Luận văn Phân lập và thiết kế vector ức chế biểu hiện gen mã hóa enzyme invertase (-Fructofuranosidase) nhằm tăng trữ lượng sucrose ở cây mía

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------- LƢU THỊ CƢ PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE (-FRUCTOFURANOSIDASE) NHẰM TĂNG TRỮ LƢỢNG SUCROSE Ở CÂY MÍA LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Thái Nguyên – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------- LƢU THỊ CƢ PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE (-FRUCTOFURANOSIDASE) NHẰM TĂNG TRỮ LƢỢNG SUCROSE Ở CÂY MÍA LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ QUỲNH LIÊN Thái Nguyên – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa từng có ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Tác giả Lưu Thị Cư Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Quỳnh Liên, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Lê Trần Bình, TS. Chu Hoàng Hà, KS. Đỗ Tiến Phát Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, là những ngƣời đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành luận văn. Trong thời gian thực tập nghiên cứu tôi cũng đã nhận đƣợc sự hỗ trợ nhiệt tình và những ý kiến đóng góp bổ ích của các cô chú, các anh chị, các bạn trong Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong khoa Sinh- KTNN và khoa Sau đại học, trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên đã hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi cũng vô cùng cảm ơn những tình cảm tốt đẹp của những ngƣời thân trong gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã luôn dành cho tôi, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu. Thái Nguyên, ngày 25 tháng 09 năm 2009 Học viên Lưu Thị Cư Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3 1.1. VAI TRÒ VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA CÂY MÍA ................................ 3 1.1.1. Sơ lƣợc về cây mía ............................................................................................. 3 1.1.2. Tình hình sản xuất mía ở Việt Nam ................................................................ 4 1.2. SINH TỔNG HỢP SUCROSE ........................................................................... 5 1.3. VẬN CHUYỂN SUCROSE TRONG TẾ BÀO .............................................. 8 1.5. ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP RNAi (RNA INTERFERENCE) .................................................................................... 10 1.5.1. Nguồn gốc RNAi .............................................................................................. 10 1.5.2. Cơ chế gây bất hoạt gen .................................................................................. 10 1.6. KỸ THUẬT GATEWAY ® ............................................................................... 12 1.7. NGHIÊN CỨU VỀ TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN Ở CÂY MÍA ........... 14 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 16 2.1. NGUYÊN LIỆU................................................................................................... 16 2.1.1. Nguyên liệu thực vật ........................................................................................ 16 2.1.2. Các chủng plasmid và enzyme ....................................................................... 16 2.1.3. Hóa chất khác .................................................................................................... 16 2.1.3. Các thiết bị máy móc ....................................................................................... 17 2.2. PHƢƠNG PHÁP ................................................................................................. 17 2.2.1. Thiết kế mồi....................................................................................................... 17 2.2.2. Tách RNA tổng số ............................................................................................ 18 2.2.3. RT-PCR .............................................................................................................. 18 2.2.4. Tách dòng và xác định trình tự gen ............................................................... 19 2.2.5. Thiết kế vector tái tổ hợp INV-RNAi ........................................................... 20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.2.6. Tái sinh mía thông qua mô sẹo ...................................................................... 21 2.2.7. Thử nghiệm chuyển gen gus-intron vào cây mía ....................................... 22 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: ...................................................................................... 2 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 24 3.1. THIẾT KẾ MỒI ................................................................................................... 24 3.2. TÁCH RNA TỔNG SỐ ...................................................................................... 25 3.3. NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE ............ 27 3.4. TÁCH DÒNG GEN VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN ............................. 28 3.4.1. Tạo plasmid tái tổ hợp INV-pENTR ............................................................ 28 3.4.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp INV_pENTR vào tế bào khả biến E.coli TOP 10 ............................................................................................ 28 3.4.3. Chọn lọc plasmide tái tổ hợp INV_pENTR bằng PCR ............................. 29 3.4.4. Kết quả xác định trình tự nucleotit ................................................................ 31 3.5. THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP INV-RNAi ........................................... 31 3.5.1. Tạo vector tái tổ hợp INV_RNAi bằng kỹ thuật Gateway ....................... 31 3.5.2. Biến nạp vector INV_RNAi vào tế bào khả biến E.coli ........................... 32 3.6. BIẾN NẠP VECTOR CHUYỂN GEN INV_RNAi VÀO CHỦNG VI KHUẨN A.TUMEFACIENS CV58C1. .......................................... 34 3.7. TÁI SINH VÀ BƢỚC ĐẦU BIỂU HIỆN GEN GUS Ở MÍA ................... 35 3.7.1. Quy trình tái sinh mía thông qua mô sẹo ..................................................... 35 3.7.3. Chọn lọc mô sẹo và tái sinh cây chuyển gen ............................................... 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT AS Acetosyringone A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-Benzyl Amino Purine (Benzyladeninpurin) bp Cặp base cDNA Complementary DNA = DNA bổ sung đƣợc tổng hợp bằng khuôn mRNA cs Cộng sự DEPC Diethyl pyrocarbonat DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP deoxynucleosit triphotphat (deoxynucleoside triphosphate) EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EtBr đEtBrEthiium bromide E.coli Escherichia coli gus β-glucuronidase IBA Indole-3-Butyric Acid kb kilo base LB Luria and Bertani MS Môi trƣờng nuôi cấy theo Murashige và Skoog NAA Naphthalene Acetic Acid OD Giá trị mật độ quang (optical density) PCR Polymerase Chaine Reaction = Phản ứng chuỗi Polymerase RNA Ribonucleic Acid RNase Ribonuclease RT-PCR Reverse Transcriptase-PCR SDS Sodium dodecylsulfat TAE Tris-acetate-EDTA Taq Thermus aquaticus DNA (polymerase) 2,4D 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 2.1. Các plasmid sử dụng trong thí nghiệm ................................................. 16 Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR một bƣớc................................... 18 Bảng 2.3. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR ............................................................ 19 Bảng 2.4. Các môi trƣờng tái sinh cây mía ............................................................. 21 Bảng 3.1. Trình tự và các thông số cần thiết của cặp mồi 3’INV và 5’INV .......................................................................................................... 25 Bảng 3.2. Mã số các trình tự đoạn gen Invertase ở mía trên ngân hàng gen NCBI ................................................................................................... 25 Bảng 3.3. Khả năng tạo mô sẹo và tái sinh ở giống mía ROC10 in vitro trên các môi trƣờng thử nghiệm M1 - M4. .......................................... 36 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1: Chu trình sinh tổng hợp sucrose với sự tham gia của các enzyme chính ............................................................................................... 6 Hình 1.2. Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi................................................................ 11 Hình 1.3. Sơ đồ mô tả kỹ thuật Gateway ................................................................ 13 Hình 3.1. Kết quả điện di RNA tổng số tách từ lá và bẹ thân non của 2 giống mía ROC1 và ROC10 trên gel agarose 1% ............................... 26 Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 0,8% ................ 27 Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid với cặp mồi M13 (For/Rev) nhằm kiểm tra sự có mặt của đoạn Invertase trong vector pENTR/D ....................................................................................... 30 Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự đoạn gen Invertase phân lập đƣợc với trình tự Invertase trong ngân hàng gen có mã số AY302083 .................................................................................................. 31 Hình 3.5. Mô hình cấu trúc chuyển gen INV_RNAi ........................................... 32 Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid INV_RNAi tổ hợp với HindIII và XbaI ......................................................................................... 34 Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR plasmid INV-RNAi trong A.tumefaciens với cặp mồi đặc hiệu 5’INV và 3’INV ....................... 35 Hình 3.8. Quy trình tái sinh mía ROC10 in vitro từ mô sẹo ................................ 37 Hình 3.9. Biến nạp gen gus-intron vào cây mía ROC10 in vitro thông qua trung gian A.tumefaciens ................................................................. 39 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU Đƣờng là một nhu cầu cần thiết trong đời sống con ngƣời. Theo thống kê, nhu cầu tiêu thụ đƣờng trên thế giới trung bình tính theo đầu ngƣời là 35 kg/1 ngƣời/1 năm. Tại Việt Nam, năm 1994 là 8 kg/1 ngƣời/1 năm, hiện nay là 15 kg/1 ngƣời/1 năm và dự kiến nhu cầu về đƣờng còn tiếp tục tăng nữa. Tại các nƣớc nhiệt đới và cận nhiệt đới nhƣ Việt Nam, 75% sản lƣợng đƣờng đƣợc sản xuất từ cây mía. Mía là một trong số ít loài thực vật tích trữ chủ yếu đƣờng sucrose (α-D-glucopyranosyl-1, 2-D-fructofuranose), nguồn nguyên liệu ban đầu để sản xuất đƣờng. Do đó, ở Việt Nam mía trở thành một cây công nghiệp trọng yếu và là cây xóa đói giảm nghèo của chính phủ. Tuy nhiên, các giống mía của Việt Nam có năng suất đƣờng chỉ đạt mức trung bình của thế giới. Việc nhập các giống mía cao sản của thế giới kết hợp với phƣơng pháp lai tạo truyền thống chƣa thực sự có hiệu quả trong việc tạo giống mía có hàm lƣợng đƣờng cao lại phù hợp với điều kiện thổ nhƣỡng khí hậu của nƣớc ta. Chọn tạo giống mía có hàm lƣợng đƣờng cao bằng công nghệ sinh học có tiềm năng giảm giá thành đƣờng mà không cần tăng diện tích trồng mía và thúc đẩy sự phát triển nền công nghiệp mía đƣờng tại Việt Nam. Sinh tổng hợp sucrose là một quá trình phức hợp, trong đó enzyme Invertase đƣợc xem nhƣ là một chiếc chìa khóa điều chỉnh sự tích lũy lƣợng sucrose trong cây mía. Nó có vai trò phân hủy sucrose trong tế bào. Vì vậy, muốn tăng trữ lƣợng sucrose trong cây mía thì phải ức chế đƣợc sự biểu hiện của gen mã hóa Invertase. Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi (RNA-interference) hiện nay đã trở thành một biện pháp công nghệ hữu hiệu có thể ức chế hoàn toàn biểu hiện của gen ở động vật, thực vật và cả vi sinh vật [31]. Ở thực vật, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 RNAi có thể đƣợc thực hiện bằng cách chuyển gen có cấu trúc biểu hiện sự phiên mã cao RNA sense, anti-sense hoặc RNA kẹp tóc bổ sung chính nó mà chứa trình tự tƣơng đồng với gen đích. Với mục tiêu nghiên cứu chọn tạo giống mía có hàm lƣợng đƣờng cao, chúng tôi chọn đề tài “Phân lập và thiết kế vector ức chế biểu hiện gen mã hóa enzyme Invertase (β-fructofuranosidase) nhằm tăng trữ lượng sucrose ở cây mía”. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU: Ức chế biểu hiện của Invertase dạng hòa tan nhằm tăng trữ lƣợng sucrose ở cây mía. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: 1. Phân lập đoạn gen mã hóa cho enzyme Invertase ở cây mía in vitro ROC1 2. Thiết kế đƣợc vector ức chế biểu hiện gen mã hóa Invertase (β- fructofuranosidase) ở cây mía. 3. Nghiên cứu hệ thống tái sinh ở cây mía phục vụ cho mục đích chuyển gen tiếp theo. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. VAI TRÕ VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA CÂY MÍA 1.1.1. Sơ lƣợc về cây mía Mía (Saccharum L.) thuộc chi mía (Saccharum), họ hòa thảo (Poaceae), bộ lúa (Poales), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae). Chúng là những cây có thân to, mập, chia đốt cao từ 2 - 6 m. Các loại thực vật trong chi này đa số là các loại cỏ sống lâu năm bao gồm khoảng 6 - 37 loài tùy theo hệ thống phân loại, sống chủ yếu ở khu vực nhiệt đới và ôn đới trên thế giới [2]. Cây mía chứa hàm lƣợng đƣờng rất cao chiếm khoảng 46% khối lƣợng khô, trong đó sucrose chiếm tới 80%. Chính vì thế, mía trở thành một trong những cây công nghiệp quan trọng của ngành công nghiệp sản xuất đƣờng. Ngoài ra, cây mía còn chứa các chất đạm (protein), chất bột (carbohydrate), chất béo (lipid), các chất khoáng và các vitamin… vì thế mía còn có tác dụng thanh nhiệt, giải khát, trợ giúp tiêu hóa, cung cấp năng lƣợng và các chất dinh dƣỡng cần thiết cho cơ thể. Theo Đông y, mía là "vị thuốc" dùng để chữa một số bệnh nhƣ ho khan, đại tiện táo, tiểu tiện bất lợi, đau dạ dày, an thai… Mía còn là loại cây có tác dụng bảo vệ đất rất tốt, đặc biệt là chống xói mòn đất cho các vùng đồi trung du. Hơn nữa, mía là cây rễ chùm và phát triển mạnh trong tầng đất từ 0 - 60 cm (1 ha mía tốt có thể cho 13 - 15 tấn rễ sau thu hoạch), đây là nguồn chất hữu cơ quý làm tăng độ phì của đất. Phần bã mía chứa nhiều cellulose có thể dùng làm nguyên liệu đốt lò, hoặc làm bột giấy, bìa các tông, ép thành ván dùng trong kiến trúc... Sản phẩm cặn bã còn lại sau khi chế biến đƣờng (bùn lọc) có thể sử dụng để sản xuất nhựa, xêrin, làm sơn, xi đánh giầy... phế phẩm còn lại dùng làm phân bón rất tốt. Trong tƣơng lai bã mía còn có thể nguồn nguyên liệu làm bột giấy, làm sợi thay thế Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 các loại cây rừng bị giảm đi. Khi mà nguồn nhiên liệu lỏng ngày càng cạn kiệt nhƣ hiện nay, một số nƣớc phát triển trên thế giới nhƣ Mỹ, Brazil, Ấn Độ… đã bắt đầu sử dụng nhiên liệu sinh học từ cây mía để bổ sung và thay thế. Nhƣ vậy, cây mía có vai trò rất quan trọng trong đời sống kinh tế của con ngƣời. 1.1.2. Tình hình sản xuất mía ở Việt Nam Hiện nay có khoảng 200 quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới trồng và sản xuất mía đƣờng, sản lƣợng trung bình đạt khoảng 13.246 triệu tấn (gấp 6 lần so với củ cải đƣờng). Ở Việt Nam, mía là cây trồng chủ đạo trong ngành công nghiệp đƣờng của cả nƣớc. Dự kiến niên vụ 2009-2010 diện tích mía nguyên liệu cả nƣớc sẽ vào khoảng 290.000 ha, tăng 19.400 ha so với vụ trƣớc, trong đó diện tích vùng mía nguyên liệu tập trung của các nhà máy là 221.816 ha với năng suất mía bình quân đạt 55 tấn/ha và sản lƣợng đạt 16 triệu tấn. Cây mía góp phần xóa đói giảm nghèo ở vùng trung du, miền núi ở nhiều tỉnh nƣớc ta nhƣ: Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Phú Yên, Bình Định, Quảng Ngãi [3]... Nhà nƣớc đã hỗ trợ một phần đầu tƣ phát triển cơ sở hạ tầng giao thông, thủy lợi cho vùng trồng mía tập trung, nghiên cứu chuyển giao khoa học kỹ thuật và công nghệ nhằm nâng cao năng suất, chất lƣợng, hiệu quả sản xuất mía đƣờng [1]. Quá trình đô thị hóa, công nghiệp hóa ngày một gia tăng cùng với sự biến đổi môi trƣờng khí hậu nên diện tích đất trồng trọt có xu hƣớng ngày một thu hẹp. Hơn nữa, ở nƣớc ta hiện nay có tới trên 60% các giống mía là những giống cũ nhƣ: ROC1, ROC10, F156, F127… hoặc các dạng lai ghép nội chi phức tạp. Các giống này có đặc điểm dễ canh tác, thích nghi rộng với nhiều vùng sinh thái của Việt Nam, nhƣng trữ lƣợng đƣờng rất thấp. Còn lại các giống mía nhập nội tuy có trữ lƣợng đƣờng cao song không phù hợp với khí hậu Việt Nam nên năng suất thấp. Chính vì thế, Quyết định số 26/2007/QĐ- Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 TTg của Phó thủ tƣớng Nguyễn Sinh Hùng “Quy hoạch phát triển mía đƣờng đến năm 2010 và định hƣớng đến năm 2020” đƣợc phê duyệt đã đƣa quan điểm rõ ràng là: đồng thời với việc nhập khẩu giống mía có năng suất, trữ đƣờng cao đƣợc đánh giá tốt phù hợp với Việt Nam thì phải xây dựng hệ thống viện nghiên cứu và các trung tâm giống mía đủ điều kiện trang thiết bị và năng lực cán bộ để chủ động sản xuất giống tốt, có năng suất, trữ lƣợng đƣờng cao của Việt Nam, đáp ứng yêu cầu sản xuất [1]. 1.2. SINH TỔNG HỢP SUCROSE Trong lục lạp của mía có enzyme photphoenolpyruvat-cacboxilase hoạt động rất mạnh. Sản phẩm đầu tiên của quang hợp ở mía là các axit oxaloaxetic, malic, aspartic đều gồm có bốn nguyên tử cacbon trong phân tử, do đó mía đƣợc gọi là thực vật C4 [5]. Chu trình C4 (hay cơ chế Hatch-Slack) là cơ chế có sự chuyên hoá trong việc thực hiện chức năng quang hợp của cây C4: một loại lục lạp chuyên trách cố định CO2, còn một loại lục lạp chuyên khử CO2 thành các chất hữu cơ cho cây. Vì vậy mà hoạt động quang hợp của cây C4 có hiệu quả hơn các nhóm thực vật khác và thƣờng cho năng suất sinh học rất cao. Sucrose là một disaccharide của glucose (α-D-glucopyranoside) và fructose (β-D-fructofuranosyl), có công thức phân tử C12H22O11. Đây là sản phẩm chính của quá trình quang hợp, có vai trò bổ sung năng lƣợng cho quá trình sinh trƣởng phát triển của thực vật cũng nhƣ các sinh vật sống khác. Trong cơ thể động vật, sucrose là nguyên liệu tổng hợp glucogen, khi thừa sẽ chuyển sang dạng mỡ dự trữ. Sucrose tích lũy phần lớn ở các mô của thực vật, giúp cho thực vật có khả năng thích nghi tốt hơn với các điều kiện bất lợi của môi trƣờng nhƣ: hạn, lạnh, mặn và cƣờng độ ánh sáng mạnh... [7, 12, 17, 23, 26, 30]. Nó đƣợc tích trữ chủ yếu ở cây mía, củ cải đƣờng và có ở Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 trong nhiều loại cây khác nhƣ dứa, chuối, mơ, mận, dƣa hấu, táo, cà rốt… đây là nguồn nguyên liệu tự nhiên, rất dễ trồng với số lƣợng lớn và giá rẻ. Sucrose rất dễ hòa tan trong nƣớc, khi bị thủy phân tạo thành glucose và fructose. Sinh tổng h