Luận văn Nghiên cứu tính đa dạng của virus y trên khoai tây trồng tại Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ------------------------------ VŨ THỊ BƯỞI NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG CỦA VIRUS Y TRÊN KHOAI TÂY TRỒNG TẠI THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên-2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Công trình được hoàn thành tại: Khoa Sinh -Trường Đại học Sư phạm-Đại học Thái Nguyên Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Chu Hoàng Mậu Phản biện 1:…………………………………… Phản biện 2:……………………………………. Luận văn sẽ được bảo vệ trước hội đồng chấm luận văn họp tại: Trường Đại học Sư phạm-Đại học Thái Nguyên Ngày…….tháng………năm 2009 Có thể tìm hiểu luận văn tại thư viện Đại học Thái Nguyên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------------------------------ VŨ THỊ BƢỞI NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG CỦA VIRUS Y TRÊN KHOAI TÂY TRỒNG TẠI THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên-2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS. Chu Hoàng Mậu, Phó Giám đốc Đại học Thái Nguyên, đã rất tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn của mình. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (trƣờng Đại học Khoa học), các thầy cô giáo, cán bộ khoa sau đại học và khoa Sinh (trƣờng Đại học Sƣ phạm-Đại học Thái Nguyên) đã hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS. Chu Hoàng Hà, chị Phạm Thị Vân, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật-Viện Công nghệ Sinh học và các cán bộ phòng thí nghiệm Di truyền học, khoa Sinh-Trƣờng Đại học Sƣ phạm; phòng thí nghiệm thuộc khoa Sinh-Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình hƣớng dẫn, giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, tôi xin dành cho những ngƣời thân yêu trong gia đình và bạn bè những lời biết ơn sâu sắc. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa có ai công bố trong một công trình nào khác. Thái Nguyên, tháng 9, năm 2009 Tác giả Vũ Thị Bƣởi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên iv NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT aa Acid amine DNA DeoxyribonucleicvAcid RNA Ribonuleic Acid bp Basepair cDNA Complementary DNA CP Coat protein cs Cộng sự DEPC Diethyl pyrocarbonate NXB Nhà xuất bản IPTG Isopropylthio-β-D-galactosidase Kb Kilobase LB Luria and Bertani RT-PCR Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction PVY Potato virus Y PVY N Potato virus Y strain N PVY C Potato virus Y strain C PVY O Potato virus Y strain O PVY NTN Potato virus Y strain (variant) NTN RNase Ribonuclease X-gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên v DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1. Các gen kháng (màu xanh) với 4 virus chủ yếu (PVY, PLRV, PVX, PVA) .............................................................................. Hình 1.2. Những đốm (mottle) điển hình trên cây thuốc lá N. tabacum cv Xanthi gây ra bởi PVY khoai tây sau 15 ngày tiêm ......................... Hình 1.3. Hình dạng của PVY ............................................................. Hình 1.4. Sơ đồ mô tả hệ gen của các chủng PVYO, PVYN và các biến thể PVYNTN, PVYNW ........................................................................... Hình 1.5. Loài rệp có cánh truyền PVY (Aphis nasturtii) ..................... Hình 1.6. Dấu hiệu so sánh PVY trên Nicotiana tabacum cv Xanthi (sau 15 ngày tiêm) ............................................................................... Hình 1.7. Triệu chứng nhiễm lần 2 với PVY trên cánh đồng khoai tây .... Hình 1.8. Triệu chứng của bệnh đốm chết hoại củ khoai tây (PTNRD) .... Hình 1.9. Vị trí các gen kháng PVY trên genome khoai tây ................. Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát ................................................... Hình 3.1. Một số hình ảnh về khoai tây ở các vùng nghiên cứu ........... Hình 3.2. Kết quả RT-PCR từ RNA của các mẫu lá khoai tây nghi nhiễm bệnh .......................................................................................... Hình 3.3. Kết quả điện di DNA thu đƣợc từ kỹ thuật thôi gel trên agarose 1% ....... Hình 3.4. Kết quả colony-PCR một số dòng khuẩn lạc với mẫu Phổ Yên ...... Hình 3.5. Kết quả colony-PCR một số dòng khuẩn lạc với mẫu Phú Bình ........ Hình 3.6. Kết quả điện di tách plasmid mang gen CP .......................... Hình 3.7. So sánh trình tự nucleotide của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu ........................................................................................... Hình 3.8. So sánh trình tự acid amine của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu ........................................................................................... Hình 3.9. Biểu đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền của CP- PVY phân lập đƣợc từ Phổ Yên và Phú Bình với 19 trình tự trong ngân hàng gen ...................................................................................... 13 16 16 17 19 21 22 23 24 29 39 41 43 45 46 46 49 50 52 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên vi DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1. Một số virus khoai tây thuộc nhóm 1 ............................... Bảng 1.2. Một số virus khoai tây thuộc nhóm 2 ............................... Bảng 1.3. Một số virus khoai tây thuộc nhóm 3 ............................... Bảng 1.4. Ảnh hƣởng của bệnh virus đến củ khoai tây ..................... Bảng 2.1. Danh sách các mẫu thu tại các điểm nghiên cứu .............. Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR .............................................. Bảng 2.3. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR ....................................... Bảng 2.4. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng ........ Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự ........................... Bảng 2.6. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự .................... Bảng 3.1. Tỉ lệ có triệu chứng bị bệnh ở các cánh đồng khoai tây nghiên cứu ....................................................................................... Bảng 3.2. Trình tự mồi đặc hiệu nhân gen CP .................................. Bảng 3.3. Trình tự mồi để thực hiện colony-PCR ............................ Bảng 3.4. 19 trình tự trong ngân hàng gen đƣợc sử dụng để đƣa ra so sánh ............................................................................................. Bảng 3.5. Hệ số giống nhau và khác nhau về trình tự nucleotide vùng mã hoá của gen CP ở mẫu nghiên cứu với các mẫu trên ngân hàng gen NCBI ................................................................................ 8 8 9 10 28 32 32 33 35 36 39 40 45 51 54 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên vii MỤC LỤC MỞ ĐẦU ............................................................................................... Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................... 1.1. Cây khoai tây .................................................................................. 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và giá trị của khoai tây ............................... 1.1.2. Một số đặc điểm sinh học của cây khoai tây ................................. 1.1.3. Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và ở Việt Nam ............. 1.2. Virus gây bệnh trên khoai tây.......................................................... 1.2.1. Các loại virus khoai tây ................................................................ 1.2.2. Đặc điểm chính của bệnh virus trên khoai tây .............................. 1.3. Virus Y ở khoai tây ......................................................................... 1.3.1. Phân loại ...................................................................................... 1.3.2. Cây chủ ........................................................................................ 1.3.3. Hình dạng và cấu trúc phân tử ...................................................... 1.3.4. Quan hệ họ hàng với các potyvirus khác ...................................... 1.3.5. Lan truyền của PVY ..................................................................... 1.3.6. Một số đặc điểm của PVY trên khoai tây ..................................... 1.4. Tình hình nghiên cứu PVY trên thế giới và ở Việt Nam .................. 1.4.1. Tình hình nghiên cứu PVY trên thế giới ....................................... 1.4.2. Tình hình nghiên cứu PVY ở Việt Nam ....................................... 1 3 3 3 5 5 6 7 9 14 14 14 16 17 18 20 24 24 27 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 2.1. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................... 2.2. Hóa chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu ........................................... 2.2.1. Hóa chất ....................................................................................... 2.2.2. Thiết bị......................................................................................... 2.2.3. Địa điểm nghiên cứu .................................................................... 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................. 2.3.1. Phƣơng pháp thống kê .................................................................. 2.3.2. Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số ........................................... 28 28 28 28 28 29 29 29 30 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên viii 2.3.3. Phƣơng pháp RT-PCR ................................................................. 31 2.3.4. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR ......................................... 2.3.5. Phƣơng pháp gắn gen vào vector tách dòng ................................. 2.3.6. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α ........ 2.3.7. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) ............... 2.3.8. Tách chiết plasmid ....................................................................... 2.3.9. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide .................................... 2.3.10. Phƣơng pháp xử lí trình tự gen thu đƣợc .................................... Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................. 3.1. Kết quả khảo sát tỉ lệ nhiễm PVY ................................................... 3.2. Kết quả nhân gen, tách dòng cDNA ................................................ 3.2.1. Kết quả nhân gen bằng kỹ thuật RT-PCR ..................................... 3.2.2. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR.................................................. 3.2.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. ...... 3.2.4. Kết quả chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng colony-PCR................. 3.2.5. Kết quả tách plasmid từ các khuẩn lạc của 2 mẫu nghiên cứu ...... 3.3. Kết quả so sánh trình tự gen CP-PVY phân lập từ 2 mẫu nghiên cứu với một số trình tự trong ngân hàng gen .......................................... 3.3.1. So sánh trình tự nucleotide và acid amine của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu ..................................................................................... 3.3.2. So sánh trình tự nucleotide gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu với các trình tự gen CP-PVY trên khoai tây đã đƣợc công bố trong ngân hàng gen ................................................................................................ KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ............................................................... TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................... 33 33 34 34 34 35 36 38 38 40 40 42 43 44 46 47 47 50 55 56 57 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một cây lƣơng thực chủ lực đứng đầu trong các loại cây lấy củ trên thế giới và đứng thứ 5 trong số các cây lƣơng thực nói chung (chỉ sau lúa mì, gạo, ngô, đậu tƣơng). Củ khoai tây có giá trị dinh dƣỡng cao, đƣợc chế biến thành hàng trăm món ăn đặc sắc, ngon miệng và có lợi cho sức khoẻ con ngƣời. Củ khoai tây còn là nguyên liệu quan trọng trong ngành công nghiệp, chế biến thức ăn cho gia súc. Ngoài ra, khoai tây còn là một dƣợc phẩm dùng để chữa trị nhiều bệnh nhƣ khó tiêu, đau bụng, viêm loét dạ dày, say nắng…Với những lợi ích to lớn đó, khoai tây đã đƣợc trồng ở hơn 130 quốc gia và là một nguồn thu lớn cho hàng triệu nông dân [5]. Ở khoai tây, bệnh virus đã trở thành một hiểm họa. Ngƣời ta thấy có ít nhất 38 loại virus trên khoai tây đã đƣợc phát hiện và mô tả, phổ biến là: PVY (potato virus Y), PLRV (potato leafroll virus), PVX (potato virus X), PVA (potato virus A), PVS (potato virus S)…Trong đó, PVY gần đây đƣợc xem là virus gây bệnh nghiêm trọng nhất (Kerlan, 2008) [40]. Chúng làm giảm kích thƣớc, số lƣợng cũng nhƣ chất lƣợng củ khoai tây, gây thiệt hại kinh tế tới 80% thậm chí còn hơn (Kerlan và cs, 2008) [41]. Mặc dù vậy, nhận thức của nông dân cũng nhƣ những nghiên cứu về bệnh virus trên khoai tây ở nƣớc ta còn rất hạn chế so với các nƣớc Bắc Mĩ và Châu Âu. Do đó, việc chẩn đoán nhanh, chính xác nhằm đƣa ra những biện pháp phòng trừ bệnh thích hợp để hạn chế tối đa những thiệt hại do bệnh virus gây ra là hết sức cần thiết. Hơn nữa, những biện pháp truyền thống sử dụng để ngăn cản sự lan truyền của PVY chỉ mang tính chất phòng trừ chứ không thể chống lại đƣợc bệnh này, lại tốn nhiều thời gian và công sức. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 Gần đây, với việc áp dụng những kĩ thuật tiên tiến của sinh học phân tử vào nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng, đặc biệt là sử dụng các vật liệu di truyền từ các virus gây bệnh để tạo cây trồng chuyển gen kháng virus đã thu đƣợc kết quả đáng khích lệ nhƣ cây khoai tây chuyển gen Nib kháng PVY. Tạo cây khoai tây chuyển gen kháng virus đƣợc coi là một biện pháp hữu hiệu để ngăn chặn và hạn chế tác hại do virus gây ra. Nhƣng vấn đề đặt ra là phổ kháng bệnh của những cây chuyển gen này phụ thuộc vào độ tƣơng đồng về mặt di truyền của chủng virus có gen đƣợc sử dụng để tạo cây chuyển gen và các dòng virus gây bệnh trong tự nhiên. Vì vậy khảo sát tính đa dạng di truyền của gen mã hoá cho protein vỏ virus (coat protein- CP) có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus. Xuất phát từ những lí do trên, tôi lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sĩ là: “Nghiên cứu tính đa dạng của virus Y trên khoai tây trồng tại Thái Nguyên”. 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Xác định sự đa dạng trong cấu trúc gen mã hoá protein vỏ (CP- coat protein) của PVY phân lập từ các mẫu lá khoai tây thu tại một số địa phƣơng thuộc tỉnh Thái Nguyên. 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.1. Khảo sát, thống kê và xác định tỉ lệ nhiễm PVY trên khoai tây ở Thái Bình, Thái Nguyên, Hƣng Yên, Bắc Giang làm cơ sở cho việc thu mẫu và xác định sự có mặt của virus PVY. 3.2. Tách chiết RNA của virus từ các mẫu khoai tây thu thập đƣợc. 3.3. Nhân gen CP, tách dòng và đọc trình tự gen CP của PVY trong các mẫu khoai tây. 3.4. So sánh trình gen CP của PVY phân lập đƣợc với một số trình tự đã công bố trong ngân hàng gen NCBI. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CÂY KHOAI TÂY 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và giá trị của khoai tây Cây khoai tây có tên khoa học là Solanum tuberosum L., thuộc họ cà (Solanaceae). Khoai tây có nguồn gốc từ vùng núi Andes của Bolivia và Peru. Vào thế kỉ XVI, ngƣời Tây Ban Nha xâm chiếm Peru và họ đã đem cây khoai tây về nƣớc trồng. Đến cuối thế kỉ XVI, khoai tây đã đƣợc trồng rộng rãi ở nhiều nƣớc Châu Âu (Vũ Hƣớng Văn, 2007) [12], (Macdec, 1963) [45]. Khoai tây đƣợc du nhập vào nƣớc ta là do một ngƣời Pháp là giám đốc vƣờn bách thảo Hà Nội đem vào trồng thử, và nó nhanh chóng đƣợc trồng ở nhiều địa phƣơng. Do ngƣời Pháp là ngƣời đem cây về nƣớc ta và phổ biến cách trồng nên nhân dân ta gọi cây này là “khoai tây” (Vũ Hƣớng Văn, 2007) [12], (Macdec, 1963) [45]. Khoai tây vừa là cây lƣơng thực vừa là cây thực phẩm có giá trị dinh dƣỡng cao. Củ khoai tây chứa trung bình 19% hydratcacbon (trong đó 15% tinh bột; 2,2% chất xơ); 0,1% chất béo; 2-3% protein và 79% là nƣớc. Ngoài ra, trong khoai tây còn chứa nhiều loại vitamin và chất khoáng. Ngƣời ta đã tính khoảng hơn 200g khoai tây nƣớng cả vỏ cung cấp 844mg kali; 28% khẩu phần sắt hàng ngày; 43% khẩu phần vitamin C; 35% khẩu phần vitamin B6 và nhiều chất khác nhƣ niacin, thiamin, folat…. (Vũ Hƣớng Văn, 2007) [12]. Còn theo Bill và Dean (1992), sử dụng 100g khoai tây có thể đảm bảo ít nhất 8% nhu cầu protein; 3% nhu cầu năng lƣợng; 10% nhu cầu sắt; 19% nhu cầu vitamin B1; 20-50% nhu cầu vitamin C của ngƣời trong một ngày (Bill và cs, 1992) [18]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 Khoai tây đƣợc chế biến thành hàng trăm món ăn ngon phục vụ nhu cầu ẩm thực của con ngƣời. Không chỉ vậy, khoai tây còn đƣợc coi là công cụ làm đẹp hiệu quả và dễ sử dụng nhất. Ngoài ra, củ khoai tây cũng còn là nguyên liệu quan trọng của ngành công nghiệp, chế biến thức ăn trong chăn nuôi. Trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo, khoai tây đã đƣợc chế biến thành nhiều sản phẩm thơm ngon, có giá trị dinh dƣỡng cao. Khoai tây cũng đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất cồn, cao su nhân tạo (Hồ Hữu An và cs, 2005) [1]. Đặc biệt, khoai tây cũng là một dƣợc phẩm. Củ khoai tây có vị ngọt, tính bình, có tác dụng bổ khí, kiện tỳ, tiêu viêm. Nó dùng để chữa chứng khó tiêu, đau bụng, viêm loét dạ dày, viêm tuyến nƣớc bọt, say nắng, sốt, bỏng nhẹ, eczema, vết thƣơng…Hoa khoai tây chữa bệnh tăng huyết áp và là nguyên liệu chiết rutin để chữa bệnh. Quả và mầm củ khoai tây ít đƣợc dùng làm thuốc vì dễ gây độc. Trong công nghiệp dƣợc phẩm, chúng đƣợc chiết lấy solanin để làm thuốc giảm đau, chữa đau bụng, đau nhức xƣơng khớp, chữa dị ứng, chống hen, viêm phế quản, động kinh (Hƣơng Tú, 2008) [11]. Trong củ khoai tây có nhiều chất chống oxi hoá, nó có khả năng ngăn ngừa quá trình lão hoá, hạn chế sự phát triển của ung thƣ và một số bệnh khác. Các nhà nghiên cứu tại trƣờng Đại học Y Harvard-Mỹ đã phát hiện ra rằng: những ngƣời thƣờng xuyên ăn khoai tây có khả năng giảm ung thƣ tuyến tiền liệt (Vũ Hƣớng Văn, 2007) [12]. Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy củ khoai tây rất giàu sterol, giúp tăng cƣờng khả năng miễn dịch của cơ thể. Có nghiên cứu cho thấy, khoai tây có tác dụng làm chậm sự tấn công của HIV/ AIDS. Theo dõi trên một nhóm bệnh nhân HIV thấy những ngƣời ăn khoai tây có khả năng sống thêm đƣợc ít nhất 2 năm nữa so với những bệnh nhân không ăn (Vũ Hƣớng Văn, 2007) [12]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 1.1.2. Một số đặc điểm sinh học của cây khoai tây Cây khoai tây thuộc loại thân thảo, bao gồm các bộ phận thân, lá, rễ, hoa, quả, hạt. Thân và lá khoai tây có nhiều lông, lá kép lông chim không đối xứng. Hoa cân đối, cánh hoa có gốc dính liền nhau. Nhị đực kết dính thành ống hoặc chóp cụt, nhị cái ở trên và dễ rụng. Cây khoai tây chủ yếu là tự thụ, một số trƣờng hợp giao phấn. Cánh hoa có các màu: trắng, tím- đỏ, tím xanh, xanh thẫm. Quả có hai ô, hạt rất nhỏ có mầm uốn cong. Khoai tây thƣờng đƣợc nhân giống bằng củ. Củ là phần phình to của phần thân cây n