Luận văn Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn bacillusphân lập từ đất vườn sinh protease kiềm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thị Trần Thụy NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS PHÂN LẬP TỪ ĐẤT VƯỜN SINH PROTEASE KIỀM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số : 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS. LƯƠNG ĐỨC PHẨM Thành phố Hồ Chí Minh - 2009 LỜI CẢM ƠN Luận văn được hoàn thành bởi sự nỗ lực của bản thân, sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, bạn bè, anh chị em đồng nghiệp và những người thân trong gia đình. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Lương Đức Phẩm, người đã tận tình chỉ dẫn tôi trong suốt quá trình xây dựng đề cương và hoàn thành luận văn. Cô Trần Thanh Thủy đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn Ban lãnh đạo, cùng các thầy cô giáo Khoa Sinh, trường Đại học sư phạm thành phố Hồ Chí Minh đã tổ chức và thực hiện thành công khóa đào tạo thạc sĩ chuyên ngành Vi Sinh Vật (2006 – 2009) , tạo cơ hội học tập nâng cao trình độ về lĩnh vực mà tôi tâm huyết. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường trung học phổ thông Ngô Quyền, phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học sư phạm thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Xin gửi lời cảm ơn Phòng khoa học công nghệ - sau đại học, trường Đại học sư phạm thành phố Hồ Chí Minh, đã tạo điều kiện thuận lợi để luận văn được hoàn thành đúng tiến độ. MỞ ĐẦU Ngày nay với các hiểu biết của mình về vi sinh vật con người đã sử dụng chúng vào trong các lĩnh vực sản xuất khác nhau như công nghiệp, nông nghiệp, y học... để phục vụ cho đời sống của con người. Ta biết rằng trong quá trình sống của thế giới sinh vật luôn xảy ra các phản ứng hóa sinh để chuyển hóa vật chất. Các phản ứng này luôn gắn chặt với sự có mặt của enzim với hiệu suất xúc tác cực kì lớn so với các chất vô cơ và hữu cơ khác và có tính đặc hiệu cao. Do đó các chế phẩm enzim thường được sử dụng rộng rãi trong y học, trong công nghiệp, sản xuất thực phẩm và trong chăn nuôi... Trong đó protease là nhóm enzim được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực công nghiệp. Người ta có thể thu enzim protease từ nhiều nguồn khác nhau như từ động vật, thực vật và vi sinh vật. Song trong cơ thể động vật và thực vật quá trình tổng hợp enzim thường gắn liền với yêu cầu sống của cơ thể vì vậy muốn thu được enzim cần phải phá bỏ các tổ chức đó. Nguyên liệu động vật để sản xuất enzim thường phải tươi lấy ngay sao khi động vật vừa bị giết chết và bảo quản ở -200C, thời gian thu hoạch dài làm cho việc sử dụng động vật và thực vật để sản xuất enzim là không kinh tế và không thể đáp ứng được nhu cầu ngày càng cao về enzim. Trong khi đó các vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn có chứa rất nhiều loại enzim có hoạt tính cao. Chúng lại có khã năng chuyển hóa các chất và sinh sản nhanh, nguồn nguyên liệu nuôi cấy vi khuẩn lại thường rẻ tiền, người ta có thể dể dàng điều khiển sự tổng hợp enzim từ các nguồn nguyên liệu khác nhau. Trong các nguồn protease từ vi sinh vật có nhiều triển vọng nhất là việc thu protease từ vi khuẩn Bacillus vì thường có hoạt tính cao và có nhiều ưu thế hơn hẳn. Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu, phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus sinh enzim protease từ đất vườn”. Với các nội dung sau:  Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus từ đất vườn.  Nghiên cứu hình thái tế bào và khuẩn lạc, một số đặc tính sinh học cơ bản.  Nghiên cứu nuôi cấy trên môi trường tiêu chuẩn và môi trường thay thế để thu được sinh khối lớn và hoạt tính enzim protease cao.  Nghiên cứu phương pháp tách chiết và thu nhận chế phẩm protease có hoạt lực cao.  Ý nghĩa của đề tài  Ý nghĩa khoa học Góp phần xác định một số đặc điểm về hình thái của tế bào và khuẩn lạc của một số vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus, các điều kiện, các yếu tố môi trường và ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến việc thu sinh khối và thu enzym protease của vi khuẩn.  Ý nghĩa thực tiễn Dựa trên những gì thu được trong quá trình nghiên cứu góp phần giúp xác định được một số môi trường dinh dưỡng phù hợp có thể ứng dụng vào qui mô sản xuất lớn hơn để thu sinh khối hoặc thu chế phẩm enzym protease có hoạt tính cao. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vi khuẩn Bacillus 1.1.1. Đặc điểm chung Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, nước, không khí do chúng có khả năng hình thành bào tử và sống hiếu khí tùy tiện. Phần lớn các chủng thuộc các loài của giống này đều có khả năng sinh ra nhiều - amylase và protease kiềm, có một số chủng sinh ra xenlulase, giống này không sinh ra lipase.  Bacillus là vi khuẩn Gram dương  Hình dạng: hình que có kích thước khác nhau (0,5-2,5)x(1,2-10)m.  Bacillus có chùm tiêm mao giúp chúng có khả năng di động.  Dinh dưỡng : Là vi khuẩn dị dưỡng hóa năng, hoại sinh thu năng lượng nhờ oxi hóa các hợp chất hữu cơ  Chúng sống hiếu khí hay hiếu khí tùy tiện.  Bacillus có khả năng sinh bào tử. Thông thường bào tử được tạo ra khi tế bào đã trãi qua giai đoạn phát triển mạnh nhất, hay do cạn kiệt chất dinh dưỡng. Mỗi tế bào dinh dưỡng sinh ra một bào tử. Khi bào tử trưởng thành tế bào dinh dưỡng tự phân giải, bào tử được giải phóng ra khỏi tế bào mẹ. Bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia tử ngoại, phóng xạ và nhiều độc tố, vì chúng có khả năng tồn tại ở trạng thái bào tử trong nhiều năm. Bào tử của vi khuẩn không phải là một hình thức sinh sản mà chúng chỉ là một hình thức thích nghi để giúp vi khuẩn vượt qua những điều kiện sống bất lợi.  Đa số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 – 10 như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2 - 6 như Bacillus acidocaldrius.[7]  Về nhiệt độ có nhiều chủng ưa nhiệt độ cao (450C – 750C), hay ưa lạnh (50C – 250C), nhưng thường gặp Bacillus sống ở nhiệt độ 340C – 370C. Hầu hết Bacillus không gây độc cho người và động vật. Một số loại gây độc cho côn trùng . Chùng có khả năng sinh enzim ngoại bào do đó được ứng dụng nhiều trong công nghiệp, bảo vệ môi trường, nông nghiệp.... Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên: 1.1.1.1. Bacillus subtilis [4], [14], [17], [18] Bacillus subtilis được nhà khoa học cùng thời với Rober Knoch tên là Ferdinand Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872 Bacillus subtilis phân bố nhiều trong đất đặc biệt là cỏ khô nên còn được gọi là trực khuẩn cỏ khô. Hình dạng: có dạng hình que, ngắn và nhỏ, kích thước 0,6 x (3-5) m. Bacillus subtilis là vi khuẩn gram dương, đôi khi các tế bào nối lại với nhau tạo thành chuổi dài, ngắn khác nhau hoặc các tế bào đứng riêng rẽ. Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám trắng, hoặc tạo ra lớp màng mịn, lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn hoặc mép lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào môi trường thạch. Bacillus subtilis có lớp màng nhày (giáp mạc), được cấu tạo chủ yếu từ polypeptit chủ yếu là axit polyglutamic. Việc hình thành màng nhày giúp vi khuẩn có khả năng chịu được điều kiện khắc nghiệt nhờ màng nhày có khả năng dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh bị tổn thương khi khô hạn. Màng nhày có thể quan sát được khi nhuộm tiêu bản: qua kính hiển vi ta có thể nhìn thấy màng nhày của vi khuẩn Bacillus subtilis là không màu, trong suốt, tế bào của vi khuẩn bắt màu đỏ trên nền tiêu bản xanh hoặc đen. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của Bacillus subtilis là 360C – 500C, tối đa khoảng 600C, là loại ưa nhiệt cao. Bào tử của Bacillus subtilis cũng chịu được nhiệt khá cao. Bào tử có hình bầu dục, kích thước 0,6m – 0,9m. Phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. Chúng phát tán rộng rãi, được tạo ra vào cuối thời kì sinh sản của vi khuẩn. Do mỗi tế bào chỉ tạo ra một bào tử nên đây không phải là một hình thức sinh sản mà chỉ là một hình thức thích nghi giúp vi khuẩn vượt qua các điều kiện sống bất lợi. Bào tử có thể sống từ vài năm đến vài chục năm. Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống trong 200-300 năm của bào tử Bacillus subtilis [6]. Khi gặp điều kiện thuận lợi những bào tử này sẽ phục hồi và tiếp tục chu kì sống của mình. Các vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng phân hủy pectin và polysaccarit ở mô thực vật và góp phần tạo ra các nốt trên củ khoai tây bi u. Chúng sinh trưởng trên môi trường nguyên thủy xác định mà không cần bổ sung thêm yếu tố kích thích sinh trưởng. Sự sinh trưởng phát triển của chúng góp phần làm hỏng các nguyên liệu có nguồn gốc động thực vật. Chúng không sinh trưởng trên thực phẩm có tính axit ở điều kiện tối ưu. Chúng là nguyên nhân gây hỏng bánh mì và nhiều thực phẩm khác [16]. Bacillus subtilis sinh ra rất nhiều loại enzim, đặc biệt là  amylase và protease kiềm có giá trị cao, ngoài ra Bacillus subtilis có khả năng sinh ra riboflavin ( tiền vitamin B2 )[3]. Vì vậy chúng được ứng dụng nhiều trong công nghiệp cũng như một số ngành khác. 1.1.1.2. Bacillus megaterium Megaterium có nghĩa là “ con thú lớn”. Tế bào của nó khá lớn, gấp 2 lần tế bào của Bacillus subtilis, chiều ngang (1,2-1,5)m có thể đến 2m, dài từ 3m -12m, ở các giống nuôi già thì tế bào ngắn hơn, tròn hơn đôi khi hình thoi với đầu hẹp lại. Tế bào chứa nhiều hạt nhỏ và chất dinh dưỡng dự trữ (hạt mỡ, glycogen) [4]. Bào tử lớn hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 x (0,7 – 1)m, bào tử lớn nhất có đường kính từ 1,2 – 1,5 m. Chúng nằm lệch tâm thường theo chiều ngang hoặc xiên của tế bào.[4] Khuẩn lạc tròn đều, không thùy, không nếp, mép tròn đều hoặc hơi lượn sóng, lồi nhẵn, nhưng thường có vòng viền quanh đồng tâm trên bề mặt, màu trắng sữa hay đục. Sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng đơn giản không cần thêm bất kì một yếu tố sinh trưởng nào. Bacillus megaterium cũng sản sinh ra các enzim tương tự như Bacillus subtilis nên cũng được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp. 1.1.1.3. Bacillus mensentericus Bacillus mensentericus rất giống Bacillus subtilis. Thường có trong đất, hạt mì và ngũ cốc và đặc biệt là trên khoai tây và cỏ khô. Hình dạng tế bào hình que mảnh, dài ngắn khác nhau (3-10)x(0,5- 0,6)m. Đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuổi dài. Khuẩn lạc ăn sâu và bám chặt vào môi trường thạch, nhăn nhúm, khô không mọc lan ra môi trường thường có màu màu xám nhạt hoặc trắng hơi vàng kem, vàng nâu, hồng hoặc đen.[4] Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của Bacillus mensentericus là 36 - 450C tối đa là 50 – 550C, ở pH từ 4,5 – 5 thì nó ngừng phát triển. Bào tử của Bacillus mensentericus thường có hình bầu dục và dài khoảng 0,5 – 0,9 m, nắm ở vị trí bất kì trong tế bào, tế bào thường không phình to khi mang bào tử. Bacillus mensentericus có hoạt tính enzim amylase và protease cao hơn hẳn Bacillus subtilis nhưng lên men đường lại kém hơn. Hai loại trực khuẩn này rất phổ biến trong tự nhiên, chúng lây nhiễm và làm hư hỏng thực phẩm, nhất là các thực phẩm có chứa nitơ và các sản phẩm giàu đường, đây cũng là loại được ứng dụng vào ngành công nghệ sản xuất enzim protease và amylase... Ngoài ra nó còn sinh ra một hợp chất có hoạt tính kháng một số vi khuẩn( như Vibrio) gọi là Bacterioxin. 1.1.1.4. Bacillus cereus Tế bào của Bacillus cereus dày, kích thước (1 – 1,5) x (3 -5)m, có khi dày hơn, chúng thường đứng riêng rẽ hay xếp thành chuổi. Bào tử có hình bầu dục kích thước 0,9 x ( 1,2 – 1,5 )m nắm lệch tâm, tế bào chất của nó có chứa các hạt và không bào.[4] Khuẩn lạc của Bacillus cereus là khuẩn lạc phẳng, khá khuyếch tán, hơi lõm, trắng đục, mép lồi lõm [4]. Bào tử của nó phát tán khắp nơi, trong đất, không khí... Thường sinh sôi và nảy nở trên thực phẩm và có thể sinh ra độc tố gây ngộ độc thực phẩm. Nó còn được áp dụng để sản xuất thuốc kháng sinh. [16] 1.1.1.5. Bacillus pumilus Bào tử phát tán rộng khắp mọi nơi, thường Baccillus pumilus có mặt trong đất nhiều hơn Bacillus subtilis.[7] Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ lan không ranh giới. Tế bào của nó gần giống với tế bào của Bacillus subtilis.[7] 1.1.1.6. Bacillus polymyxa Tế bào của Bacillus polymyxa có kích thước (0,6 – 1 ) x (2 -7)m, đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi hoặc chuổi ngắn. Khi hình thành bào tử tế bào đó sẽ phồng lên hình quả chanh. [4] Khuẩn lạc của Bacillus polymyxa không màu, phẳng hoặc lồi, trơn, nhày, lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy.[18] Bào tử hình bầu dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như hình sao. Chúng phát tán rộng, kích thước dài khoảng ( 1,7 – 2,6) m, nằm giữa tế bào. Loại vi khuẩn này làm giảm pectin và polysaccarit trong cây. Chúng còn có khả năng cố định đạm. Chúng thường sinh trưởng và phát triển trên thực vật đang bị hỏng. Vì vậy, người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. Môi trường kem và những môi trường có tính axit yếu phù hợp với loại vi khuẩn này. Chúng là nguồn để sản xuất thuốc kháng sinh polimixin. Đây là một loại vi khuẩn rất phổ biến và có ích, chủ yếu là cho công nghiệp dược. 1.1.1.7. Bacillus brevis Người ta thường tìm thấy và phân lập chúng từ đất và thực phẩm. Bacillus brevis là trực khuẩn kích thước ( 0,7 -1) x (3 -5 )m. Chúng thường đứng riêng rẽ. Bào tử hình bầu dục, có kích cỡ (0,8 – 1)m, nằm cuối tế bào làm cho đầu tế bào hơi bị phồng to lên.[4] Khuẩn lạc thường màu trắng, đôi khi có sắc vàng, lồi hoặc phẳng lấp lánh, mép răng cưa giống dạng mỡ đặc. Về nhu cầu dinh dưỡng, Bacillus brevis yêu cầu hỗn hợp axit amin cho sinh trưởng và phát triển, không cần bổ sung vitamin. 1.1.1.8. Bacillus simplex Tế bào của Bacillus simplex thường nhỏ bé , có kích thước ( 2-5)x 0,6m, thường đứng riêng rẽ không kết thành chuỗi. Khuẩn lạc giống khuẩn lạc của Bacillus cereus, phẳng khá khuyếch tán, với bề mặt hơi xù xì. hơi lõm, màu đục, mép lồi lõm. Đặc biệt khuẩn lạc của Bacillus simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết vào môi trường.[4] Bào tử có hình bầu dục, có kích thước từ 0,6 – 0,9 m, nằm lệch tâm. 1.1.1.9. Bacillus linchenniformis Bào tử của chúng chủ yếu phát tán trong đất. Chúng sinh trưởng và phát triển trên các loại thực phẩm. Đặc biệt chúng có khả năng sản xuất ra Bacitracin, một loại kháng sinh có ích trong y học, nên chúng được ứng dụng phổ biến trong công nghiệp dược và sản xuất kháng sinh dùng trong chăn nuôi làm chất kích thích sinh trưởng. 1.1.2. Một số nghiên cứu và ứng dụng của giống Bacillus ở VN và trên thế giới Hiện nay chủng Bacillus đang được ứng dụng vào rất nhiều các lĩnh vực sản xuất khác nhau để phục vụ cho đời sống của con người như : 1.1.2.1. Sinh tổng hợp enzim Ở Việt Nam công nghệ enzym gần như chưa phát triển nhiều. Tuy đã có rất nhiều các nghiên cứu đề cập đến việc sản xuất các enzym của động vật, thực vật và vi sinh vật nhưng hầu như chưa có enzym nào được sản xuất với qui mô công nghiệp. Việt Nam vẫn hoàn toàn lệ thuộc vào nguồn enzym của nước ngoài.[9] Hiện nay chủng Bacillus đang được ứng dụng để sản xuất một số enzym sau: Tên Enzym Mã số EC Nguồn Nội bào(I) / Ngoại bào (E) Sản lượng Ngành ứng dụng -Amylase 3.2.1.1 Bacillus E +++ Starch -Amylase 3.2.1.2 Bacillus E + Starch Glucose isomeraseh 5.3.1.5 Bacillus I ++ Fructose syrup Penicillin amidase 3.5.1.11 Bacillus I - Pharmaceutical Proteasei 3.4.21.14 Bacillus E +++ Detergent (Nguồn Các enzym này có vai trò trong nhiều ngành sản xuất khác nhau. 1.1.2.2. Công nghệ thực phẩm [16] Việc ứng dụng vi sinh vật vào việc chế biến thực phẩm là những công trình đầu tiên của con người trong lĩnh vực này. Ngày nay người ta ứng dụng vi khuẩn Bacillus để sản xuất ra các enzym có vai trò quan trọng trong công nghệ thực phẩm như amylase dùng để đường hóa tinh bột v.v... 1.1.2.3. Dược phẩm và y tế [16] Trong lĩnh vực bảo vệ sức khỏe con người và vật nuôi, công nghệ vi sinh vật cũng tạo ra được nhiều loại thuốc trị bệnh hữu hiệu, nhất là những bệnh nhiểm khuẩn như : kháng sinh...như penixilinase sản xuất từ Bacillus subtilis. 1.1.2.4. Nông nghiệp và đời sống [35] Trong trồng trọt các chất hoạt động do vi sinh vật sinh ra có thể dùng làm thuốc trừ sâu và bảo vệ thực vật như Bacillus thuringiensis gây bệnh cho côn trùng và các chất trao đổi có tính độc của nó được dùng như những chất diệt côn trùng đặc hiệu. 1.1.2.5. Bảo vệ môi trường [23] Vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ môi trường vì chúng tham gia vào quá trình phân hủy các chất trong vòng tuần hoàn vật chất. Nhờ có các loại vi sinh vật trong đó có vi khuần Bacillus mà các rác thải được thải ra do hoạt động sống của con người sẽ được phân hủy. 1.1.3. Hệ enzim của vi khuẩn Bacillus Bacillus có khả năng sản sinh ra nhiều loại enzim có hoạt tính cao như protease, amylase, xenlulase. 1.1.3.1. Protease Protease là enzim xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptid[-CO-NH-] giữa các loại axit amin trong phân tử protein (hay các nhóm polypeptid) thành axit amin. Protease là một nhóm enzim phân giải protein (gồm proteinaza, peptidaza, desaminaza....) mà phần lớn được tế bào tiết ra ngoài và hoạt động ở bên ngoài tế bào. Protease có chức năng sinh học rất đa dạng, đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa quá trình trao đổi chất ở sinh vật sống. 1.1.3.2. Amylase Amylase là các enzim xúc tác cho quá trình thủy phân tinh bột và các polyoza tương tự như dextrin, glucogen. Có hai loại amylase là: -amylase, - amylase và glucoamylase tuy nhiên các chủng Bacillus thường chỉ có khả năng tổng hợp -amylase còn không tổng hợp được - amylase và glucoamylase [9] -amylase xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết -1,4 glucozit nội mạch ở bất kì vị trí nào trong phân tử tinh bột với cơ chất là amyloza. - amylase cho sản phẩm thủy phân chủ yếu là maltoza (khoảng 87%) và một ít glucose (13%) với cơ chất là amylopectin, -amylase chỉ thủy phân liên kết 1,4 không thủy phân liên kết 1,6. Trong họ Bacillus thường gặp rất nhiều chủng phát triển ở nhiệt độ không cao nhưng lại sinh ra -amylase chịu nhiệt cao. 1.1.3.3. Xenlulase Xenlulase là một phức hệ enzim phức tạp xúc tác cho sự thủy phân xenlulose thành xenlobiose và cuối cùng thành glucose. Một phức hệ enzim xenlulase gồm 3 enzim chủ yếu đó là:  Endogluconaza hay CMC-ase: là enzim tấn công chuổi xenlulose một cách tùy tiện và phân hủy liên kết -1,4 glucozit.  Enxogluconase hay xenlobiohydrolase: giải phòng xenlobiose hoặc glucose từ đầu không khử của xenlulose, tác dụng yếu lên CMC, nhưng tác dụng mạnh lên xenlulose vô định hình hoặc xenlulose đã được phân hủy một phần.  - glucozidase hay xenlobiose : thủy phân xenlobiose và các xenlodextrin khác hòa tan trong nước. 1.2. Enzim protease 1.2.1. Sơ lược lịch sử nghiên cứu enzim [9], [34], [35] Từ trước thế kỉ 17 con người đã biết sử dụng rộng rãi các qui trình enzim trong hoạt động thực tế như làm bánh mì, bia, rượu...tuy nhiên, việc ứng dụng enzim trong giai đoạn này hoàn toàn có tính chất kinh nghiệm thuần túy. Từ thế kỉ 17 đến thế kỉ 19, người ta đã đề ra được khái niệm lên men. Vanhelmont, người Hà Lan, lần đầu tiên đã quan sát được sự tạo thành các chất khí khác với không khí trong quá trình lên men. Năm 1659, Silvius lần đầu tiên đã chỉ ra rằng tất cả các quá trình sống đều là những quá trình hóa học. Năm 1787, Pabroni cho rằng bản chất quá trình lên men và sự phân giải một chất này bởi một chất khác là “ferment”. Năm 1876, Kiihne là người đầu tiên đề nghị gọi chất xúc tác sinh học là enzim. Trong số tất cả các enzim của hệ tiêu hóa thì protease là enzim được nghiên cứu sớm hơn tất cả. Các protease ở động vật được nghiên cứu sớm nhất.  Từ thế kỉ 18, nhà tự nhiên học Pháp là Reomur đã làm thí nghiệm và đã phát hiện được rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu hóa thịt.  Năm 1836, Schwann đã quan sát được hoạt động phân giải protein của dịch vị. Tuy nhiên, 30 năm sau mới tách được enzim này.  Năm