Luận văn Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học hydrocacbon thơm của một vài chủng vi khuẩn được phân lập từ nước ô nhiễm dầu tại Quảng Ninh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM --------------------------------- LÊ TIẾN MẠNH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC HYDROCACBON THƠM CỦA MỘT VÀI CHỦNG VI KHUẨN ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ NƯỚC Ô NHIỄM DẦU TẠI QUẢNG NINH LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái nguyên - 2008 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM --------------------------------- LÊ TIẾN MẠNH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC HYDROCACBON THƠM CỦA MỘT VÀI CHỦNG VI KHUẨN ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ NƯỚC Ô NHIỄM DẦU TẠI QUẢNG NINH Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. NGHIÊM NGỌC MINH Thái nguyên - 2008 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Lêi c¶m ¬n! Trước hết tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới TS. Nghiêm Ngọc Minh đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo tận tình của PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà và các anh chị Phòng Công nghệ Sinh học Môi trường, đặc biệt là KS. Đàm Thúy Hằng, Thạc Sỹ Nguyễn Bá Hữu những người đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để hoàn thành bản luận văn này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô và các bạn đồng nghiệp Khoa Sinh – KTNN đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường Đại học Sư Phạm - Đại Học Thái Nguyên. Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó! Hà nội, tháng 9 năm 2008 Học viên Lê Tiến Mạnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác. Tác giả Lê Tiến Mạnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC BẢNG CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................1 DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................2 DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................3 MỞ ĐẦU .......................................................................................... CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................8 1.1 Đặc điểm cơ bản của hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân .............8 1.1.1. Tính chất hóa lý ..................................................................8 1.1.2 Tính độc của PAH và ảnh hƣởng của nó tới môi trƣờng sống .............................................................................................10 1.2. Nguồn gốc phát sinh PAH ..........................................................13 1.2.1. Hiện trạng ô nhiễm PAH trên thế giới và ở Việt Nam ...........13 1.2.2. Nguồn gốc phát sinh ............................................................14 1.3. Các biện pháp xử lý tẩy độc PAH ................................................15 1.3.1 Phƣơng pháp hóa lý ..............................................................16 1.3.2. Phƣơng pháp phân hủy sinh học ...........................................16 1.4. Phân hủy sinh học các PAH bởi vi sinh vật ..................................19 1.4.1. Vi sinh vật phân hủy PAH ...................................................19 1.4.2. Cơ chế phân hủy PAH bởi VSV ...........................................21 1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình phân hủy các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân .................................................................25 1.6. Các phƣơng pháp phân loại vi sinh vật ........................................29 1.6.1. Phƣơng pháp phân loại truyền thống ...................................29 1.6.2. Phƣơng pháp phân loại bằng sinh học phân tử .....................30 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................33 2.1. Nguyên liệu và hóa chất .............................................................. 33 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.1.1. Nguyên liệu.........................................................................33 2.1.2. Hóa chất .............................................................................33 2.2. Môi trƣờng nuôi cấy....................................................................33 2.3. Máy móc và thiết bị nghiên cứu ...................................................34 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................34 2.4.1. Phân lập vi sinh vật trên mẫu nƣớc nhiễm dầu ......................34 2.4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn .............................................................................35 2.4.3. Đánh giá khả năng sử dụng PAH của vi khuẩn......................36 2.4.4. Xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA và catechol 2,3-dioxygenase............................................................................36 2.4.4.1. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn theo phƣơng pháp của Sambrook, Russell ........................................36 2.4.4.2. Nhân đoạn gen bằng phƣơng pháp PCR ........................37 2.4.4.3. Quy trình biến nạp và chọn dòng ..................................38 2.4.4.4. Phƣơng pháp xác định trình tự gen bằng máy tự động ........................................................................................40 2.4.4.5. Phƣơng pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại ...........41 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................42 3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trƣờng chứa PAH .................................................................42 3.2. Đặc điểm hình thái và tế bào của chủng vi khuẩn BQN31 .............44 3.3. Khả năng sử dụng các loại PAH của chủng vi khuẩn BQN31 .............................................................................................45 3.4. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31 .............................................................................................49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3.4.1. Tách chiết DNA tổng số và nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR .......................................................49 3.4.2. Tách dòng gen mã hóa 16S rRNA từ chủng BQN31 ............50 3.4.3 Tách DNA plasmid và kiểm tra các dòng khuẩn lạc thích hợp ......................................................................................52 3.4.4. Trình tự gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn BQN31 .............54 3.5. Nhân đoạn gen mã hóa catechol 2,3 dioxygenase từ chủng BQN31 .............................................................................................57 IV. KẾT LUẬN ........................................................................................62 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................63 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 BẢNG CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair (cặp bazơ) USEPA United State Environmental Protection Agency (Cục bảo vệ môi trường Hoa Kỳ) LB Luria-Bertani PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) POP Persistent Organic Pollutant DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid VSV Vi sinh vật X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside μl Microlit μm Micromet PAH Polycyclic aromatic hydrocacbon (hydrocarbon thơm đa nhân) ppm đơn vị một phần triệu (mg/l) Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Tính chất vật lý của một số loại PAH ......................................... 9 Bảng 1.2: Một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH ................. 20 Bảng 1.3: Một số phương pháp phân loại vi sinh vật ................................. 30 Bảng 3.1: Số lượng vi khuẩn phân lập được trên môi trường khoáng có bổ sung các hợp chất PAH .................................................................... 42 Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn ............................... 44 Bảng 3.3: phổ UV đo khả năng phân hủy các PAH của chủng BQN31..................................................................................................... 46 Bảng 3.4: Khả năng sử dụng các PAH khác nhau của chủng BQN31 .......... 46 Bảng 3.5: Độ tương đồng của chủng BQN31 so với một số đại diện đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế .............................................. 56 Bảng 3.6: Độ tương đồng của đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3 dioxygenase của chủng BQN31 so với một số đại diện đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế ................................................................... 60 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của một số hydrocacbon thơm đa nhân (PAH) ...................................................................................................... 8 Hình 1.2: Các con đường phân hủy PAH ở vi sinh vật ............................... 21 Hình 1.3: Ba con đường phân hủy hiếu khí PAH chính của vi khuẩn và nấm .................................................................................................... 22 Hình 3.1: Khả năng phân hủy phenanthrene của 4 chủng BQN30, BQN31, BQN32, BQN33.......................................................................... 43 Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn BQN31............................... 45 Hình 3.3: Hình thái tế bào vi khuẩn BQN31 .............................................. 45 Hình 3.4: DNA tổng số của chủng BQN31 ............................................... 50 Hình 3.5: Sản phẩm PCR nhân đoạn gene mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31........................................................................................... 50 Hình 3.6: Kết quả biến nạp chủng BQN31 ................................................ 51 Hình 3.7: Sản phẩm điện di kiểm tra DNA plasmid của các dòng được lựa chọn ........................................................................................... 52 Hình 3.8: Sản phẩm cắt DNA plasmid của dòng số 13 ............................... 53 Hình 3.9: Sản phẩm làm sạch DNA plasmid dòng số 13 của chủng vi khuẩn BQN31....................................................................................... 53 Hình 3.10: Trình tự đầy đủ đoạn gen 16S rRNA của chủng BQN31 ........... 54 Hình 3.11: Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự các đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31 và một số chủng vi khuẩn đại diện. Thước đo thể hiện hai nucleotide khác nhau trên 1.000 nucleotide so sánh..................................................................................... 55 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 Hình 3.12: Sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenaza từ DNA tổng số chủng BQN31 và cặp mồi C23OF và C23OR ................................................................................................ 58 Hình 3.13: Trình tự nucleotide và trình tự axít amin suy diễn đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenaza của chủng Sphingomonas sp. BQN31 ........................................................................ 58 Hình 3.14: Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự các đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenaza của chủng Sphingomonas sp. BQN31 và một số chủng vi khuẩn đại diện. Thước đo thể hiện một nucleotide khác nhau trên 100 nucleotide so sánh ................................ 59 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 MỞ ĐẦU Trong thời đại ngày nay, cùng với sự phát triển nhanh chóng của xã hội, nhu cầu về nguyên liệu và nhiên liệu của con người ngày càng tăng, đã kéo theo sự mở rộng các ngành công nghiệp khai thác, chế biến như : công nghiệp dầu mỏ, khai thác chế biến than, công nghiệp sản xuất sơn, sản xuất các hóa chất tẩy rửa... Quảng Ninh là một tỉnh nằm trong vùng kinh tế trọng điểm Bắc Bộ, có tốc độ tăng trưởng kinh tế cao so với bình quân chung của cả nước. Trong những năm gần đây, các ngành công nghiệp và dịch vụ chiếm một tỷ trọng lớn, khoảng trên 80% GDP của tỉnh. Các ngành công nghiệp khai thác và chế biến than, xi măng, đóng tàu, nhiệt điện, sản xuất vật liệu xây dựng đang có tốc độ phát triển nhanh. Quảng Ninh là một trong những điểm trung chuyển xăng dầu lớn nhất cả nước. Hoạt động vận tải đường bộ, đường thủy; các hoạt động du lịch, vận tải khách du lịch….diễn ra hết sức sôi động. Các hoạt động trên đã tạo ra một bộ mặt kinh tế rất đa dạng của Quảng Ninh. Tuy nhiên, các hoạt động đó cũng đã gây ra những hậu quả không nhỏ về môi trường, đặc biệt là các hoạt động vận chuyển và khai thác than, chế biến và sử dụng vật liệu nổ, các hoạt động vận tải, trung chuyển xăng dầu… ở Quảng Ninh. PAH là một nhóm các hợp chất hữu cơ có hai hay nhiều vòng thơm. Chúng có mặt khắp nơi trong môi trường (đất, không khí, các nguồn nước và các lớp trầm tích) và là một trong các thành phần có trong các sản phẩm của dầu mỏ [16]. Một số PAH có khả năng gây ung thư tiềm tàng, gây đột biến và là chất gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Tổ chức bảo vệ môi trường Mỹ (USEPA) đã xếp PAH vào nhóm những chất ô nhiễm điển hình và tiến hành kiểm soát sự có mặt của PAH trong các hệ sinh thái dưới nước cũng như trên cạn [16], [50]. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 Trong nước thải tại nhiều cơ sở sản xuất công nghiệp ở Quảng Ninh, ngoài một số hợp chất hữu cơ, vô cơ (NH4NO3) thì sự có mặt của dầu và một số các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân (PAH) đang là vấn đề lớn đặt ra đòi hỏi các cấp chính quyền địa phương cần phải quan tâm xử lý triệt để. Hiện nay để khắc phục hậu quả này có nhiều phương pháp có thể áp dụng như sử dụng hóa chất, hấp phụ, lắng đọng… Tuy nhiên các phương pháp này đòi hỏi chi phí lớn và vẫn có thể gây ra ô nhiễm thứ cấp. Qua thử nghiệm thực tế, phương pháp xử lý bằng công nghệ sinh học đã và đang khẳng định tính ưu việt của nó. Đó là giá thành rẻ, có thể tiến hành thuận lợi trong điều kiện tự nhiên, độ an toàn rất cao và thân thiện với môi trường. Do vậy, trên thế giới và ở Việt Nam đã có nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu về điều tra về phân bố, cấu trúc các tập đoàn vi sinh vật, khả năng phân hủy PAH của các chủng đơn cũng như các tập đoàn vi sinh vật. Các gen tham gia quá trình phân hủy sinh học PAH cũng được quan trắc trong quá trình xử lý, của các tập đoàn VSV bản địa và trong các nghiên cứu phân hủy PAH ở điều kiện phòng thí nghiệm. Catechol là một trong các sản phẩm trung gian của quá trình phân hủy sinh học các hợp chất vòng thơm, do vậy các gen mã hóa các enzym chuyển hóa catechol được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Chính vì những yêu cầu thực tiễn trên, chúng tôi đã lựa chọn nghiên cứu và thực hiện đề tài “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học hydrocarbon thơm của một vài chủng vi khuẩn được phân lập từ nước ô nhiễm dầu tại Quảng Ninh”. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 Mục tiêu nghiên cứu: Phân lập và tuyển chọn ra được một số chủng vi khuẩn có khả năng phân huỷ hợp chất hydrocacbon thơm. Nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm: 1. Phân lập và tuyển chọn một số loại vi khuẩn có khả năng phân hủy PAH. 2. Nghiên cứu, đánh giá khả năng phân hủy sinh học PAH của một số chủng vi khuẩn đã được phân lập. 3. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái tế bào của một đại diện vi khuẩn có khả năng phân hủy PAH. 4. Phân loại định tên đại diện vi khuẩn có khả năng phân hủy PAH dựa trên việc xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm cơ bản của hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân 1.1.1 Tính chất hóa lý Các PAH có mặt khắp nơi trong môi trường, những hợp chất này có 2- 6 vòng benzen kết hợp với nhau. Trọng lượng phân tử vào khoảng 128 – 278 g/mol (Hình 1.1). PAH là những chất kỵ nước. Khả năng gây ô nhiễm môi trường tùy thuộc khả năng hòa tan của chúng trong môi trường nước [16], [48]. Đặc điểm về khả năng hòa tan và áp suất hơi của PAH là nhân tố chính ảnh hưởng đến khả năng phân tán của chúng trong khí quyển, thủy quyển và sinh quyển. Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của một số hydrocarbon thơm đa nhân (PAH) Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 Số lượng vòng benzen trong cấu trúc hóa học của các PAH quyết định khả năng hòa tan của các PAH trong nước. PAH giảm khả năng hòa tan trong nước hay tăng tính kỵ nước khi số lượng vòng benzen tăng [54]. Khả năng hòa tan của các PAH rất biến động, từ những chất khó hòa tan nhất là benzo(b)perylen có chỉ số hòa tan là 0,003 mg/l cho đến chất dễ hòa tan nhất là naphthalen có chỉ số hòa tan tới 31 mg/l. Nếu khả năng hòa tan trong nước của PAH thấp, hay hệ số hấp phụ cao sẽ dẫn đến các PAH có xu hướng bị hấp phụ trong cặn bùn, đất đá và trầm tích, do đó ảnh hưởng rất nhiều tới khả năng chúng bị phân hủy sinh học bởi vi sinh vật [10]. Ngược lại, khả năng hòa tan trong nước của PAH cao thì khả năng bị phân hủy bởi vi sinh vật cũng cao. Điều đó cho thấy khả năng hòa tan trong nước của các PAH có ảnh hưởng đặc biệt quan trọng trong quá trình phân hủy sinh học PAH. Bảng 1.1: Tính chất vật lý của một số loại PAH [31] * Kp d = [octanol]/ [nước] Trong các tính chất vật lý của PAH, hệ số Kp d phản ánh khả năng hấp phụ lên bề mặt vật liệu rắn. Nếu hệ số Kp d cao, các PAH có xu hướng tăng Loại PAH Số vòng thơm Nhiệt độ nóng chảy (oC) Nhiệt độ sôi (oC) Độ tan trong nước (mg/l) LogKpd Áp suất hơi ở 20oC (torr) Phenanthrene 3 101 340 1,29 4,45 6,8x10-4 Anthracene 3 216 340 0,07 4,46 2,0x10-4 Fluoranthene 4 111 250 0,26 5,33 6,0x10-6 Benzo[a]anthracene 4 158 400 0,24 5,61 5,0x10-9 Pyrene 4 149 360 0,14 5,32 6,8x10-7 Chrysene 4 255 488 0,02 5,61 6,3x10-7 Benzo[a]pyrene (BaP) 5 179 496 0,0038 6,04 5,0x10-7 Dibenzo[a]anthracene 5 262 524 0,0005 5,97 1,0x10-10 Benzo[g,h,i]perylen 6 222 -- 0,0003 7,23 1,0x10-10 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 khả năng hấp phụ lên bề mặt các vật liệu rắn, đồng nghĩa với sự giảm khả năng phân hủy sinh học. Áp suất hơi và nhiệt độ sôi của các PAH cũng có vai trò quan trọng trong quá trình xử lý loại bỏ PAH khỏi các vùng bị ô nhiễm do nó ảnh hưởng đến khả năng hóa hơi của mỗi PAH. Khi áp suất hơi tăng, khả năng bay hơi của các PAH cũng tăng, mà sự bay hơi cũng là một con đường để loại bỏ PAH khỏi nguồn ô nhiễm. Khả năng bay hơi của các PAH cũng phụ thuộc vào kích thước và khối lượng phân tử. Naphthalene có kích thước nhỏ nhất nên có khả năng bay hơi đến 89%, trong khi đó benzo[a]pyrene (BaP) là hợp chất có kích thước lớn, chỉ có khả năng bay hơi 1%. Phenanthrene là đồng phân của anthracene có độ bay hơ