Luận văn Nghiên cứu tạo đột biến khử độc và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp staphylococcal enterotoxin b (seb) phục vụ cho việc chế tạo kít phát hiện tụ cầu vàng trong thực phẩm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC -------*------- PHAN THỊ HOÀNG HẢO NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN KHỬ ĐỘC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) PHỤC VỤ CHO VIỆC CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN TỤ CẦU VÀNG TRONG THỰC PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 604280 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. NCVC Chu Hoàng Hà Thái Nguyên, Năm 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dưới đây do tôi và nhóm cộng sự nghiên cứu phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học thực hiện từ tháng 3 tới tháng 9 năm 2010. Hà Nội, ngày 27 tháng 09 năm 2010 Học viên ký tên Phan Thị Hoàng Hảo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên iii LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. NCVC Chu Hoàng Hà, TS. Nguyễn Hữu Cường, TS. Phạm Bích Ngọc phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS. Nghiêm Ngọc Minh đã cho phép tôi tham gia thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) phục vụ cho tạo kít phát hiện nhanh ngộ độc thực phẩm do độc tố tụ cầu vàng” Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo tận tình của TS. Lê Văn Sơn, TS. Lâm Đại Nhân, CN. Hoàng Hà, Ths. Lê Thu Ngọc và các cán bộ phòng Công nghệ tế bào thực vật cùng các bạn sinh viên trong phòng. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học, Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại Trường và Viện. Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn! Phan Thị Hoàng Hảo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên iv MỤC LỤC Trang CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................................... viii DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. ix DANH MỤC HÌNH .............................................................................................. xi MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 1.1. Tình hình bệnh ngộ độc thực phẩm do Saphylococcus aureus và độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam................................ 3 1.1.1. Khái quát về bệnh ngộ độc thực phẩm ....................................................... 3 1.1.2. Tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm do Saphylococcus aureus và độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam .................... 4 1.2. Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus ............................................................... 6 1.2.1. Đặc điểm phân loại ...................................................................................... 6 1.2.2. Đặc điểm vi khuẩn học ................................................................................ 6 1.2.2.1. Hình dạng và kích thƣớc .......................................................................... 6 1.2.2.2. Độc tố và khả năng gây bệnh .................................................................... 7 1.2.3. Hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus ............................................... 10 1.3. Nội độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B .............................................. 10 1.3.1. Cấu trúc phân tử staphylococcal enterotoxin B ....................................... 10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên v 1.3.2. Cơ chế gây độc của staphylococcal enterotoxin B .................................... 12 1.3.3. Staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp và tiềm năng ứng dụng ............ 14 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 16 2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu ............................................ 16 2.1.1. Chủng vi khuẩn và plasmid ....................................................................... 16 2.1.2. Các bộ kít .................................................................................................... 16 2.1.3. Hóa chất, máy móc và thiết bị ................................................................... 16 2.1.4. Môi trƣờng và đệm .................................................................................... 17 2.1.5. Cặp mồi sử dụng ........................................................................................ 17 2.1.6. Phần mềm................................................................................................... 17 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 17 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu ......................................................................................... 17 2.2.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................... 18 2.2.2.1. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................. 18 2.2.2.2. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)...................... 20 2.2.2.3. Phƣơng pháp xử lý enzym hạn chế ........................................................ 20 2.2.2.4. Phƣơng pháp tinh sạch ADN từ gel agarose .......................................... 22 2.2.2.5. Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector .......................................... 23 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên vi 2.2.2.6. Phƣơng pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào vi khuẩn Escherichia coli DH5α ............................................................................................................. 24 2.2.2.7. Phƣơng pháp tách ADN plasmid từ tế bào vi khuẩn Escherichia coli DH5α .................................................................................................................... 24 2.2.2.8. Biểu hiện protein staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3) ...................................................... 26 2.2.2.9. Phƣơng pháp điện di protein trên gel polyacrylamide .......................... 26 2.2.2.10. Phƣơng pháp tinh sạch protein ............................................................ 27 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 28 3.1. Kết quả nhân gen seb phục vụ cho thiết kế vector biểu hiện ...................... 29 3.1.1. Thiết kế mồi ............................................................................................... 30 3.1.2. Kết quả PCR nhân gen seb ........................................................................ 31 3.1.3. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên gen seb .................................. 32 3.2. Kết quả thiết kế vector biểu hiện pET21a+ mang gen seb đột biến ........... 34 3.2.1. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên pET21a+ .............................. 34 3.2.2. Phản ứng gắn đoạn gen đích seb vào vector biểu hiện ............................. 36 3.2.3. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony-PCR ......... 37 3.2.4. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzym hạn chế ................... 38 3.2.5. Kết quả giải trình tự gen seb đột biến trên vector biểu hiện ……. ……….……40 3.3. Kết quả biểu hiện gen mã hóa cho protein SEB tái tổ hợp ......................... 39 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên vii 3.3.1. Biến nạp vector tái tổ hợp pET21a+/SEB vào Escherichia coli chủng BL21(DE3) ........................................................................................................... 40 3.3.2. Kiểm tra sự biểu hiện gen seb.................................................................... 41 3.3.3. Tối ƣu các điều kiện biểu hiện gen seb ...................................................... 43 3.3.4. Tinh sạch protein tái tổ hợp SEB .............................................................. 47 KẾT LUẬN .......................................................................................................... 49 KIẾN NGHỊ ......................................................................................................... 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên viii CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Deoxyribonucleic acid APS Ammonium persulphate ARN Ribonucleic Acid bp Base pair cs Cộng sự dH2O Nước khử ion dNTP Deoxyribonucleotide EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit IPTG Isopropylthio--D-galactoside Kb Kilobase LB Luria and Bertani PBS Phosphate buffer saline PCR Polymerase Chain Reaction S. aureus Staphylococcus aureus SDS Sodium dodecyl sulfate SEB Staphylococcal enterotoxin B SEs Staphylococcal enterotoxins v/p Vòng / phút Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ix DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Sơ bộ tình hình nhiễm độc tụ cầu vàng trên toàn quốc từ 2007 – 2009 5 2.1 Chu kì phản ứng PCR 20 2.2 Công thức pha gel tách (12%) 27 2.3 Công thức pha gel cô (5%) 27 3.1 Trình tự cặp mồi nhân bản đoạn gen seb đột biến từ vector GS45350 31 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên x Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên xi DANH MỤC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Hình ảnh các vi khuẩn S. aureus dưới kính hiển vi điện tử 7 1.2 Các độc tố quyết định của S. aureus 8 1.4 Mô phỏng cấu trúc 3 chiều của protein SEB 12 1.5 Siêu kháng nguyên và miễn dịch không thụ động của các tế bào T 13 2.1 Sơ đồ các bước thí nghiệm 18 3.1 Các axit amin sai khác giữa protein SEB đột biến và protein SEB kiểu dại 29 3.2 Sơ đồ vector GS45350 mang gen seb đột biến 30 3.3 Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen seb bằng cặp mồi mSEB- F và mSEB- R 32 3.4 Điện di sản phẩm seb sau tinh sạch 33 3.5 Điện di plasmid pET21a+ 35 3.6 Điện di plasmid pET21a+ sau khi cắt bằng các enzym hạn chế 35 3.7 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp pET21a+/SEB vào tế bào khả biến E. coli DH5α 36 3.8 Kết quả điện di colony-PCR để chọn dòng khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp 37 3.9 Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pET21a+/SEB của các dòng khuẩn lạc 38 3.10 So sánh trình tự nucleotide của wtseb và mtseb bằng phần mềm Bioedit 39 3.11 Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen seb bằng cặp mồi mSEB- F và R 41 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên xii 3.12 Điện di so sánh protein tổng số của các tế bào E.coli BL21(DE3) 42 3.13 Điện di so sánh khả năng biểu hiện protein SEB ở các nhiệt độ khác nhau 45 3.14 So sánh khả năng biểu hiện protein SEB tại các điều kiện khác nhau 46 3.15 Điện di kiểm tra protein SEB dạng tan trước khi tinh sạch 47 3.16 Điện di kết quả tinh sạch protein SEB tái tổ hợp 48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU Thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn, độc tố của vi khuẩn hoặc thức ăn chứa các chất có tính độc hại đối với người ăn là một trong những nguyên nhân gây bệnh phổ biến trên toàn cầu, xảy ra ở các các nước có nền khoa học và y học phát triển cũng như các nước lạc hậu, kém phát triển. Tại Việt Nam, trong những năm gần đây số vụ nhiễm độc thực phẩm cũng ngày càng tăng và hậu quả ngày càng nghiêm trọng. Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) là vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất ở người và có khả năng gây nhiều bệnh khác nhau. Ngộ độc thức ăn do tụ cầu có thể do ăn, uống phải độc tố ruột của tụ cầu hoặc do tụ cầu vàng vốn cư trú ở đường ruột chiếm ưu thế về số lượng. Độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B (SEB) bền với nhiệt là tác nhân chính thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm do S. aureus. Hiện nay, việc phòng bệnh và điều trị bệnh ngộ độc do tụ cầu gặp rất nhiều khó khăn vì không phát hiện kịp thời tác nhân gây bệnh. Vì vậy, việc xác định sự có mặt SEB trong mẫu bệnh phẩm và thực phẩm đóng vai trò hết sức quan trọng. Trên thế giới và tại Việt Nam hiện nay cũng đã phát triển các loại kít phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh dựa trên nguyên tắc liên kết miễn dịch, phương pháp này đòi hỏi cần có kháng thể đặc hiệu. Do vậy việc biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên SEB tái tổ hợp không có độc tính, có khả năng gây phản ứng miễn dịch tạo các kháng thể IgG đặc hiệu là cấp thiết. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo đột biến khử độc và biểu hiện gen mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) phục vụ cho việc chế tạo kít phát hiện tụ cầu vàng trong thực phẩm. ” Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung Nghiên cứu hệ thống biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp staphylococcal enterotoxin B (SEB) đã được gây đột biến loại độc tính phục vụ cho việc chế tạo kít phát hiện vi khuẩn tụ cầu vàng (S. aureus) trong thực phẩm. Mục tiêu cụ thể - Thiết kế hệ vector biểu hiện gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp SEB đã được gây đột biến loại độc tính. - Biểu hiện và tinh sạch protein SEB trong tế bào vi khuẩn E. coli tạo nguyên liệu tạo kít phát hiện vi khuẩn tụ cầu vàng trong thực phẩm. Nội dung nghiên cứu Để thực hiện được mục tiêu đặt ra, đề tài thực hiện những nội dung chính sau: - Nghiên cứu tạo vector biểu hiện gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp SEB đã được gây đột biến loại độc tính. - Nghiên cứu các điều kiện để tối ưu khả năng biểu hiện protein SEB trong tế bào vi khuẩn E. coli. - Tinh sạch protein SEB để sử dụng làm nguyên liệu tạo kít phát hiện vi khuẩn tụ cầu vàng trong thực phẩm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình bệnh ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus và độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam 1.1.1. Khái quát về bệnh ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thực phẩm là một bệnh cấp tính xảy ra khi ăn phải thức ăn bị nhiễm vi khuẩn hoặc độc tố của vi khuẩn hoặc thức ăn có chứa các chất độc hại đối với người ăn. Bệnh có tính chất đột ngột, có thể nhiễm độc cho nhiều người tại cùng một thời điểm khi họ tiêu thụ cùng 1 loại thức ăn. Ngộ độc thực phẩm có những triệu chứng của một bệnh cấp tính như nôn mửa, tiêu chảy .v.v hoặc kèm theo các triệu chứng khác tùy theo từng loại tác nhân gây ngộ độc [43]. Thế giới đang trong kỷ nguyên toàn cầu hoá, việc sản xuất và phân phối sản phẩm thực phẩm không bị bó hẹp trong không gian địa lý dẫn đến khả năng lan tràn khắp thế giới các bệnh do thực phẩm ô nhiễm. Đồng thời, trong quá trình công nghiệp hoá, thực phẩm thường được sản xuất hàng loạt, đã làm số ca mắc các bệnh do thực phẩm ô nhiễm tăng đáng kể trong vòng 10 năm trở lại đây [21]. Hậu quả và thiệt hại kinh tế do các bệnh lây truyền qua thực phẩm rất lớn và có xu hướng ngày càng tăng. Các mầm bệnh vi sinh vật bao gồm: vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng và virus; trong đó các loại vi khuẩn gây ra tới 90% ca bệnh và tử vong ở người [9]. Trong số các nguyên nhân đã được xác định, một số vi khuẩn có khả năng gây ngộ độc cấp tính rất nguy hiểm, với tỷ lệ tử vong cao như: Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Vibrio chlolera, Samonella aureuslmonella, Campylobacterer, Yersinia enterocolitica .v.v [12]. Ở các nước châu Á, tụ cầu vàng (S. aureus) là nguyên nhân hàng đầu gây ra ngộ độc [2] . Thực phẩm ô nhiễm các vi sinh vật và các độc tố của chúng là một trong những nguyên nhân gây bệnh phổ biến trên toàn cầu, xảy ra ở các các nước có nền khoa học và y học phát triển cũng như các nước lạc hậu, kém phát triển [37]. Tại Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 Việt Nam, thực phẩm nhiễm khuẩn và các độc tố của chúng rất đa dạng, thường gặp nhất là các thực phẩm đường phố ăn ngay (46,6%), thịt hun khói (100%), xúc xích (96,6%), bánh gato (85%), Patê (83,3%) v.v. Đáng chú ý là vi khuẩn S. aureus thường được tìm thấy trong các thực phẩm bị nhiễm khuẩn [5]. 1.1.2. Tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus và độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam Tụ cầu S. aureus là một trong những loài vi khuẩn gây bệnh được ghi nhận sớm nhất vào đầu những năm 1880. Sự liên quan của tụ cầu tới nhiễm trùng, nhiễm độc thức ăn được biết đến từ năm 1914, nhưng mãi tới năm 1930, Dack và cs mới xác định được nhiễm trùng, nhiễm độc tụ cầu có thể gây ra bởi các độc tố ruột có trong dịch nuôi cấy tụ cầu vàng [4]. Từ giữa những năm 1969 và 1990, tại Anh, 53% trường hợp ngộ độc thực phẩm do S. aureus được ghi nhận là do tiêu thụ các sản phẩm từ thịt (đặc biệt là ruốc); 22% các trường hợp từ thịt gia cầm, 8% từ các sản phẩm liên quan sữa, 7% từ cá, sò, ốc .v.v và 3,5% từ trứng [38]. Tại Pháp, trong số các thực phẩm nhiễm S. aureus được ghi nhận trong hai năm (1999-2000) có các sản phẩm từ sữa (đặc biệt là pho-mát) (32%), thịt (22%), xúc xích (15%), cá và hải sản (11%), trứng và các sản phẩm từ trứng (11%) hoặc các sản phẩm khác từ gia cầm (9,5%) [17]. Tại Hoa Kỳ, trong số các trường hợp ngộ độc thực phẩm do S. aureus được báo cáo giữa các năm 1975 và 1982 thì 36% là do tiêu thụ thịt đỏ nhiễm khuẩn, 12,3% từ sa lát, 11,3% từ gia cầm, từ bánh ngọt: 5,1% đến 1,4%, còn lại là từ các sản phẩm liên quan tới sữa và hải sản [41]. Như vậy, giữa các nước khác nhau loại thực phẩm dễ nhiễm tụ cầu nhất cũng khác nhau. Cho tới nay tại Việt Nam thực tế chưa có những thống kê cụ thể về số ca mắc hay tử vong do ngộ độc thực phẩm liên quan đến SEB. Có nhiều nguyên nhân gây khó khăn cho quá trình thống kê tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm do SEB: 1) Bệnh nhẹ nên người bệnh không chủ động tìm kiếm sự điều trị tại các cơ sở chuyên khoa; 2) Chẩn đoán tại khoa cấp cứu các bệnh viện thường có nhiều bệnh có biểu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 hiện gần giống bệnh do SEB gây ra, nên chưa kết luận đúng bệnh; 3) Việc tiến hành các nghiên cứu phục vụ cho chẩn đoán nhanh ngộ độc thực phẩm do độc tố ruột SEB của tụ cầu vàng ở Việt Nam hiện nay còn khá mới mẻ, chủ yếu vẫn dựa vào các phương pháp truyền thống nên tốn nhiều công sức và thời gian kéo dài. Do đó, khi bệnh nhân nhiễm độc tụ cầu và các nội độc tố như SEB sẽ gặp nguy hiểm gấp bội vì SEB là một siêu kháng nguyên có độc tính mạnh, tác động nhanh , có thể dẫn tới tử vong ở người. Bảng 1.1. Sơ bộ tình hình nhiễm độc tụ cầu vàng trên toàn quốc từ 2007 – 2009. Dựa theo bảng 1.2 trên đây, chúng tôi nhận thấy tình trạng xuất hiện vi sinh vật S. aureus ở các loại thực phẩm diễn ra khá phổ biến trong cả nước. Vi khuẩn có thể gây ngộ độc cấp tính cho nhiều người trong cùng một thời điểm khi họ cùng tiêu STT Địa điểm Thời gian Số người mắc bệnh Đặc điểm bệnh nhân 1 Mầm non bán công Vĩnh Thọ - Phú Thọ 9/2007 100 Học sinh 2 Mầm non Vườn Hồng, P9 - Tân Bình; Tiểu học Âu Cơ, Q11 - TP HCM 12/ 2007 65 Trẻ em (từ 2-5 tuổi) 3 Minh Long - Quảng Ngãi 2/2008 53 Người dân 4 Hà Nội 5/2008 122 Khách dự đám cưới 5 Cty TNHH Alliace One, KCN Giao Long, Bến Tre 6/2008 100 Công nhân 6 Sơn La 9/2008 581 Người dân 7 Tiểu học Tam Bình, Q. Thủ Đức -TP HCM 11/ 2008 51 Học sinh và phụ huynh 8 Cty Phú Nguy