ 42 Bảng 4.8 Kết quả kiểm tra PMWaV ở chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST sau 70 ngày nuôi cấy .................................................................................................................. 46 xiii ] DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Hình Trang Hình 2.1 Cấu tạo cơ bản của đỉnh sinh trưởng ...................................................... 16 Hình 2.2 Qui trình nuôi cấy ĐST ........................................................................... 19 Sơ đồ 2.3 Qui trình tạo cây sạch bệnh bằng phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST .......................................................................................................... 20 Hình 4.1 Chồi dứa trước khi tách ĐST và ĐST được tách quan sát dưới kính hiển vi soi nổi SZ40 ................................................................................................................. 36 Hình 4.2 Chồi dứa tái sinh từ ĐST sau 30 ngày nuôi cấy ..................................... 39 Hình 4.3 Chồi dứa tái sinh từ ĐST sau 70 ngày nuôi cấy ..................................... 39 Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm RT - PCR của chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST không qua xử lí nhiệt sử dụng primer đặc trưng cho PMWaV-1 ................ 43 Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm RT - PCR của chồi dứa Cayenn