Luận văn Phân lập chủng vi khuẩn lactic và khảo sát khả năng sinh tổng hợp bacteriocin

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC PHÂN LẬP CHỦNG VI KHUẨN LACTIC VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN SVTH: LÊ THỊ HỒNG VÂN CBHD: THS. NGUYỄN VŨ TUÂN TP Hồ Chí Minh, 01/2008 TÓM TẮT LUẬN VĂN Trong công nghệ thực phẩm vi khuẩn lactic được sử dụng rộng rãi từ rất lâu đời bởi ứng dụng phong phú của nó trong cuộc sống. Những nghiên cứu gần đây cho thấy vi khuẩn lactic còn có khả năng sinh tổng hợp các bacteriocin, những peptide hoạt tính kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh mẽ sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Để có những khảo sát sâu hơn trước hết cần phải có chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp được bacteriocin cao. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhằm mục đích: - Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp được bacteriocin - Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng phân lập được. Chủng vi khuẩn sẽ được phân lập từ các nguồn tự nhiên như sữa tươi tự lên men, các loại rau quả muối chua (cải muối chua, cà pháo muối chua, dưa giá), kim chi và giá đỗ. Qua quá trình thí nghiệm, ta có được chủng vi khuẩn lactic phân lập từ sữa tươi tự lên men thể hiện vùng ức chế Listeria monocytogenes chứng tỏ có khả năng sinh tổng hợp được bacteriocin. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên sự sinh trưởng và sự sinh tổng hợp bacteriocin của chủng nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Từ kết quả đạt được thì khi nuôi cấy chủng trong môi trường dịch thể MRS có pH ban đầu 6.0 ở nhiệt độ 30oC chủng sẽ sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin tốt nhất. Khi đó, độ đo quang O.D. 600 nm = 1.417 và hoạt tính bacteriocin đạt 2250 AU/ml. Tóm lại, nghiên cứu đã phân lập được chủng vi khuẩn lactic yêu cầu từ sữa lên men tự nhiên và điều kiện nuôi cấy tối thích để chủng sinh trưởng, sinh tổng hợp bacteriocin cao nhất là trong môi trường dịch thể MRS có pH ban đầu 6.0 ở 30oC. Với những ý nghĩa của nghiên cứu, em hy vọng sẽ làm được những khảo sát có ý nghĩa và góp phần tạo nền tảng cho những nghiên cứu sau này, mang lại những giá trị thật lớn trong việc bảo quản thực phẩm, đảm bảo an toàn thực phẩm và nâng cao giá trị sống của con người. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT LUẬN VĂN ii MỤC LỤC iv DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG vii MỞ ĐẦU 1 Chương 1: TỔNG QUAN VI KHUẨN LACTIC 3 1.1.1 Đặc điểm chung 3 1.1.2 Các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin 8 BACTERIOCIN 12 1.2.1 Sơ lược về bacteriocin 12 1.2.2 Bacteriocin từ LAB 13 1.2.3 Bacteriocin từ vi khuẩn khác 22 1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin 23 1.2.5 Định vị và tinh sạch bacteriocin 26 1.2.6 Ứng dụng của bacteriocin 27 1.2.7 Tình hình nghiên cứu 30 1.3 PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC 33 Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 NGUYÊN LIỆU 37 2.1.1 Chủng vi sinh vật và môi trường nuôi cấy, giữ giống 37 2.1.2 Nguồn nguyên liệu phân lập 37 2.2 THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM 39 2.3 PHƯƠNG PHÁP 40 2.3.1 Phương pháp dàn đều và cấy ria 40 2.3.2 Phương pháp định danh tế bào vi khuẩn 41 2.3.3 Khảo sát các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng lên sự sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của chủng mới phân lập 43 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 PHÂN LẬP 45 3.2 KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN CỦA CHỦNG MỚI PHÂN LẬP THEO THỜI GIAN NUÔI CẤY 51 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN 60 4.2 KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 68 MỞ ĐẦU Ngày nay, nhu cầu ăn uống của xã hội ngày càng được nâng cao. Cũng từ đó, việc an toàn vệ sinh thực phẩm đang được chú trọng và đẩy mạnh. Bảo quản thực phẩm nói chung và phụ gia thực phẩm hay bao bì thực phẩm nói riêng đang là những vấn đề nóng bỏng của xã hội. Nếu như những chất phụ gia thực phẩm có nguồn gốc hóa học tác dụng phổ rộng với nhiều loài sinh vật và gây ảnh hưởng đến sức khỏe của con người thì những hướng nghiên cứu trên những chất chống vi sinh vật mới có nguồn gốc tự nhiên, an toàn và đặc hiệu đối với từng loài vi sinh vật gây hại đang được quan tâm. [27] Và việc tìm ra bacteriocin là một bước ngoặt lớn trong bảo quản thực phẩm. Đây là những chất có nguồn gốc sinh học đã được cho phép sử dụng trong bảo quản thực phẩm ở nhiều nước phát triển. Loài có khả năng sinh tổng hợp ra nó cũng không có gì xa lạ với chúng ta, đó là các vi khuẩn lactic, những vi khuẩn mà con người sử dụng trong thực phẩm hàng ngàn năm nay [16]. Bacteriocin từ Lactococcus lactis là các protein nhỏ, bền nhiệt, chống vi sinh vật. Nisin là một bacteriocin được sử dụng rộng rãi do có hoạt tính với phổ rộng kháng các vi khuẩn G+, bao gồm Listeria monocytogenes, ngăn chặn sự phát triển của bào tử nảy mầm Bacillus và Clostridium. [18] Các chủng vi khuẩn lactic là các vi sinh vật quan trọng nhất trong sản xuất các thực phẩm lên men hằng ngày như bơ, sữa chua, kem, phomai. Chúng sản xuất rất nhiều các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn, bao gồm bacteriocin. Các hợp chất này xuất hiện như là sản phẩm cuối của quá trình biến dưỡng. [7] Những chủng vi khuẩn lactic khác nhau sẽ có khả năng sinh tổng hợp những loại bacteriocin khác nhau, với số lượng khác nhau [27]. Vì vậy mà việc tìm ra các nguồn tự nhiên để có thể phân lập ra những chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp hàm lượng chất chống vi sinh vật cao là cần thiết. Từ những điều thực tiễn đó, việc tìm ra được các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và sản xuất được các loại bacteriocin sử dụng trong việc bảo quản thực phẩm an toàn là cần thiết và có ý nghĩa quan trọng. Trong bài nghiên cứu này, chúng ta sẽ xây dựng những bước khởi đầu cho việc khảo sát sâu rộng hơn và có giá trị ứng dụng hơn. Mục tiêu nghiên cứu của luận văn gồm: - Từ những nguồn tự nhiên như sữa, kim chi, các rau quả muối chua, giá đỗ phân lập chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. - Khảo sát sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin chủng phân lập được. - Khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ lên sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin để từ đó có thể rút ra được các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn. Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 VI KHUẨN LACTIC 1.1.1 Đặc điểm chung 1.1.1.1 Hình thái và dinh dưỡng của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic (Lactic acid bacteria–LAB) là các vi khuẩn G+, chịu acid, không hình thành bào tử, hình que hoặc hình cầu [2]. Một số loài hiếu khí và có thể sử dụng oxygen thông qua enzyme flavoprotein oxidase, trong khi những giống khác kỵ khí nghiêm ngặt. Vi khuẩn lactic phát triển tối ưu ở pH 5.5–5.8 và và có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp đối với các amino acid, peptide, nucleotide base, vitamin, khoáng, acid béo và carbohydrate. [1, 45] Những vi khuẩn này sản xuất acid lactic như là sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men carbohydrate. Đặc điểm này đã gắn liền LAB với thực phẩm lên men để acid hoá ngăn chặn sự phát triển của tác nhân gây hư hỏng. Protein bacteriocin được sản xuất bởi nhiều chủng LAB, cung cấp một hàng rào ngăn cản vi sinh vật gây hư hỏng và gây bệnh. [11] LAB được sử dụng rộng rãi trong sản xuất sản phẩm lên men bởi vì hoạt tính trao đổi chất đặc biệt của nó. Sự acid hoá, sản phẩm của acid hữu cơ, và các chất kháng khuẩn khác như bacteriocin, góp phần to lớn trong bảo quản thực phẩm bằng cách ức chế mầm bệnh và chất gây ô nhiễm. Sự chuyển hoá lactose nhờ nuôi cấy vi khuẩn lactic đã làm cho thực phẩm lên men dễ tiêu hoá hơn. Nhiều hoạt tính biến dưỡng và enzyme của LAB dẫn đến sự sản xuất các chất dễ bay hơi hình thành mùi thơm và hương vị đặc trưng cho sản phẩm lên men. [45] Các giống của LAB chủ yếu là Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Teragenococcus, Vagococcus, Weisella…[11, 45]. (a) (b) (c) Hình 1.1: Hình ảnh một số vi khuẩn lactic: (a) Lactococcus lactis, (b) Streptococcus thermophilus, (c) Lactobacillus helveticus [11] 1.1.1.2 Trao đổi chất của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic được chia thành ba nhóm dựa trên mô hình lên men. - Lên men đồng hình: sản xuất hơn 85% acid lactic từ glucose - Lên men dị hình: sản xuất chỉ 50% acid lactic và một lượng ethanol, acid acetic và CO2 - Được biết đến như là giống lên men dị hình sản xuất DL–lactic acid, acid acetic và CO2. [45] Dưới điều kiện dư glucose và hạn chế oxygen, LAB biến đổi một phân tử glucose theo con đường Embden–Meyerhof–Parnas thành hai phân tử pyruvate. Cân bằng oxy hoá khử nội bào được duy trì trong suốt quá trình oxi hoá NADH, đồng thời với sự khử pyruvate thành acid lactic. Quá trình này sinh 2 phân tử ATP cho mỗi glucose được tiêu thụ. Đại diện cho kiểu lên men này là các giống Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus và Lactobacillus nhóm I. LAB lên men dị hình phân giải glucose theo con đường pentose phosphate. Một phân tử glucose-6-phosphate ban đầu bị khử hydro thành 6-phosphogluconate và sau đó khử nhóm carboxyl hình thành một phân tử CO2. Kết quả là pentose–5–phosphate bị chia ra thành một glyceraldehyde phosphate (GAP) và một phân tử acetyl phosphate. GAP sau đó được chuyển hoá thành lactate như trong lên men đồng hình, với acetyl phosphate bị biến đổi thành ethanol qua chất trung gian là acetyl–CoA và acetaldehyde. Về mặt lý thuyết, sản phẩm cuối (bao gồm ATP) được sản xuất có số lượng bằng với từ quá trình dị hoá một phân tử glucose. Các LAB lên men dị hình bắt buộc gồm Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, và Lactobacillus nhóm III [45, 47]. Phân giải protein [11] proteinase Protein bị cắt thành những hợp chất nhỏ hơn Protein + H2O polypeptide Hoạt tính này của Lactobacillus trong hệ thống đường ruột làm thuỷ phân protein bởi hệ vi sinh vật tiêu hoá dễ dàng, một đặc tính có giá trị cao cho trẻ em, người bệnh và người già. Phân giải lipid [11] lipase Phức hợp chất béo bị cắt thành các hợp chất nhỏ hơn Acid béo + glycerol Triglyceride (chất béo) Acid béo + glycerol Hoạt tính này được sử dụng trong việc thiết kế chế độ dinh dưỡng cho trẻ em, người bệnh và người già. Bằng chứng từ thử nghiệm y khoa và lâm sàng cho thấy Lactobacillus có thể phân hủy cholesterol. Biến dưỡng lactose [11] LAB có enzyme β–galactosidase, glycolase và lactic dehydrogenase (LDH) sản xuất acid lactic từ lactose. Acid lactic được xem là có một số chức năng sinh lý như: - Làm tăng sự tiêu hoá protein sữa bằng cách kết tủa chúng trong sữa đông - Cải thiện khả năng sử dụng calcium, phosphor và sắt - Kích thích sự bài tiết dịch từ dạ dày - Làm gia tăng nhu động ruột - Cung cấp nguồn năng lượng cho quá trình hô hấp Vị trí đồng phân quang học của acid lactic được sản xuất dựa vào bản chất của môi trường. Hình dạng cấu trúc của các isomer này như sau: D (-) levorotatory lactic acid         L (+) dextrorotatory lactic acid Ở người, cả hai isomer đều được hấp thụ lên thành ruột. Trong khi L (+) lactic acid được chuyển hoá hoàn toàn nhanh chóng trong tổng hợp glycogen, D (-) lactic acid được tổng hợp ít hơn, và acid không được chuyển hoá sẽ được thải ra trong nước tiểu. Khả năng chuyển lactose thành acid lactic được sử dụng điều trị thành công bệnh không dung hợp lactose. Những người mắc bệnh này không thể chuyển hoá lactose bởi vì thiếu hệ thống enzyme cần thiết hoặc chúng hoạt động không bình thường. Acid lactic làm thấp pH môi trường ruột xuống khoảng 4 đến 5 để ngăn cản sự phát triển của vi sinh vật gây thối rữa và E. coli, vi sinh vật đòi hỏi pH môi trường tối ưu là 6 đến 7. Một vài acid dễ bay hơi sản xuất trong quá trình lên men cũng có hoạt tính ức chế dưới điều kiện thế oxy hoá khử thấp [45]. 1.1.1.3 Sản xuất các chất đối kháng LAB cũng ức chế sự phát triển của vi sinh vật có hại gây thối rữa thông qua các sản phẩm chuyển hoá như hydrogen peroxide, carbon dioxide, diacetyl và đặc biệt là bacteriocin. Sản phẩm chuyển hoá của LAB sử dụng để chống lại các vi sinh vật gây thối rữa và chức năng sinh hóa có thể ức chế vi sinh vật của chúng được tóm tắt trong bảng dưới đây. Bảng 1.1: Một số sản phẩm chuyển hóa của LAB và phương thức hoạt động của chúng [44, 45] Sản phẩm chuyển hoá Phương thức hoạt động 1.Carbon dioxide Ngăn cản sự khử nhóm carboxyl, giảm tính thấm của màng 2. Diacetyl Phản ứng với protein gắn arginine 3. Hydrogen peroxide/ Lactoperoxidase Oxy hoá các protein cơ bản 4. Acid lactic Acid lactic bị phân ly đi xuyên qua màng, làm thấp pH nội bào. Nó gây trở ngại quá trình chuyển hoá như oxi hoá khử phosphor 5. Bacteriocin Ảnh hưởng đến màng, tổng hợp protein và DNA. Bacteriocin sản xuất bởi LAB là chủ đề của các nghiên cứu lớn bởi vì hoạt tính kháng khuẩn của chúng chống lại sự sản sinh vi khuẩn làm hư hỏng thực phẩm. Chủng sản xuất bacteriocin của LAB rất quan trọng trong việc cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong đường ruột. Bacteriocin là protein có hoạt tính sinh học, có khả năng ngăn ngừa sự xâm nhiễm của vi sinh vật bằng cách ức chế chúng và liên kết với receptor đặc biệt của tế bào. Hiện nay, có những mối quan tâm về việc ứng dụng bacteriocin trong cả bảo quản thực phẩm và ức chế mầm bệnh vi khuẩn. Hầu hết các bacteriocin đều được chiết xuất từ vi khuẩn liên quan trong lên men thực phẩm. Sự sản xuất bacteriocin và tính kháng được xem là các đặc tính quan trọng của chủng, có thể được sử dụng trong thương mại như là chất loại bỏ hoặc làm giảm sự phát triển của chủng gây bệnh không mong muốn. [34] Hiện nay, các nghiên cứu đi sâu vào việc mở rộng hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin, đáng chú ý là nisin cùng với những nhân tố kháng khuẩn khác như hệ thống lactoperoxide hiện diện trong sữa, các tác nhân khác và các bacteriocin khác [16]. 1.1.2 Các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin 1.1.2.1 Chủng Lactococcus lactis (a) Giới thiệu [11] Chủng Lactococcus lactis (Lc. lactis) là các vi sinh vật quan trọng nhất trong sản xuất thực phẩm lên men hằng ngày như bơ, sữa chua, kem, fromage. Chúng sản xuất nhiều hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn, bao gồm bacteriocin. Các hợp chất này xuất hiện như là sản phẩm cuối của quá trình biến dưỡng. Dựa vào đặc tính sinh hóa, Lc. lactis được phân thành: Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. cremoris và Lc. lactis subsp. cremoris. Lc. lactis subsp. lactis có khả năng phát triển được ở nhiệt độ 40oC, sống được ở nồng độ muối ăn lên đến 4.0% và sản xuất được amonia từ arginine trong khi Lc. lactis subsp. cremoris không có tính chất này. Lc. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis được phân biệt dựa vào khả năng chuyển hóa citrate. Một trong những đặc điểm quan trọng nhất trong công nghiệp của chủng Lc. lactis là plasmid được mã hoá, có nghĩa là plasmid mang gen có các đặc tính như biến dưỡng lactose và sản xuất proteinase cũng như tính kháng bacteriophage. Các plasmid biến dưỡng quan trọng khác và chức năng của chúng ở Lactococcus cũng đã được mô tả. Do đó, hiện nay chúng ta đã có những hiểu biết về gen plasmid kiểm soát biến dưỡng đường sucrose, galactose, mannose, xylose, glucose, sử dụng citrate, tính kháng phage, biến dưỡng và giới hạn DNA, sự tập hợp tế bào, sản xuất bacteriocin... Thêm vào đó, Lactococcus chứa nhiều plasmid, kích cỡ từ 1 đến >100 kbp. Plasmid mã hoá cho bacteriocin thường lớn và kích thước của chúng từ 81 đến 133 kbp. Chủng Lc. lactis thường có từ 2 đến 11 plasmid DNA, trong khi số lượng phổ biến thường là từ 4 đến 7. (b) Tính chất của chủng Lc. lactis [10, 11] Biến dưỡng protein Giống như tất cả các LAB khác, Lactococcus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp. Để phát triển, chúng đòi hỏi các protein, peptide, các amino acid đặc biệt, các nucleic acid và vitamine,... Trong sữa, nồng độ isoleucine, leucine, valine, histidine và methionine cần thiết cho Lactococcus là thấp hơn 1 mg/l. Nó bao gồm các amino acid tự do, có mặt ban đầu trong sữa, cung cấp nguồn nitơ cho khoảng 2% mật độ tế bào cuối cùng. Casein, có khoảng 80% protein hiện diện trong sữa, trở thành nguồn nitơ sơ cấp sau khi dùng hết nitơ từ các nguồn không phải protein. Biến dưỡng lactose Biến dưỡng lactose của chủng Lc. lactis khác với biến dưỡng lactose của các vi khuẩn lactic khác. Khác biệt là ở sự dị hoá cùng lúc glucose và galactose. Chức năng của con đường đó đối với Lactococcus là để sinh năng lượng và acid lactic là sản phẩm phụ. Biến dưỡng citrate Trong nhóm Lactococcus thì chỉ Lc. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis là có khả năng biến dưỡng citrate hiện diện trong sữa. Sản phẩm cuối cùng của biến dưỡng citrate là diacetyl, acetoin, 2,3 butanediol, acid acetic và carbondioxide, chúng tạo nên hương vị cho các loại thực phẩm bơ sữa lên men. Citrate được vận chuyển vào tế bào mà không cần có sự biến đổi. Ở Lc. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, phản ứng này được xúc tác bởi citrate permease. Sinh tổng hợp bacteriocin Các chủng thuộc loài Lc. lactis có khả năng sinh tổng hợp rất nhiều các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn bao gồm cả bacteriocin. Các hợp chất này xuất hiện như là sản phẩm cuối của quá trình biến dưỡng. Bacteriocin từ Lactococcus là các protein nhỏ, bền nhiệt, chống lại các vi khuẩn lân cận. Nisin là bacteriocin được biết đến nhiều nhất, có 34 amino acid, khối lượng phân tử 3354 kDa, thuộc nhóm lantibiotic, được ứng dụng nhiều trong bảo quản thực phẩm. Nisin gây cản trở việc cung cấp năng lượng của tế bào bằng cách tạo nên bào tử trên màng và làm mất điện thế màng. Nisin có hoạt tính với phổ rộng kháng các vi khuẩn G+, bao gồm cả L. monocytogenes, ngăn chặn sự phát triển của bào tử nảy mầm Bacillus và Clostridium và thông qua việc thêm calcium, nó sẽ có hoạt tính kháng lại một số vi khuẩn G+. Một hợp chất khác, lacticin 3147 được xác định là từ Lactococcus thu nhận từ chủng Irish Kefir sử dụng trong sản xuất bơ. Bacteriocin này ngăn cản các mầm bệnh từ vi khuẩ