Luận văn Phân lập, tuyển chọn các giống vi sinh vật sinh protease và gây hương mắm đặc trưng từ chượp mắm và ứng dụng vào sản xuất nước mắm chay từ nấm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC GIỐNG VI SINH VẬT SINH PROTEASE VÀ GÂY HƢƠNG MẮM ĐẶC TRƢNG TỪ CHƢỢP MẮM VÀ ỨNG DỤNG VÀO SẢN XUẤT NƢỚC MẮM CHAY TỪ NẤM Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: TRẦN THỊ ANH THẢO Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC GIỐNG VI SINH VẬT SINH PROTEASE VÀ GÂY HƢƠNG MẮM ĐẶC TRƢNG TỪ CHƢỢP MẮM VÀ ỨNG DỤNG VÀO SẢN XUẤT NƢỚC MẮM CHAY TỪ NẤM Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện ThS. VƢƠNG THỊ VIỆT HOA TRẦN THỊ ANH THẢO Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM TẠ Chúng tôi xin chân thành cảm tạ: Ban giám hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bô Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. ThS Vƣơng Thi Việt Hoa đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. Ks Nguyễn Minh Hiền đã tận tình giúp đỡ , tạo điều kiện cho tôi trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Các bạn bè thân yêu của lớp Công Nghệ Sinh Học 29 và Bảo Quản 29 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. iv TÓM TẮT Đề tài “Phân lập, tuyển chọn các giống vi sinh vật sinh protease và gây hƣơng mắm đặc trƣng và ứng dụng vào sản xuất nƣớc mắm chay từ nấm” đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm Vi Sinh, Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 3/2007 đến 7/2007 dƣới sự hƣớng dẫn của Th.S Vƣơng Thị Việt Hoa nhằm tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng thủy phân và gây hƣơng tốt để ứng dụng thử vào sản xuất thử nghiệm nƣớc mắm chay ngắn ngày từ nấm. Đề tài tiến hành gồm 5 thí nghiệm: Thí nghiệm 1: phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật hiện diện ƣu thế trong chƣợp mắm trên môi trƣờng NA, NB, cơ bản và nƣớc chiết nấm rơm. Thí nghiệm 2: khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc ở thí nghiệm 1 trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm đƣợc bổ sung muối với nồng độ tăng dần từ 0% đến 20%.dựa hàm lƣợng đạm formol sinh ra sau mỗi lần bổ sung muối đƣợc đo bằng phƣơng pháp chuẩn độ formol. Thí nghiệm 3: khảo sát khả năng thủy phân của các chủng vi sinh vật phân lập được từ thí nghiệm 1 và bố trí trên môi trường nước chiết nấm rơm có 20% muối. Thời gian theo dõi sau 24 giờ, khảo sát khả năng hàm lƣợng đạm formol đƣợc sinh ra bằng phƣơng pháp chuẩn độ formol. Thí nghiệm 4: khảo sát khả năng sinh hƣơng của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc từ thí nghiệm 1 trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm có 20% muối. Thời gian theo dõi sau 3 ngày, ghi nhận kết quả qua phép thử cho điểm bằng phƣơng pháp đánh giá cảm quan. Thí nghiệm 5:Sản xuất nƣớc mắm chay từ nấm có bổ sung các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân là 400C-500C. Tỉ lệ phối trộn của dứa từ 15% đến 45%. v Sản phẩm nƣớc mắm chay có bổ sung vi khuẩn gây hƣơng Clostridium.sp và vi khuẩn thủy phân Bacillus.sp đƣợc phân lập và tuyển chọn từ các thí nghiệm 1, thí nghiệm 2, thí nghiệm 3, thí nghiệm 4 để cho ra sản phẩm có giá trị cảm quan cao nhất. Kết quả thu đƣợc: Tất cả các chủng đều có khả năng chịu mặn. Chủng Bacillus sp.1 và Bacillus sp.4 đƣợc chọn làm tác nhân thủy phân. Chủng Clostridium sp.1 và Clostridium sp.2 đƣợc chọn làm tác nhân sinh hƣơng. Nghiệm thức 5 với công thức phối trộn giữa các thành phần nguyên liệu là 45% dứa + 20% nấm rơm + 20% nấm bào ngƣ + 15% muối + 10% canh khuẩn vi khuẩn hiếu khí (gồm vi khuẩn Bacillus sp.1 và Bacillus sp.4 theo tỉ lệ 1:1) + 10% vi khuẩn kị khí (gồm vi khuẩn Clostridium sp.1 và Clostridium sp.2 theo tỉ lệ 1:1) đƣợc chọn làm công thức phối trộn để sản xuất sản phẩm hoàn chỉnh. Tp.HCM, ngày 30 tháng 7 năm 2007 Bộ môn Công Nghệ Sinh Học vi ABSTRACT Subject “ Isolation, selection of microorganism that release protease and create specific smell of fish sauce and applied to produce vegetarian fish sauce from mushroom ” is excicuted in Microorganism Laboratory, Food Technology Faculty, Nong Lam University from 3/2007 to 7/2007, is guided by MSc Vuong Thi Viet Hoa to select bacteria can hydrolyze protein and create specific smell of fish sauce well in order to produce experimentally vegetarian fish sauce from mushroom. The subject has 5 experiments: The 1 st experiment: Isolation, selection of microorganism that is present mainly in fish sauce grounds in NA, NB, Czapek and Volvariella volvacea extract culture. The 2 nd experiment: Survey possibility of salt-resistant of bacteria that isolated on Volvariella volvacea extract culture with salt concentration from 0% to 20%. Survey hydrolysis of protein by title of formol method. The 3 rd experiment: Survey possibility of salt-resistant of bacteria that isolated on Volvariella volvacea extract culture with 20% salt. Survey hydrolys of protein by title of formol method after 24 hours. The fourth experiment: Survey possibility of hydrolysis of bacteria that isolated on Volvariella volvacea extract culture with 20% salt. Result is evaluated by sense organs method. The fifth experiment: Producing experimentally vegetarian fish sauce from mushroom. T 0 opt: 40 0 C – 500C. Ratio of pineapple: 15% - 45%. Vegetarian fish sauce is supplemented Clostridium sp and Bacillus sp that are isolated and selected from the 1 st experiment, the 2 nd experiment, the 3 rd experiment and the fourth experiment. vii Result: All of bacteria have possibility of salt-resistant. Hydrolytic agents are Bacillus sp.1 and Bacillus sp.4. Smell agents are Clostridium sp.1 and Clostridium sp.2. The fifth sample (include: 45% pineapple + 20% Volvariella volvacea + 20% Pleurotus ostreatus + 15% salt + 10% Bacillus sp.1 and Bacillus sp.4 (ratio of Bacillus sp.1 and Bacillus sp.4 is 1:1) + 10% Clotridium sp.1 and Clostrdium sp.2 (ratio of Clostridium sp.1 and Clostridium sp.2 is 1:1)) is chosen the formula of accomplished product. Ho Chi Minh City, July 30 th 2007 Biotechnology Faculty viii MỤC LỤC CHƢƠNG...................................................................................................... TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .................................................................................................................iii Tóm tắt ..................................................................................................................... iv Abtract ...................................................................................................................... vi Mục lục ...................................................................................................................viii Danh sách các bảng .................................................................................................. xi Danh sách các sơ đồ, hình , đồ thị ..........................................................................xiii 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1 1.2. Mục đích, nội dung và giới hạn đề tài ................................................................ 2 1.2.1. Mục đích .......................................................................................................... 2 1.2.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2 1.2.3. Giới hạn đề tài ................................................................................................. 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................... 4 2.1. Khái quát về nƣớc mắm ..................................................................................... 4 2.1.1 Giới thiệu .......................................................................................................... 4 2.1.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình hình thành nƣớc mắm ........................... 4 2.1.3 Giá trị dinh dƣỡng của nƣớc mắm ................................................................... 7 2.2. Cơ chế hình thành nƣớc mắm ............................................................................ 7 2.2.1. Quá trình chuyển hóa protid thành acid amin ................................................. 7 2.2.2. Quá trình tạo hƣơng thơm ............................................................................... 8 2.3. Quy trình sản xuất nƣớc mắm ............................................................................ 8 2.3.1. Quy trình sản xuất nƣớc mắm dài ngày .......................................................... 8 2.3.2. Quy trình sản xuất nƣớc mắm ngắn ngày ..................................................... 10 2.4. Giá trị dinh dƣỡng của nấm ăn ......................................................................... 13 ix 2.5. Sự phân giải của enzyme .................................................................................. 18 2.5.1. Phân loại protease ......................................................................................... 18 2.5.2. Một số nguồn enzyme đƣợc sử dụng ............................................................ 19 2.5.2.1. Protease từ vi sinh vật ................................................................................ 19 2.5.2.2.Protease từ thực vật – enzyme bromelin ..................................................... 20 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................ 21 3.1. Thời gian và địa điểm ....................................................................................... 21 3.2. Nguyên vật liệu thí nghiệm .............................................................................. 21 3.2.1. Nguyên liệu ................................................................................................... 21 3.2.2. Vật liệu .......................................................................................................... 21 3.2.3. Môi trƣờng sử dụng ....................................................................................... 22 3.2.2. Hóa chất sử dụng ........................................................................................... 22 3.3. Nội dung và phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm .............................................. 23 3.4. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng chịu mặn, thủy phân tốt và sinh hƣơng đặc trƣng nƣớc mắm .......................................................... 23 3.4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật hiện diện trong chƣợp mắm .................................................................................................... 23 3.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ............................................. 25 3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng thủy phân của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm .............................................. 26 3.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng sinh hƣơng của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ............................................. 27 3.5. Sản xuất nƣớc mắm chay từ nấm có bổ sung các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc ......................................................................................................................... 29 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................ 32 4.1. Kết quả quá trình phân lập, tuyển chọn các hủnh vi sinh vật có khả năng chịu mặn, thủy phân tốt và sinh hƣơng đặc trƣng nƣớc mắm ................................. 32 4.1.1 Kết quả quá trình phân lập các chủng vi sinh vật .......................................... 32 x 4.1.1.1 Kết quả quá trình phân lập các chủng vi khuẩn hiếu khí ............................ 32 4.1.1.2. Kết quả quá trình phân lập các chủng vi khuẩn kị khí ............................... 35 4.1.2. Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc ......................................................................................................................... 37 4.1.3. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ............................................................. 40 4.1.4. Kết quả khảo sát khả năng sinh hƣơng của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc ......................................................................................................................... 43 4.2. Kết quả sản xuất nƣớc mắm chay từ nấm có bổ sung các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc .......................................................................................................... 44 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 56 5.1. Kết luận ............................................................................................................ 56 5.2. Đề nghị ............................................................................................................. 57 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 68 7. PHỤ LỤC xi DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1. Thành phần hóa học của nƣớc mắm ......................................................... 7 Bảng 2.2. So sánh thành phần nƣớc mắm ngắn ngày có dùng thêm chế phẩm enzyme vi sinh vật và nƣớc mắm dài này theo phƣơng pháp thông thƣờng .......... 12 Bảng 2.3. Thành phần phân tích của một số nấm trồng phổ biến ........................... 14 Bảng 2.4. Hàm lƣợng vitamine và chất khoáng ...................................................... 14 Bảng 2.5. Thành phần acid amin trong nấm ........................................................... 14 Bảng 3.1. Bảng tiêu chuẩn cho điểm về khả năng gây hƣơng của các chủng vi sinh vật trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ......................................................... 28 Bảng 3.2. Bảng chỉ tiêu cảm quan nƣớc mắm ........................................................ 31 Bảng 4.1. Kết quả khảo sát hàm lƣợng đạm formol sinh ra của các chủng vi sinh vật trong môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ở nồng độ muối 0% ............................ 37 Bảng 4.2. Kết quả khảo sát hàm lƣợng đạm formol sinh ra của các chủng vi sinh vật trong môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ở nồng độ muối 3% ............................ 38 Bảng 4.3. Kết quả khảo sát hàm lƣợng đạm formol sinh ra của các chủng vi sinh vật trong môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ở nồng độ muối 10% .......................... 38 Bảng 4.4. Kết quả khảo sát hàm lƣợng đạm formol sinh ra của các chủng vi sinh vật trong môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ở nồng độ muối 20% .......................... 39 Bảng 4.5. Kết quả khảo sát hàm lƣợng đạm formol của các nghiệm thức ............. 41 Bảng 4.6. Bảng điểm đánh giá cảm quan về khả năng gây hƣơng của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc từ chƣợp mắm ................................................................ 43 Bảng 4.7. Kết quả hàm lƣợng đạm amoniac của các nghiệm thức theo thời gian .. 45 Bảng 4.8. Kết quả hàm lƣợng đạm formol của các nghiệm thức theo thời gian .... 46 Bảng 4.9. Kết quả hàm lƣợng đạm amin của các nghiệm thức theo thời gian ....... 47 Bảng 4.10. Kết quả đánh giá cảm quan của nghiệm thức 1 .................................... 48 Bảng 4.11. Kết quả đánh giá cảm quan của nghiệm thức 2 .................................... 48 xii Bảng 4.12. Kết quả đánh giá cảm quan của nghiệm thức 3 .................................... 49 Bảng 4.13. Kết quả đánh giá cảm quan của nghiệm thức 4 .................................... 49 Bảng 4.14. Kết quả đánh giá cảm quan của nghiệm thức 5 .................................... 49 xiii DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ, HÌNH , ĐỒ THỊ SƠ ĐỒ TRANG Sơ đồ 2.1. Quy trình tổng quát công nghệ sản xuất nƣớc mắm dài ngày ................. 9 Sơ đồ 2.2. Quy trình tổng quát công nghệ sản xuất nƣớc mắm ngắn ngày ............ 11 Sơ đồ 3.1. Các bƣớc tiến hành thí nghiệm .............................................................. 23 Sơ đồ 4.1. Quy trình đề nghị sản xuất nƣớc mắm chay ngắn ngày từ nấm ........... 54 HÌNH TRANG Hình 4.1. Khuẩn lac Bacillus sp.1 - Tế bào vi khuẩn (x100) .................................. 32 Hình 4.2. Khuẩn lac Bacillus sp.2 - Tế bào vi khuẩn (x100) .................................. 33 Hình 4.3. Khuẩn lac Bacillus sp.3 - Tế bào vi khuẩn (x100) .................................. 34 Hình 4.4. Khuẩn lac Bacillus sp.4 - Tế bào vi khuẩn (x100) .................................. 34 Hình 4.5. Khuẩn lac Bacillus sp.5 - Tế bào vi khuẩn (x100) .................................. 35 Hình 4.6. Khuẩn lac Clostridium sp.1 - Tế bào vi khuẩn (x100) ............................ 36 Hình 4.7. Khuẩn lac Clostridium sp.2 - Tế bào vi khuẩn (x100) ............................ 36 Hình 4.8. Hiện tƣợng tạo quầng trong xung quanh khuẩn lạc của những chủng vi khuẩn có khả năng sinh protease trên môi trƣờng cơ bản bổ sung 10% sữa ...... 40 Hình 4.9. Sản phẩm nƣớc mắm chay ...................................................................... 55 ĐỒ THỊ TRANG Đồ thị 4.1. Biến thiên khả năng sinh đạm formol của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm theo nồng độ muối .............. 39 Đồ thị 4.2. Khảo sát hàm lƣợng đạm formol sinh ra do các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc từ chƣợp mắm trong các nghiệm thức... .......................................... 42 Đồ thị 4.3 Khảo sát hàm lƣợng đạm amoniac của các nghiệm thức theo thời gian. ......................................................................................................................... 45 Đồ thị 4.4. Khảo sát hàm lƣợng đạm formol của các nghiệm thức theo thời gian .......................................................................................................................... 46 Đồ thị 4.5. Khảo sát hàm lƣợng đạm amin của các nghiệm thức theo thời gian .... 47 Đồ thị 4.6. Điểm có trọng lƣợng về cảm quan màu sắc giữa các nghiệm thức ...... 50 xiv Đồ thị 4.7. Điểm có trọng lƣợng về cảm quan mùi giữa các nghiệm thức ............. 50 Đồ thị 4.8. Điểm có trọng lƣợng về cảm quan vị giữa các nghiệm thức ................ 51 Đồ thị 4.9. Điểm có trọng lƣợng về cảm quan độ trong giữa các nghiệm thức ...... 51 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề. Trung Quốc có nƣớc tƣơng, Việt Nam có nƣớc mắm. Từ lâu nƣớc mắm đã trở thành một loại nƣớc chấm rất thông dụng và gần gũi với ngƣời dân Việt Nam, những ai đi xa khi nhớ đến quê hƣơng thì không thể quên hƣơng vị của nƣớc mắm quê nhà. Ngƣời nƣớc ngoài thì biết đến nƣớc mắm nhƣ món ăn truyền thống của ngƣời Việt Nam, đã có bài báo so sánh nƣớc mắm đối với Việt Nam giống nhƣ rƣợu cônhắc đối với nƣớc Pháp.Vừa đƣợc xem là loại gia vị vừa đƣợc xem là thực phẩm giàu dinh dƣỡng, nó chứa nhiều acid amin không thay thế nhƣ lysin, valin…các vitamine hoà tan trong nƣớc B1, B2, PP…và các nguyên tố Ca, P, S… Khi xã hội phát triển,chất lƣợng cuộc sống ngày càng đƣợc nâng cao thì con ngƣời luôn đòi hỏi đến các loại thực phẩm không chỉ về chất lƣợng và mùi vị, mà còn phải đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm nhƣng vẫn giữ đƣợc giá cả hợp lý. Và những yêu cầu này không loại trừ