Luận văn Nghiên cứu thành phần hóa học có trong cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir, họ Thầu dầu, Euphorbiaceae)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ------------------------------ PHAN VĂN DÂN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÓ TRONG CÂY PHÈN ĐEN (PHYLLANTHUS RETICULATUS POIR EUPHORBIACEAE) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HOÁ HỌC THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM --------------------------------- PHAN VĂN DÂN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÓ TRONG CÂY PHÈN ĐEN (PHYLLANTHUS RETICULATUS POIR EUPHORBIACEAE) Chuyên ngành : Hoá hữu cơ Mã số : 60.44.27 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HOÁ HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS PHẠM VĂN THỈNH THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới PGS.TS.NGƯT Phạm Văn Thỉnh - người Thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Quyết Tiến, TS. Phạm Thị Hồng Minh, ThS. Vũ Anh Tuấn đã giúp đỡ tôi nhiều kiến thức bổ ích và những kinh nghiệm trong nghiên cứu khoa học. Nhân dịp này, tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo khoa Hóa, khoa Sau Đại học - Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên, phòng hoạt chất sinh học - Viện Hóa học, Hội đồng giáo dục trường THPT Bắc Đông Quan - Thái Bình, Bố - Mẹ tôi cùng những người thân trong gia đình, anh em bè bạn… đã hết lòng tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong thời gian học tập, nghiên cứu khoa học và hoàn thành luận văn này. Thái Nguyên, tháng 9 năm 2009 Tác giả Phan Văn Dân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả PHAN VĂN DÂN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN SKLM : Sắc kí lớp mỏng UV : Ultraviolet spectrocopy MS : Mass Spectroscopy EI-MS : Electron Impact Mass Spectroscopy LC-MS : Liqud chromatography - Mass Spectroscopy FT-IR : Fourier Transform Infrared Spectroscopy NMR : Nuclear Magnetic Resonance 1 H-NMR : 1 H-Nuclear Magnetic Resonance 13 C-NMR : 13 C- Nuclear Magnetic Resonance DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer COSY : Correlated Spectroscopy HSQC : Heteronuclear Spectroscopy- Quantum Coherence HMBC : Heteronuclear multiple - Bond Correlation HIV : Human Immunodeficiency Virus U : Unit Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Lời cam đoan Danh mục các chữ viết tắt dùng trong luận văn Danh mục các bảng, hình và sơ đồ Mục lục MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN .................................................................................... 3 1.1. Mô tả thực vật ............................................................................................... 3 1.2. Các hợp chất hoá học có hoạt tính sinh học trong chi Phyllanthus ................. 4 1.2.1 Một số đại diện của khung axit .................................................................... 4 1.2.2 Một số đại diện của nhóm tecpenoit ............................................................ 6 1.2.3 Một số đại diện của lignan ........................................................................... 9 1.2.4 Một số đại diện của khung flavonoit .......................................................... 12 1.2.5 Một số hợp chất phenolic khác .................................................................. 14 1.2.6 Một số hợp chất nhóm ankaloit .................................................................. 17 1.3. Tình hình nghiên cứu hóa học của loài Phyllanthus reticulatus Poir ............ 18 1.4 Tác dụng sinh học của chi Phyllanthus ......................................................... 19 1.4.1 Một số công dụng của chi Phyllanthus ...................................................... 19 1.4.2 Một số tác dụng dược lý của chi Phyllanthus............................................. 21 CHƯƠNG II. THỰC NGHIỆM ............................................................................. 22 2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu ........................................................ 22 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu .............. 22 2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết ............................... 22 2.1.3. Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất ............. 23 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu ..................................................... 23 2.2.1. Dụng cụ và hoá chất ................................................................................. 23 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu ................................................................................... 24 2.3. Các dịch chiết từ cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus P.) ........................ 25 2.3.1. Các dịch chiết ........................................................................................... 25 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết .............................................................. 26 2.4. Phân lập, tinh chế các chất từ cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus P.) ..... 29 2.4.1. Dịch chiết n-hexane (HP) ......................................................................... 29 2.4.1.1 Chất HP-2 ............................................................................................... 29 2.4.1.2 Chất HP-4 ............................................................................................... 30 2.4.1.3 Chất HP-5 ............................................................................................... 30 2.4.2. Dịch chiết ethylacetate (EP) ..................................................................... 31 CHƯƠNG III. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................... 32 3.1. Nguyên tắc chung ........................................................................................ 32 3.2. Phân lập và nhận dạng các hợp chất ............................................................ 32 3.2.1. Chất HP-2 ................................................................................................ 33 3.2.2. Chất HP-4 ................................................................................................. 34 3.2.3. Chất HP-5 ................................................................................................. 36 KẾT LUẬN .......................................................................................................... 43 KIẾN NGHỊ ......................................................................................................... 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 44 PHỤ LỤC ............................................................................................................ 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH & SƠ ĐỒ Trang Bảng 2.1: Khối lượng chất tổng số được chiết từng phân đoạn của cây Phèn đen Phyllanthus reticulatus P., Euphorbiaceae……………...…...……….26 Bảng 2.2: Kết quả định tính các nhóm chất trong cây Phèn đen Phyllanthus reticulatus Poir, Euphorbiaceae ……………………..………………28 Bảng 3.1: Độ chuyển dịch hóa học 13C-NMR của một số sterol trong loài Phyllanthus …………………………...………………………….…..35 Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR của HP-5………….................................................38 Bảng 3.3: Bảng so sánh số liệu phổ 1H và 13C-NMR (500MHz, CDCl3) của - acetylamino-phenylpropyl -benzoylamino-phenylpropinoate và chất thực nghiệm (HP-5) ......................................................................... 40 Hình 1.1: Cây Phèn đen Phyllanthus reticulatus P., Euphorbiaceae……............ 3 Sơ đồ 2.1: Quy trình ngâm chiết mẫu...................................................................25 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU Lãnh thổ Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới, gió mùa, độ cao không đều, diện tích vùng núi và vùng trung du chiếm đến 70% - với điều kiện môi trường tự nhiên thuận lợi tạo nên một hệ thực vật rất phong phú và đa dạng. Theo các số liệu thống kê mới nhất, thảm thực vật Việt Nam - nguồn tài nguyên sinh học quý giá - có trên 12000 loài, trong số đó có tới hơn 3200 loài được sử dụng làm thuốc hay thực phẩm chức năng trong Y học dân gian. Dân số Việt Nam gồm nhiều dân tộc anh em sinh sống, từ xa xưa đã có truyền thống chữa bệnh bằng cây cỏ mà Hải Thượng Lãn Ông gọi chung là Thảo dược. Từ nhiều thế hệ, người dân đã sử dụng tri thức bản địa để phòng và chữa bệnh cho bản thân và cộng đồng. Ngày nay, mặc dù công nghệ tổng hợp hoá dược đã phát triển mạnh mẽ nhờ những thành tựu mang tính đột phá và hiện đại của khoa học công nghệ nhằm giảm thiểu bệnh tật và làm tăng tuổi thọ của con người. Song nhu cầu sử dụng cây cỏ để làm thuốc vẫn ngày càng tăng lên, vì trong chúng có chứa những biệt dược rất khó tổng hợp, ngoài ra, việc dùng thuốc Nam hầu như không gây tác dụng phụ. Theo điều tra của Bộ Y tế, trong những năm gần đây, ở Việt Nam số người có mầm bệnh viêm gan chiếm tỷ lệ khá lớn, nó đã trở thành đề tài nghiên cứu cho nhiều ngành khoa học nhằm chăm lo tốt hơn đối với sức khỏe cộng đồng. Tham gia vào việc tìm thuốc từ nguồn thực vật, Y học dân gian đã phát hiện khoảng 20 loại cây cỏ có khả năng chữa trị viêm gan, trong đó đáng chú ý là các loài thuộc chi Phyllanthus (họ Thầu dầu, Euphorbiaceae) [2]. Cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir) là thực vật thuộc chi Phyllanthus được dùng trong Y học cổ truyền của Việt Nam và nhiều nước trên Thế giới. Các bộ phận của cây đều được sử dụng làm thuốc: rễ Phèn đen được dùng trị lỵ, viêm ruột, ruột kết hạch, viêm gan, viêm thận và trẻ em cam tích. Lá thường dùng chữa sốt, lỵ, ỉa chảy, phù thũng, ứ huyết do đòn ngã, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 huyết nhiệt sinh đinh nhọt, còn dùng chữa bị thuốc độc mặt xám da vàng và rắn cắn. Vỏ thân dùng chữa lên đậu có mủ và tiểu tiện khó khăn. Cho đến nay, ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào về thành phần hóa học của cây Phèn đen. Với mong muốn làm sáng tỏ kinh nghiệm sử dụng trong dân gian, nâng cao tính hiệu quả, an toàn của dược liệu, đưa dược liệu vào sử dụng một cách khoa học hơn và có thể đẩy mạnh khai thác sử dụng cây thuốc này vào việc phòng và chữa bệnh cho nhân dân trong cộng đồng các dân tộc Việt Nam. Chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu thành phần hóa học có trong cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir, họ Thầu dầu, Euphorbiaceae)” - đó chính là tên của đề tài cho công trình nghiên cứu này. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1- Mô tả thực vật Hình 1.1: Cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir, Euphorbiaceae). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 Cây Phèn đen còn được gọi là cây Nỗ hay Sáp tràng thảo, Tảo phàn diệp. Tên khoa học là: Phyllanthus reticulatus Poir, họ Thầu dầu, Euphorbiaceae. Phân bố địa lý: là loài cổ nhiệt đới, mọc hoang khắp nơi, ở bờ bụi ven đường, ven rừng có khi được trồng làm hàng rào phổ biến ở nước ta. Trên thế giới thấy nhiều ở vùng Đông Á, ở Nhật Bản cũng có mọc. Mô tả: cây bụi, cao 2 - 4m, cành gầy mảnh đen nhạt, đôi khi họp từng 2 đến 3 cành trên cùng một đốt dài 10 - 20cm. Lá có hình dạng thay đổi, hình trái xoan, hình bầu dục hay hình trứng ngược nhọn, hay tù ở hai đầu, phiến lá rất mỏng, dài 1,5 - 3cm, rộng 6 - 12mm, mặt trên màu sẫm hơn mặt dưới, lá kèm hình tam giác hẹp. Cụm hoa hình chùm mọc ở nách lá, riêng lẻ hay xếp 2 - 3 cái một. Quả hình cầu, khi chín màu đen dài 5 mm, rộng 3mm. Hạt hình 3 cạnh, màu nâu có những đốm rất nhỏ. Ra hoa kết quả tháng 8 - 10 [7]. 1.2- Các hợp chất hoá học có hoạt tính sinh học trong chi Phyllanthus Người ta đã phát hiện chi Phyllanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) có trên 700 loài gồm từ những cây thân thảo đến cây bụi hay cây gỗ nhỏ. Ở Việt Nam có 44 loài, các loài đáng được chú ý nhiều hơn cả là Phyllanthus urinaria L. (cây Chó đẻ răng cưa), Phyllanthus reticulatus Poir (cây Phèn đen) và Phyllanthus amarus Schum et Thonn (cây Diệp hạ châu đắng). Thành phần hoá học của chi này rất phong phú và đa dạng [20]. 1.2.1- Một số đại diện của khung axit Năm 1995, từ loài Phyllanthus amarus L. Yeap Foo [40] và Thales R. Cipriani, Caroline G. Mellinger - năm 2008 đã phân lập được axit amariinic, axit thiobarbituric và axit ascorbic [61]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 OH OH OHOH OHOH O O OH OH OH O O O O O OH OH OO OO OH OH O OH O O 1. Axit amariinic Ying-Jun Zhang đã tách được axit phyllaemblic [70], axit amlaic [62], axit ascorbic (vitamin C) là một enđiol-lacton [38], 2-O-(3,4,5-trihydroxy benzoyl) có tên khác là 2-O-galloylgalactaric acid hay 2-O-galloylmucic acid [10, 19, 92], O-(3,4,5-trihydroxybenzoyl) còn gọi là axit galloylmalic [43, 69] từ loài Phyllanthus emblica . O O OH OH H OH OH H O O OOH OH O OH OH OH 2. Axit ascorbic 3. Axit galloylmalic O O O OH OH OHOH O O OH OH OH OH OH O O O O O OH OH OH O OH OH OH OH OOH 4. Axit amlaic 5. Axit 2-O-galloylgalactaric Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 Từ loài Phyllanthus fraternus năm 1997, Rajasubramaniam cùng các cộng sự đã tách được axit indole-3-butyric, axit 1-naphthaleneacetic [52]. Còn Mericli và Wanxing Wei khi nghiên cứu độc lập từ loài Phyllanthus urinaria đã phân lập được axit pentahydroxybenzoic [46, 67]. O OH OH OHOH OH OH O OH 6. Axit 1-naphthaleneacetic 7. Axit pentahydroxybenzoic 1.2.2- Một số đại diện của nhóm tecpenoit Tanaka và các cộng sự từ loài Phyllanthus flexuosus đã phân lập được 5 tritecpen mới, cấu trúc được chỉ ra là: olean-12-en-3β,15α-diol; lup-20 (29)- en-3β,24-diol; olean-12-en-3β,24-diol; olean-11:13(18)-dien-3β,24-diol và olean-12-en-3β,15α,24-triol và hai chất đã biết là: tritecpendiolbetulin [64]; lup-20(29)-en-3β,15α-diol [60]. OH CH3CH3 CH3 OH CH3 CH3CH3 CH3CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 OH 8. Olean-12-en-3β,15α-diol 9. Olean-11:13(18)-dien-3β,24-diol Năm 1988, từ loài Phyllanthus fraternus - Shunyo Matsunaga và Reiko Tanaka công bố đã tách được axit trichadenic B có cấu trúc như axit 3β-hydro xy-D:A-friedooleanan-27-oic, được xác định dựa vào phương pháp phân tích X-ray [58]. Còn từ loài Phyllanthus engleri Hnatyszyn và Sengupta đã tách được phyllanthol có cấu trúc được chỉ ra là 13,27-cyclo-3-taraxastanol (hay 13,27-cyclo-3-ursanol) [31, 56]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 HO H HOOC OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 29 20 23 27 28 30 21 22 24 25 26 10. Axit trichadenic B 11. Phyllanthol Zhang L. Z. đã tách được một số triterpen như: lupeol acetat, β-amyrin, β-amyrylglucosid, lup-28 (29)-en-3 β-ol từ loài Phyllanthus urinaria L. [71]. Cấu trúc một số hợp chất tritecpen điển hình đã được xác định như sau: HO glucozo- O 12. β-Amyrin 13. β-Amyrylglucosid CH3 CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH2 14. Lupeol Theo Sutthivaiyakit và Nakorn N. từ loài Phyllanthus oxyphyllus tách được: 29-nor-3,4-seco-friedelan tritecpen (axit 29-nor-3,4-seco-friedelan- 4(23),20(30)-dien-3-oic) và một secquitecpen mới là guaiane secquitecpen (5- Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 hydroxy-6,9-epoxyguaiane). Những hợp chất này được đánh giá là có khả năng chống oxi hóa tốt ở nồng độ thử nghiệm IC50 = 0.017 ± 0.001 mM [59]. HOOC HO O 15. 29-nor-3,4-seco-friedelane tritecpen 16. Guaiane secquitecpen Tại Châu Phi từ loài Phyllanthus plyanthus, Vuyelwa J.N. và Neil R.C. đã tìm ra được một số tritecpenoit có công thức cấu trúc được xác lập là: (20S)-3β-acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol, δ-amyrin acetate, lupenone và (20S)-3α-acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol, họ đặt tên cho nó là phyllanthol và phyllanthone [65]. H HO CH3OCO H H H 17. (20S)-3β-Acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol Trên tạp chí “Phytochemistry” năm 1966 đăng tải, Sengupta và Mukhopadhyay đã tách được hai pentacyclic tritecpenoit, đó là: phyllanthol và olean-12-en-3β-ol (β-amyrin) từ loài Phyllanthus acidus [56]. Trước đó từ loài Phyllanthus niruri Bikram Singh đã tách được một acyclic tritecpen, cấu trúc của nó được dự đoán dựa trên các phương pháp phân tích phổ là: 3, 7,11,15,19,23-hexamethyl-2Z,6Z,10Z,14E,18E,22E-tetracoshexen-1-ol [17]. Còn từ loài Phyllanthus watsonii đã tách được hợp chất tritecpen mới: 26- Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 Nor-D:A-friedooleanane tritecpen cùng với lupenyl palmitate, friedelin, epifriedelanol, glochidone, glochidonol, lupeol, lup-20(2) [45]. 1.2.3- Một số đại diện của Lignan Năm 1998 - Chen và năm 2003 - Li thông báo từ loài Phyllanthus niruri đã tách được demethyleneniranthin C23H32O7 (cấu trúc của demethyl eneniranthin được chỉ ra là 4,5-dihydroxy-3,3',4',9,9'-pentamethoxylignan), linnanthin C25H36O7 hay 3-methoxyphyllanthin (cấu trúc của linnanthin là 3,3',4,4',5,9,9'-heptamethoxylignan) [22, 41]. Phyllanthin C24H34O6, hypo phyllanthin C24H30O7, niranthin C24H32O7 (cấu trúc của niranthin được chỉ ra là 3,4-methylene, 3',4',5,9,9'-penta-Me ether hay 3',4',5,9,9'-pentamethoxy- 3,4-methylenedioxylignan), nirtetralin C24H30O7 và phyllteralin C24H34O6 [11]. Dựa trên các dữ liệu phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ hạt nhân, cấu trúc của nirtetralin và phylltetralin được xác định là 1-phenyl tetralins. O O CH3 CH3 O CH3 O CH3 OH OH O CH3 18. Demethyleneniranthin O O CH3 CH3 O CH3 O CH3 O O O CH3 CH3 CH3 O O CH3 CH3 O CH3 O CH3 O O O CH3 19. Linnanthin 20. Niranthin Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 Trong loài Phyllanthus discoides người ta đã tách được phyllanthin C14H17O2N, phyllantin C13H15O3N [44] và phyllantidin C13H15O2N [33]. CH2OCH3 CH2OCH3 OCH3 OCH3 H H RO R1O R2 CH2OCH3 CH2OCH3 O OCH3 H H H3CO H3CO H O 21. Phyllanthin 22. Hypophyllantin O O O CH3 O CH3 O CH3 O CH3 O CH3 CH2OCH3 CH2OCH3 OCH3 H OCH3 OCH3 H H H3CO 23. Nirtetralin 24. Phyllteralin Ở Việt Nam năm 2003, các chất hypophyllanthin, phyllanthin cũng được phân lập trong cặn n-hexan bằng phương pháp sắc kí lỏng trung áp (MPLC) từ loài Phyllanthus niruri L ở vùng Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh [4], đây là hai lignan đã được chứng minh là có hoạt tính bảo vệ gan trên mô hình gây độc tế bào gan bằng CCl4 và D- GalN/ TNF- [3, 64]. Theo Satyanarayana và Venkateswarlu [54], từ loài Phyllanthus niruri đã tách được 4 diarylbutane lignan mới, chúng được coi là sản phẩm chuyển hóa thuộc hệ thống 5′-desmethoxy niranthin. Trong đó hai chất (25) và (26) là sản phẩm chuyển hóa từ axit veratrylidene piperonylidene succinic, (27) được chuyển hóa từ axit veratrylidene 3,4,5-trimethoxy benzylidene succinic và (28) được chuyển hoá từ (27). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 O O OMe OMe CH2OR CH2OR OMe OMe CH2OMe CH2OMe RO RO OMe 25. R = H 27. R = H 26. R = CH3 28. R = CH3 Đầu những năm 90 thế kỷ trước, các nhà khoa học do Pettit đứng đầu khi nghiên cứu về loài Phyllanthus acuminatus đã tách được phyllanthostatin 1 có công thức phân tử C40H52O17 công thức cấu tạo đã