Luận văn Nghiên cứu tinh sạch pectinase từ nấm sợi aspergillus awamori và xác định tính chất của chế phẩm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME UREASE 1.1.1 Giới thiệu chung về enzyme urease [2, 7, 77, 92] Urease có tên hệ thống là carbamine amidohydrolase, là enzyme xúc tác quá trình thủy phân urea thành ammonia và khí cacbonic. Nó thuộc nhóm enzyme hydrolase (enzyme thủy phân). Trong bảng phân loại enzyme theo quy ước quốc tế, urease mang mã số EC 3.5.1.5 trong đó: số 3 chỉ nhóm chính-hydrolase, số 5 chỉ nhóm phụ enzyme tác dụng lên liên kết C-N, khác liên kết peptid, số 1 chỉ phân nhóm phụ cắt các amid thẳng (amidohydrolase), số 5 chỉ số thứ tự của urease trong phân nhóm phụ. Hình 1.1: Enzyme urease Như vậy, từ tên kí hiệu quốc tế của urease, ta có thể biết được nó là enzyme thủy phân thuộc nhóm amidase, xúc tác phản ứng thủy phân liên kết C-N, không phải liên kết peptid. Urease lần đầu tiên được J.B.Sumner tách chiết và kết tinh từ đậu rựa (jack bean - Canavalia ensiformis) vào năm 1926. Hiện nay, urease từ đậu rựa là loại urease được sử dụng nhiều nhất. 1.1.2 Cấu tạo Bình thường urease tồn tại ở dạng tinh thể 8 cạnh, trong suốt không màu, có đường kính tùy phương pháp chiết tách và có khối lượng cũng như hình dạng khác nhau tùy vào nguồn thu nhận [7]. Hình 1.2: Tinh thể urease được J.B.Sumner tách chiết và kết tinh. Urease là một enzyme cấu trúc bậc 4. Mỗi phân tử enzyme có từ 3 – 4 tâm hoạt động. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng có sự hiện diện của các nhóm –SH tại trung tâm hoạt động. Các nhóm này đóng vai trò rất quan trọng đối với khả năng xúc tác của urease: góp phần trong việc hình thành phức chất enzyme – cơ chất, kết hợp cơ chất với các cofactor của enzyme, duy trì cấu trúc không gian của enzyme để đảm bảo hoạt lực xúc tác. Các nghiên cứu cho thấy rằng hoạt tính của urease giảm khá nhiều nếu như các nhóm –SH này bị vô hoạt [7,92]. Ngoài ra, tại trung tâm hoạt động, người ta còn tìm thấy sự có mặt của 2 ion Ni2+. Hai ion này liên kết rất chặt chẽ với phân tử protein. Tuy nhiên, trong môi trường acid với sự có mặt của EDTA nồng độ 1mM thì các ion này bị giải phóng khỏi liên kết, dẫn đến việc giảm hoạt tính của urease. Các ion Ni2+ tạo liên kết với các acid amin và tạo ra bề mặt hoạt hóa làm tăng hoạt tính của enzyme [2,7,92]. Hình 1.3: Trung tâm hoạt động của enzyme urease Về khối lượng phân tử, urease từ những nguồn khác nhau có phân tử lượng khác nhau. Theo các kết quả nghiên cứu của Joseph và Evelyn, khối lượng phân tử urease được xác định bằng phương pháp lọc gel trên cột Agarose A_15m sẽ dao động trong khoảng 420.000 Da đến 540.000 Da [45]. 1.1.3 Cơ chế xúc tác [2,7,92] Hình 1.4: Cơ chế xúc tác của urease Cơ chế xúc tác của enzyme urease được chấp nhận nhiều nhất hiện nay là cơ chế dựa trên vai trò khác nhau của 2 ion Ni2+. Trong đó, một ion sẽ liên kết và hoạt hóa urea, còn ion còn lại sẽ liên kết và hoạt hóa nước. Dựa trên hình vẽ, ta nhận thấy, ban đầu ion Ni2+ - 1 tạo liên kết với nguyên tử oxy trong nhóm carbonyl và nhóm OH- của nước là cầu nối giữa ion Ni2+ - 2 với nguyên tử C trong nhóm carbonyl của urea. Ở giai đoạn sau, trong phức hợp enzyme – cơ chất sẽ diễn ra sự chuyển dịch điện tử và kết quả là ammoniac được giải phóng kết hợp với acid carbamic để tạo thành ammonia carbamate, kèm theo là sự tái cấu trúc lại trung tâm hoạt động của enzyme. Như vậy, vai trò của 2 ion kim loại Ni2+ là rất quan trọng trong việc tạo liên kết giữa enzyme với cơ chất ở giai đoạn tạo phức chất trung gian. Đây chính là một cofactor của urease. Trong thực tế, nhiều nghiên cứu đã chứng minh, trong phản ứng thủy phân urea dưới sự xúc tác của enzyme urease, sản phẩm chính là ammonium carbamate NH4COONH2. Mặc dù vậy, vẫn có sự phân hủy ammonium carbamate để tạo thành khí CO2 và NH3 và sự phân hủy này không phụ thuộc vào việc có hay không có enzyme urease mà lại phụ thuộc vào bản chất của dung dịch đệm sử dụng. Các loại đệm phosphate và maleate sẽ tạo thuận lợi cho quá trình phân hủy tạo CO2 và NH3, ngược lại, ammonium carbamate bền trong đệm citrate và tris. 1.1.4 Cơ chất của enzyme urease [2,7,92] Enzyme urease có tính đặc hiệu tuyệt đối đối với cơ chất urea. Nghiên cứu của Jabri và cộng sự năm 1995 đã chứng minh rằng vận tốc phản ứng thủy phân urea dưới xúc tác của enzyme urease cao hơn phản ứng thủy phân không enzyme đến 1014 lần. Ngoài ra, người ta nhận thấy urease cũng xúc tác phản ứng thủy phân một số cơ chất khác có cấu trúc gần giống với urea như semicarbazide, formamide, acetamide, methylurea, hydroxyurea, phenyl phosphorodiamidate, phosphoric triamide, diamidophosphate, phosphoramidate và một số amide, ester khác của acid phosphoric. Tuy nhiên, tốc độ phản ứng thủy phân các cơ chất khác của enzyme urease thấp hơn nhiều so với cơ chất là urea. 1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme urease 1.1.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất [4] Tốc độ của phản ứng enzyme trong một giới hạn nào đó phụ thuộc vào nồng độ cơ chất có trong môi trường. Khi nào chưa bị bão hòa bởi cơ chất thì tốc độ phản ứng vẫn tỉ lệ thuận với nồng độ cơ chất. 1.1.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ Phản ứng dưới sự xúc tác của enzyme cũng giống như các phản ứng hóa học khác nghĩa là khi nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng cũng tăng theo. Tuy nhiên, vì enzyme có bản chất protein nên có thể bị biến tính nếu nhiệt độ vượt quá một giới hạn nào đó. Vì vậy, mỗi enzyme sẽ có một nhiệt độ hoặc một khoảng nhiệt độ mà tại đó, năng lực xúc tác của nó là cao nhất. Người ta gọi đó là nhiệt độ tối thích Topt cho enzyme hoạt động [4]. Đối với urease có nguồn gốc từ đậu rựa, theo các tác giả thì nhiệt độ tối thích vào khoảng 40 – 50oC. Ở nhiệt độ này, hoạt tính của enzyme là lớn nhất. Khi nhiệt độ vượt quá 65oC, hoạt tính của urease bị giảm và có thể mất hẳn khi nhiệt độ đạt 85oC. Tuy nhiên, nhiệt độ tối thích của urease không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nguồn thu nhận, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, pH, thời gian phản ứng… [2,7] Urease ở dung dịch loãng không có cơ chất thường kém bền nhiệt nhất, còn ở dạng bột khô và có cơ chất thì khá bền nhiệt [2,7]. Ở nhiệt độ thấp, hoạt tính của urease giảm nhưng urease không bị biến tính. 1.1.5.3 Ảnh hưởng của pH pH ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính enzyme do pH làm thay đổi trạng thái ion hóa của phân tử enzyme và cơ chất. Nghiên cứu của Howell và Sumner về enzyme urease kết luận urease có pHopt = 6 khi nồng độ cơ chất urea 8% và bằng 7,5 khi nồng độ urea là 1%. Điều này cho thấy giá trị pH tối ưu của urease không cố định và nó còn phụ thuộc vào nồng độ cơ chất, nhiệt độ cũng như vào nguồn thu nhận. Ngoài ra, tính chất của dung dịch đệm cũng ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme urease [2,4,7]. Theo các tài liệu nghiên cứu thì pH tối thích của urease nằm trong khoảng từ 6,4 – 7,6. Urease từ đậu rựa và hầu hết các loại vi sinh vật có pHopt dao động xung quanh giá trị 7, urease từ tảo Spirulina maxima có pHopt khoảng 8,7, trong khi đó, các loại acid urease có giá trị pH tối thích từ 2 trở xuống [92]. 1.1.5.4 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa, chất kìm hãm Mỗi enzyme đều tồn tại một số hợp chất vô cơ hoặc hữu cơ mà sự có mặt của chúng có khả năng kích thích hoặc kìm hãm hoạt động của enzyme, gọi là chất kích thích (chất hoạt hóa) và chất kìm hãm (chất ức chế). Tuy nhiên không có sự phân biệt rõ ràng chất ức chế và kìm hãm vì một chất có thể là kích thích với enzyme này nhưng là kìm hãm của enzyme khác hoặc ở nồng độ này là kích thích, nồng độ khác là kìm hãm [6]. Chất hoạt hóa Chất hoạt hóa là các chất có khả năng làm tăng hoạt động xúc tác của enzyme hoặc làm cho enzyme chuyển từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động. Các chất này có thể là các anion, các ion kim loại, các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp, có thể đóng vai trò nhóm ngoại của các enzyme 2 cấu tử hoặc tham gia vào cấu tạo của coenzyme, hoặc là cầu nối giữa enzyme với cơ chất, hoặc là cầu nối giữa phần apoenzyme với coenzyme [4]. Hoạt tính của urease bị ức chế khi các nhóm –SH bị vô hoạt. Do vậy, những chất có tác dụng phục hồi chức năng của các nhóm –SH tại trung tâm hoạt động như L-cystein thì có thể làm hoạt hóa urease [2,7,92]. Những nhóm –SH tại tâm hoạt động chịu sự oxy hóa dưới tác động của nhiều yếu tố, và sự oxy hóa này xảy ra với tốc độ đáng kể khi có mặt của các ion kim loại xúc tác như Ag+, Cu2+, Hg2+… Khi dùng EDTA để hấp thụ các ion kim loại trong dung dịch sẽ làm cho tính ổn định của enzyme urease nói riêng và các enzyme chứa nhóm –SH trong tâm hoạt động tăng lên rất nhiều [2,7,92]. Khi nồng độ EDTA-Na2 thấp , EDTA sẽ hấp thụ các ion kim loại, nghĩa là một cách gián tiếp cũng là một chất hoạt hóa urease. Tuy nhiên, nếu nồng độ EDTA-Na2 đạt đến một ngưỡng nào đó, nó sẽ hấp thụ ion Ni2+ tại trung tâm hoạt động của enzyme, làm ức chế urease. Điều này cũng đồng nghĩa với việc EDTA là một chất kìm hãm [92]. Chất kìm hãm Chất kìm hãm là các chất có tác dụng chuyển enzyme từ trạng thái hoạt động sang trạng thái không hoạt động, hoặc từ trạng thái hoạt động mạnh sang trạng thái hoạt động yếu. Các chất này tồn tại hai loại kìm hãm: cạnh tranh và không cạnh tranh [4]. Kìm hãm cạnh tranh: xảy ra trong trường hợp chất kìm hãm có cấu trúc tương đồng với cơ chất, vì vậy cũng có khả năng kết hợp với enzyme, giảm mối liên kết giữa enzyme và cơ chất. Như vậy, các hợp chất như hydroxyurea, dihydroxyurea, thiourea hay hydroxamic acid là những chất ức chế đặc hiệu cạnh tranh của urease. Vì chúng có cấu tạo gần giống cơ chất (urea) nên chúng cũng có khả năng kết hợp với enzyme. Do đó sự có mặt của chúng trong dung dịch làm giảm tốc độ phản ứng thủy phân urea. Có thể làm giảm tác dụng của những chất ức chế này bằng cách tăng nồng độ cơ chất urea [2,4,7,92]. Kìm hãm không cạnh tranh: xảy ra trong trường hợp chất kìm hãm có khả năng kết hợp với enzyme hoặc cơ chất, có thể là ion kim loại cùng hóa trị với các ion kim loại là nhóm ngoại của enzyme. Các ion kim loại như như Hg2+, Cu2+, Pb2+, Mn2+… là những chất kìm hãm không cạnh tranh vì nó có hóa trị cùng với cofactor của urease là Ni2+. Các ion kim loại này sẽ tranh giành các liên kết với Ni2+, và do đó sẽ làm “khóa”ù trung tâm hoạt động của urease. Urease rất nhạy cảm với sự có mặt của các ion kim loại vì ngoài tác dụng kìm hãm không cạnh tranh như trên, các ion kim loại còn có thể làm biến tính enzyme do chúng thúc đẩy phản ứng oxy hóa các nhóm –SH tại tâm hoạt động. Sự kìm hãm urease của các ion kim loại giàm dần theo thứ tự sau: Ag+> Hg2+> Cu2+> Zn2+> Cd2+> Au2+> Pb2+> Co2+> Ni2+> Ce2+> Mn2+. Ví dụ: với hàm lượng AgNO3 là 0,002 mg/ml đã làm mất hoạt tính của urease, đối với HgCl2 là 0,004 mg/ml và đối với Cu2+ là 0,01 mg/ml [2,4,7,92]. Ngoài ra, các acid hay kiềm đặc cũng như các tác nhân gây kết tủa protein như acid tricloacetic (TCA) hay tannin cũng là những chất có tác dụng kìm hãm enzyme urease. 1.1.6 Nguồn thu nhận enzyme urease [2,7,92] Urease được các nhà khoa học tìm thấy khá sớm ở những nguồn nguyên liệu khác nhau. Năm 1980, Miquel tìm thấy urease ở nhiều loài vi sinh vật, nhất là các vi sinh vật trong đất, trong thực vật và một số ít ở động vật. Ông đã tìm ra hơn 200 loài vi khuẩn, nhiều loại nấm men và ở đa số các loại thực vật bậc cao có khả năng sinh tổng hợp urease. Các vi khuẩn có chứa urease tham gia vào quá trình đồng hóa urea thành muối amon có nhiều loài, chúng có tên chung là Ureabacterium, hầu hết chúng thuộc 2 họ: Cocoaceae và Bacilaceae [2,7,92]. Trong ngành cộng nghệ sinh học, C.Palacco và A.Havir cũng đưa ra phương pháp thu nhận enzyme từ nuôi cấy mô đậu. Nguồn enzyme urease tự nhiên trong các cây họ đậu rất phong phú. Các nhà khoa học đã tận dụng từ các nguồn này để trích ly ra enzyme urease và ứng dụng rộng rãi trong các ngành phân tích thực phẩm và y học. Bảng 1.1: Tính chất của một số loại urease từ các nguồn khác nhau (Liu và cộng sự, 1996) [30] Nguồn enzyme Hoạt tính riêng (đơn vị/ml) Km (mmol/l) Đậu nành đen 21.8 3.75 Đậu nành xanh 25.2 3.71 Đậu rựa 137 1.54 Hạt bí ngô 34 1.55 Hạt bí ngô bỏ vỏ 26.5 1.89 Đậu nành bỏ vỏ 31.3 3.46 Hạt dưa hấu bỏ vỏ 23.6 4.16 1.1.7 Ứng dụng của enzyme urease Enzyme urease hiện nay được ứng dụng nhiều trong các ngành nông nghiệp, thực phẩm, trong y học và các lĩnh vực phân tích khác. Trong nông nghiệp, urease được sử dụng để thúc đẩy quá trình thủy phân urea thành NH3 cung cấp thành phần Nitơ cho cây trồng. Quá trình thủy phân này được thực hiện bởi hệ vi sinh vật trong đất do chúng sản sinh ra một lượng đáng kể enzyme urease. Trong ngành thực phẩm: urease đã được ứng dụng để phát hiện sự tồn tại của urea trong các loại sản phẩm thịt cá, nước giải khát, các sản phẩm lên men và các sản phẩm từ sữa. Urea là một hợp chất không được phép có mặt trong thực phẩm. Vì một nguyên nhân không mong muốn, hoặc do có chủ ý mà một lượng urea đã có mặt trong các sản phẩm thực phẩm. Do đó mà các chế phẩm urease được sử dụng để phát hiện và, có thể định lượng được urea trong thực phẩm. Trong y học, urease được sử dụng để xác định hàm lượng urea trong máu và nước tiểu của người. Đây là phương pháp khá chính xác, ít tốn kém và dễ tiến hành. Việc xác định hàm lượng urea trong máu và nước tiểu sẽ cho biết năng lực hoạt động của các hệ cơ quan, mà quan trong nhất là thận và hệ bài tiết. Ngoài ra, urease còn được gắn trong các tiểu vi cầu dùng để loại urea của máu trong thận nhân tạo. Trong công nghệ môi trường: urease dùng để phân tích hàm lượng các kim loại nặng trong các chất thải và trong nguồn nước. Trong lĩnh vực phân tích: urease được ứng dụng làm các điện cực urease để xác định hàm lượng urea trên dòng liên tục. 1.2 SƠ LƯỢC VỀ ENZYME CỐ ĐỊNH [4] 1.2.1 Giới thiệu 1.2.1.1 Định nghĩa Enzyme cố định có thể được hiểu theo 2 nghĩa: Nghĩa hẹp: enzyme không hòa tan là enzyme được đưa vào những pha riêng rẽ, pha này được tách riêng với dung dịch tự do. Pha enzyme không hòa tan trong nước và được gắn với các polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn. Nghĩa rộng: các chất xúc tác cố định là các enzyme, tế bào, cơ thể sống ở trạng thái cho phép sử dụng lại. Như vậy, theo nghĩa rộng, enzyme không hòa tan bao gồm cả enzyme được cố định vào một chất mang, cả enzyme có trong tế bào sống được cố định trong các bình phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần. Enzyme không hòa tan hay enzyme cố định thường là những enzyme hòa tan được gắn vào một chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Nhờ quá trình gắn này mà enzyme từ trạng thái hòa tan chuyển sang không hòa tan. 1.2.1.2 Đặc điểm của enzyme cố định [4] Enzyme cố định có các đặc điểm sau đây: Hoạt tính riêng của enzyme cố định thường nhỏ hơn hoạt tính riêng của enzyme tự do cùng loại. Sở dĩ có sự thay đổi về hoạt tính riêng của enzyme cố định là do những nguyên nhân sau đây: Do ảnh hưởng điện tích của chất mang: khi điện tích của chất mang có sự khác biệt với điện tích của enzyme thì khi gắn enzyme vào chất mang, cấu trúc không gian của enzyme có sự thay đổi ở mức độ nhất định. Chính vì sự thay đổi cấu trúc này mà khả năng kết hợp giữa enzyme và cơ chất sẽ kém đi, dẫn đến hoạt tính của chúng cũng giảm. Do enzyme bị nhốt vào mạng lưới hoặc bị liên kết bởi chất mang khiến cho sự tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất gặp khó khăn. Enzyme cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis – Menten nhưng có một số sai khác nhất định: Có thể xảy ra sự cạnh tranh cơ chất với enzyme và chất mang. Xảy ra hiện tưởng cản trở sự khuếch tán của cơ chất và sản phẩm làm giảm tốc độ phản ứng. Enzyme cố định thường có tính bền nhiệt hơn enzyme tự do nhờ tác dụng che chở của các chất mang. Enzyme cố định thường có pH tối ưu không trùng với pH tối ưu của enzyme tự do cùng loại. Enzyme cố định có khả năng bảo quản tốt hơn enzyme tự do. Enzyme cố định có thể tái sử dụng nhiều lần do có thể tách riêng enzyme ra khỏi cơ chất một cách dễ dàng sau phản ứng và độ bền của enzyme cố định cao hơn so với enzyme tự do. 1.2.1.3 Ưu, nhược điểm của enzyme cố định [4] Enzyme cố định có các ưu điểm sau: Enzyme cố định có thể sử dụng lặp lại nhiều lần trong một thời gian dài. Enzyme cố định không lẫn vào trong sản phẩm cuối của phản ứng enzyme, do đó nó không gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm, hay nói cách khác chúng ta không phải tốn chi phí cho việc tách enzyme ra khỏi sản phẩm. Có thể ngừng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách hệ chất mang-enzyme ra khỏi dung dịch cơ chất. Enzyme cố định tương đối bền với các tác nhân vật lý và hóa học hơn enzyme tự do. Dễ dàng tiến hành quá trình sản xuất theo phương pháp liên tục. Bên cạnh đó, enzyme cố định vẫn có một số nhược điểm như sau: Sự có mặt của chất mang có thể làm giảm hoạt tính của enzyme. Trong đa số trường hợp, enzyme có thể bị giảm hoặc mất hoạt tính sau quá trình cố định. Tuy nhiên, những hạn chế trên là không đáng kể so với lợi ích mà enzyme cố định đem lại. Do vậy, ngày càng có nhiều nghiên cứu về cố định enzyme cũng như ứng dụng enzyme cố định vào sản xuất công nghiệp. 1.2.2. Các phương pháp cố định enzyme [4] Các phương pháp cố định enzyme được chia thành 2 nhóm chính: Phương pháp hóa học: Gắn enzyme lên chất mang bằng liên kết cộng hóa trị. Gắn các phân tử enzyme lại với nhau bằng liên kết cộng hóa trị. Phương pháp vật lý: Hấp phụ enzyme lên chất mang bằng liên kết vật lý như: lực mao quản, liên kết ion, lực Van der Waals… Phương pháp nhốt enzyme trong khuôn gel hoặc màng bao vi thể. Bảng 1.2: Ưu – Nhược điểm của các phương pháp cố định enzyme [4]. Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm Phương pháp hóa học Phương pháp gắn enzyme lên chất mang bằng liên kết cộng hóa trị - Liên kết giữa enzyme và chất mang là liên kết bền, do đó hạn chế