Luận văn Nghiên cứu thu nhận enzym a – amylase từ trực khuẩn cỏ kho

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH ------------------------------------ NGUYỄN THỊ HOÀNG HẢI NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYM α – AMYLASE TỪ TRỰC KHUẨN CỎ KHÔ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH ------------------------------------ NGUYỄN THỊ HOÀNG HẢI NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYM α – AMYLASE TỪ TRỰC KHUẨN CỎ KHÔ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. LƯƠNG ĐỨC PHẨM Thành phố Hồ Chí Minh – 2009 MỞ ĐẦU Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng và phong phú. Chúng có mặt khắp nơi: trong đất, trong nước, trong không khí,… kể cả trong cơ thể con người. Ngoài tác hại do vi sinh vật gây ra như: gây bệnh cho thực vật, động vật và con người; thì nguồn lợi mà chúng mang lại cho chúng ta vô cùng to lớn nếu ta hiểu, biết và sử dụng chúng hợp lý. Các chủng vi sinh vật nói chung và vi khuẩn Bacillus nói riêng đã và đang được sử dụng rất phổ biến trong các chế phẩm sinh học để phục vụ cho các ngành sản xuất như: rượu, bia, công nghiệp dệt, thuộc da, bổ sung vào thức ăn cho gia súc để dễ tiêu hoá, thức ăn trong nuôi trồng thuỷ sản, trong y học và nghiên cứu,… là nhờ khả năng sinh các loại enzym thuỷ phân của các chủng vi sinh vật này. Enzym là những chất xúc tác sinh học, ngoài những tính chất của một chất xúc tác nó còn có những tính chất ưu việt hơn như: có hiệu suất xúc tác rất cao ở điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường, có tính đặc hiệu cao. Các tính chất này vẫn được bảo tồn khi tách enzym ra khỏi hệ thống sống, hoạt động trong điều kiện invitro. Vì vậy, enzym ngày càng được sử dụng rộng rãi trong thực tế, với quy mô ngày càng lớn, dẫn đến việc hình thành và phát triển ngành công nghệ sản xuất enzym. Việc sử dụng enzym trong thực tế không chỉ có ý nghĩa về kinh tế mà còn giải quyết nhiều vấn đề xã hội, các vấn đề bức xúc về môi trường. Trước kia, enzym thường được thu nhận từ tế bào thực vật hoặc động vật (chẳng hạn amylase được lấy từ hạt nảy mầm, protease từ nhựa đu đủ, dạ dày,…). Tuy nhiên quá trình sinh tổng hợp enzym ở động vật và thực vật gắn liền với sự trao đổi chất và nhu cầu của tế bào. Ngoài ra, người ta còn phải phá bỏ các tổ chức tế bào để tách chiết và thu nhận enzym. Như vậy, việc dùng tế bào động vật, thực vật làm nguồn nguyên liệu để thu nhận enzym là khá hạn chế, thiếu tính kinh tế và không đáp ứng được nhu cầu về số lượng enzym cần thiết cho sản xuất. Trong khi đó, ở vi sinh vật hầu như chứa đầy đủ các loại enzym và việc sử dụng nguồn enzym từ vi sinh vật mang lại lợi ích lớn hơn, cụ thể như nguồn nguyên liệu dùng để nuôi cấy vi sinh vật thường rẻ tiền hơn vì chúng thường là phế phụ phẩm công nông nghiệp (như cám, trấu, bã mía, bã khoai mỳ,…) hoặc nguồn nguyên liệu tự nhiên như dầu mỏ, khí đốt,… Mặt khác, điều kiện nuôi cấy dễ dàng, và enzym có hoạt tính cao hơn. Vì thế, khoảng 50 năm gần đây các chế phẩm enzym từ vi sinh vật đã dần thay thế các enzym có nguồn gốc thực vật, động vật. Trong hàng loạt các loại enzym khác nhau thì amylase là enzym phân giải tinh bột tạo đường cho các sinh vật. Từ những năm đầu thế kỷ 18 các nhà khoa học đã bắt đầu nghiên cứu về amylase và đến nay đã biết khá rõ về loại enzym này. Amylase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực sản xuất như công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt,…Sản xuất amylase công nghiệp đã được chú ý từ rất lâu và ngày càng phát triển ở nhiều nước trên thế giới. Việt Nam chúng ta là một trong nhiều nước đã và đang có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụng enzym amylase, nhưng nền công nghiệp sản xuất enzym ở nước ta chưa thật sự phát triển. Xuất phát từ cơ sở trên chúng tôi chọn đề tài cho luận văn: “Nghiên cứu thu nhận enzym α-amylase từ trực khuẩn cỏ khô”. Nội dung của đề tài gồm một số vấn đề sau: 1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh trưởng và sinh enzim amylase có hoạt tính mạnh từ đất vườn qua trung gian cỏ khô. 2. Nghiên cứu hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc, và các đặc điểm sinh học của chủng tuyển chọn. 3. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu được dịch enzym amylase có hoạt độ cao. 4. Định danh chủng được tuyển chọn bằng kỹ thuật di truyền phân tử. 5. Nuôi cấy chủng đã tuyển chọn trong thiết bị bình lên men tam giác 1 lít với các điều kiện nuôi cấy tối ưu. Nghiên cứu động học quá trình sinh tổng hợp amylase với 3 thông số là pH, sinh trưởng và hoạt độ enzym. 6. Tách chiết enzym amylase từ dịch lên men nhờ các tác nhân tủa. 7. So sánh hiệu suất thu nhận và hoạt độ chế phẩm enzym (CPE) amylase thu được từ các tác nhân tủa khác nhau. 8. Nghiên cứu độ bền nhiệt và độ bền pH của CPE amylase. Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giống vi khuẩn Bacillus [5], [16], [38], [39] Bacillus là vi khuẩn Gram dương, hình que có kích thước khác nhau (0,5 – 2,5) ×(1,2 - 10) μm. Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, nước, không khí. Là vi khuẩn dị dưỡng hoá năng, thu năng lượng nhờ sự oxi hoá các hợp chất hữu cơ, có chùm tiên mao giúp chúng có khả năng di động, sống hiếu khí hoặc hiếu khí tuỳ tiện. Bacillus có khả năng sinh bào tử, bào tử được hình thành khi tế bào đã trải qua giai đoạn phát triển mạnh nhất, hoặc khi thiếu chất dinh dưỡng. Mỗi tế bào sinh dưỡng sinh ra một bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào sinh dưỡng tự phân giải giải phóng bào tử. Các tế bào Bacillus đặc trưng là sinh bào tử màø vẫn giữ hình dáng trực khuẩn khi mang bào tử, trong một số trường hợp tế bào vi khuẩn chỉ phình to một ít khi chứa bào tử. Tuỳ loài mà bào tử có thể nằm chính tâm, lệch tâm hay gần đầu tế bào. Bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia tử ngoại, phóng xạ và nhiều độc tố, vì vậy chúng có khả năng giữ ở trạng thái bào tử nhiều năm. Bào tử không phải cơ quan sinh sản mà là một trạng thái bảo vệ nòi giống, nó được tạo ra để giúp tế bào chịu được các điều kiện bất lợi của môi trường. Đó là dạng nghỉ của tế bào. Bào tử ở dạng tự do không có quá trình trao đổi chất, khi gặp điều kiện thuận lợi mỗi bào tử cho ra một tế bào sinh dưỡng. Đa số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 – 10 như Bacillus alcalophillus, hoặc với pH = 2 – 6 như Bacillus- acidocaldrius. Về nhiệt độ, có nhiều chủng ưa nhiệt độ cao (450C – 750C), hoặc ưa lạnh (50C –250C), nhưng thường gặp Bacillus sống ở nhiệt độ tối ưu là 340C – 370C. Hầu hết Bacillus không gây bệnh cho người và động vật. Một số loại gây bệnh cho côn trùng như Bacillus thuringiensis, B. poplliae, B. lentimorbus, B. cereus, B. anthracis (trong đó B. cereus và B. anthracis có thể gây bệnh cho người)…đa số còn lại trong tự nhiên là có ích. Bacillus có khả năng sinh enzym ngoại bào: α-amylase, protease kiềm, cellulase… và các enzym này được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, bảo vệ môi trường, nông nghiệp… Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên 1.1.1 Bacillus subtilis Bacillus subtilis được phát hiện và đặt tên vào năm 1872, nó phân bố phổ biến trong đất và đặc biệt là ở cỏ khô nên Bacillus subtilis được gọi là trực khuẩn cỏ khô. Là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước (3 -5) × 0,6 μm, nhiều khi tế bào nối lại với nhau thành chuỗi dài ngắn khác nhau hoặc tế bào đứng riêng rẽ. Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch. Nhiệt độ thích hợp cho Bacillus subtilis sinh trưởng là 300C – 500C, thường nuôi cấy ở 370C. Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6 – 0,9 μm, phân bố lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm. Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống bào tử B. subtilis trong 200-300 năm. Vi khuẩn B. subtilis có màng nhày (giác mạc) giúp vi khuẩn có khả năng chịu được điều kiện khắc nghiệt vì màng nhày có thể dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh tổn thương khi khô hạn. Màng nhày có thể quan sát được khi nhuộm tiêu bản, qua kính hiển vi chúng ta có thể nhìn thấy màng nhày của B. subtilis là không màu, trong suốt, còn tế bào vi khuẩn bắt màu nâu đỏ trên nền tiêu bản xanh hoặc đen. B. subtilis có khả năng sinh ra một số enzym như: α-amylase, protease kiềm có giá trị cao, đặc biệt có khả năng tổng hợp riboflavin (tiền vitamin B2). Vì vậy, B. subtilis được ứng dụng khá nhiều trong các ngành công nghiệp. 1.1.2. Bacillus mesentericus Bacillus mesentericus còn được gọi là trực khuẩn khoai tây do chúng có mặt chủ yếu trên khoai tây. Chúng gần giống Bacillus subtilis khuẩn lạc ăn sâu và bám chặt vào môi trường thạch, bề mặt nhăn nhúm, khô, không mọc lan ra môi trường, màu xám nhạt-trắng, hoặc hơi vàng nâu, hoặc hồng như Bacillus mensentericus ruber hoặc đen như Bacillus mensentericus niger . Bacillus mensentericus sinh trưởng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 36 – 450C, tối đa 50 – 550C, pH = 4,5 – 5 thì ngừng phát triển. Bacillus mensentericus có hoạt tính amylase và protease lớn hơn hẳn Bacillus subtilis, nhưng lên men đường lại kém hơn. Bacillus mensentericus và Bacillus subtilis rất phổ biến trong tự nhiên, chúng lây nhiễm làm hư hỏng thực phẩm, nhất là các loại thực phẩm có chứa nitơ và các sản phẩm giàu đường (bánh kẹo, hoa quả). Ngoài ra, chúng còn sinh ra một loại hợp chất có hoạt tính kháng một số vi khuẩn khác gọi là bacterioxin, ở Bacillus subtilis gọi là subtilin. 1.1.3. Bacillus cereus Vi khuẩn này có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, B. mycoides, B. thuringiensis. Bào tử của chúng hình bầu dục, kích thước 0,9 × (1,2 – 1,5) μm, nằm lệch tâm, phát tán khắp nơi, trong đất, trong không khí…Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ra độc tố làm cho thực phẩm hư hỏng và gây ngộ độc thực phẩm. Tế bào của B. cereus dày, kích thước (1 -1,5) × (3 – 5) μm có khi dài hơn, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi. Khuẩn lạc của B. cereus phẳng, hơi lõm, bề mặt hơi xù xì (dạng bột, hoặc dạng hạt nhỏ) trắng đục, mép lồi lõm. 1.1.4. Bacillus megaterium Megaterium có nghĩa là “con thú lớn”, tế bào của nó khá lớn khoảng gấp hơn 2 lần tế bào của Bacillus subtilis, kích thước (1,2 – 1,5) × (3 – 12) μm. Ở các ống nuôi già thì tế bào ngắn hơn, tròn hơn, đôi khi hình thoi với đầu hẹp lại. Tế bào chứa nhiều hạt nhỏ và chất dự trữ (hạt mỡ, glycogen). Bào tử lớn, hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 × (0,7 – 1) μm, chúng nằm lệch tâm thường theo chiều ngang hoặc chiều xiên của tế bào. Khuẩn lạc tròn đều, lồi nhẵn nhưng thường có vòng viền quanh khuẩn lạc hoặc các vòng đồng tâm trên bề mặt, không thuỳ, không nếp, mép tròn đều hay lượn sóng, màu trắng sữa hay đục, có khi có màu nâu nhạt. Sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng đơn giản không cần thêm bất kỳ yếu tố dinh dưỡng nào khác. 1.1.5. Bacillus pumilus Bào tử phát tán rộng, có mặt trong đất nhiều hơn Bacillus subtilis. Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ lan không ranh giới. Tế bào của nó gần giống tế bào B. subtilis. 1.1.6. Bacillus polymyxa Kích thước tế bào là (0,6 – 1) × (2 – 7) μm, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đôi, chuỗi ngắn. Khi hình thành bào tử tế bào sẽ phồng lên hình quả chanh. Bào tử hình bầu dục kéo dài khoảng (1,7 – 2,6 μm), trên bề mặt cắt ngang như hình sao, nằm giữa tế bào, chúng phát tán rộng. Khuẩn lạc của B. polymyxa vô màu, phẳng hoặc lồi, trơn, lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thuỳ. Chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực vật đang bị hỏng. Vì vậy, người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. Chúng là nguồn để sản xuất kháng sinh polymyxin. 1.1.7. Bacillus simplex Tế bào B. simplex nhỏ bé, có kích thước (2 – 5) × 0,6 μm, thường đứng riêng rẽ không gắn thành chuỗi. Bào tử hình bầu dục có kích thước 0,6 × 0,9 μm, nằm lệch tâm. Khuẩn lạc của B. simplex giống khuẩn lạc B. cereus, chỉ khác là khuẩn lạc của B. simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết vào môi trường. 1.1.8. Bacillus brevis B. brevis là trực khuẩn có kích thước (0,7 – 1,0) × (3 – 5) μm, đứng riêng rẽ, đôi khi xếp thành chuỗi. Bào tử có hình bầu dục nằm cuối tế bào làm cho tế bào có một đầu hơi phồng to. Khuẩn lạc của B. brevis màu trắng, đôi khi có màu vàng, lồi hoặc phẳng, lấp lánh, mép răng cưa giống như dạng mỡ đặc. 1.1.9. Bacillus aslersporus Tế bào dày (1,0–1,2) × (3 –7) μm, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đôi. Bào tử hình trụ hay hình kéo dài, kích thước 1,0 × (1,5–2) μm, nằm giữa tế bào. Khi hình thành bào tử tế bào phồng lên một chút trông giống như dạng Clostridium. Khuẩn lạc của B. aslersporus nhỏ, màu trắng hay màu lục nhạt, phẳng, mềm, nhày, đồng chất. 1.2. Khái quát chung về enzym [1], [4], [15], [23], [49]. Sinh vật được xem như là một hệ thống mở có liên quan chặt chẽ đến quá trình trao đổi chất trong tế bào của cơ thể, và giữa cơ thể với môi trường ngoài. Quá trình trao đổi chất của sinh vật là biểu hiện sinh động nhất của sự sống. Khi cơ thể không còn khả năng trao đổi chất thì cơ thể sẽ chết. Quá trình trao đổi chất liên tục được xảy ra giữa trong và ngoài tế bào, tạo nên sự biến đổi liên tục của vật chất trong thiên nhiên. Các phản ứng sinh học xảy ra thường xuyên không chỉ ở trong tế bào sinh vật mà ở cả ngoài môi trường bao quanh tế bào. Các phản ứng sinh học này được xúc tác bởi một loại protein đặc biệt được gọi là enzym. Các enzym tham gia phản ứng trong tế bào gọi là enzym nội bào, còn các enzym thuỷ phân có chức năng phân huỷ chất hữu cơ ngoài tế bào thành chất dinh dưỡng có thể hấp thụ vào tế bào gọi là enzym ngoại bào. Cả hai loại enzym này đều được tổng hợp trong tế bào. 1.2.1. Enzym cảm ứng. Những enzym được tạo thành từ VSV không phải chỉ phụ thuộc vào loại VSV mà còn phụ thuộc thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy. Hiện tượng trên là do trong môi trường có chất khó đồng hoá, VSV tiết vào môi trường một hoặc các enzym tương ứng để tạo thành chất có thể đồng hoá được. Các enzym được tiết ra như thế được gọi là enzym cảm ứng và các cơ chất kích thích quá trình tổng hợp enzym cảm ứng gọi là chất cảm ứng. 1.2.2. Bản chất sinh học của enzym. Các loại enzym đều có các đặc tính sinh học chung như sau: + Enzym được tạo ra trong tế bào sinh vật. + Enzym tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và cả khi enzym được tách khỏi tế bào sống. + Enzym tham gia phản ứng trong điều kiện nhiệt độ ôn hoà, vì enzym được tổng hợp và hoạt động trong điều kiện nhiệt độ của tế bào và nhiệt độ của cơ thể. Phần lớn nhiệt độ của cơ thể sinh vật dao động trong khoảng 30-40oC. + Enzym có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể. + Phản ứng enzym là những phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít. Trong khi đó, các phản ứng hoá học được xúc tác bởi các chất xúc tác hoá học đòi hỏi năng lượng rất lớn. + Enzym chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng. Điều này có ý nghĩa rất lớn trong việc điều khiển sự tổng hợp enzym trong tế bào sinh vật. 1.2.3. Bản chất hoá học của enzym. Phân tích thành phần hoá học của enzym người ta chia thành hai nhóm: + Nhóm enzym đơn cấu tử: là các enzym được cấu tạo chỉ có protein. Các hydrolase thuộc loại này. + Nhóm enzym đa cấu tử: bao gồm những enzym có hai thành phần: • Phần protein thuần được gọi là apoprotein hay apoenzym. Ngày nay mới tìm thấy một số ARN có hoạt tính enzym chuyển hoá tiền chất thành các ARN. Các enzym ARN được gọi là Ribozim. Hiện nay đã biết có 3500 enzym có bản chất protein và 100 ribozim. • Phần thứ hai là thành phần không phải protein mà là những chất hữu cơ đặc hiệu có vai trò thúc đẩy quá trình xúc tác. Thiếu thành phần thứ hai này thì các enzym không hoạt động, nên gọi chúng là chất cộng tác (cofactor). Các chất hữu cơ đặc hiệu này có thể gắn rất chặt với phần protein bằng liên kết đồng hoá trị được gọi là nhóm phụ (prosthetic), hoặc cũng có thể gắn lỏng lẻo và dễ dàng tách chúng khỏi protein được gọi là coenzym. Apoenzym quyết định tính đặc hiệu cao và làm tăng hoạt độ xúc tác của enzym. Còn những chất hữu cơ đặc hiệu quyết định kiểu phản ứng, trực tiếp tham gia phản ứng và làm tăng độ bền của apoenzym đối với các yếu tố gây biến tính. Ngoài ra, trong thành phần của enzym còn có sự hiện diện một số kim loại, các kim loại này thường rất dễ tách ra khỏi enzym. Trong trường hợp enzym mất kim loại chúng sẽ mất hoạt tính. Khi đưa trở lại các kim loại tương ứng vào enzym thì hoạt tính của enzym lại được khôi phục, tính chất này mang tính thuận nghịch. Vai trò của kim loại trong hoạt động của enzym vẫn chưa thực sự làm sáng tỏ. Tuy nhiên các nhà khoa học cho rằng có thể kim loại đóng vai trò liên kết giữa enzym và cơ chất, giữa apoenzym và coenzym, tham gia trực tiếp vào quá trình vận chuyển điện tử như vai trò của sắt trong cytochrome và peroxydase. 1.2.4. Tính chất hoá học của enzym. Enzym có thể hoà tan trong nước, trong dung dịch muối loãng tạo thành các dung dịch keo ưa nước, nhưng enzym không tan trong dung môi không phân cực. Khi enzym được hoà tan vào nước, các phân tử nước lưỡng cực sẽ kết hợp với các ion, các nhóm ion hoặc các nhóm phân cực trong phân tử enzym tạo thành lớp vỏ hydrat. Lượng nước hydrat này khá lớn và có vai trò quan trọng làm môi trường cho các phản ứng sinh hoá. Enzym bị kết tủa bởi các tác nhân gây tủa protein như muối trung tính bão h