Luận văn Phân lập vi khuẩn bacillus subtilis từ đất, khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng phân lập đƣợc

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TỪ ĐẤT, KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SẢN SINH AFLATOXIN CỦA CÁC CHỦNG PHÂN LẬP ĐƢỢC Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: PHẠM HOÀNG THÁI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TỪ ĐẤT, KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SẢN SINH AFLATOXIN CỦA CÁC CHỦNG PHÂN LẬP ĐƢỢC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI PHẠM HOÀNG THÁI Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 - 2007 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 iii LỜI CẢM TẠ Mãi khắc ghi công ơn sinh thành, nuôi nấng, dạy dỗ của ba, má và những người thân trong gia đình đã cho con có được ngày hôm nay. Chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng toàn thể quý thầy cô đã tận tình dạy bảo và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian học tập tại trường. Chân thành biết ơn sâu sắc đến các quý thầy cô Ts. Nguyễn Ngọc Hải Ts. Lê Anh Phụng Cô Nguyễn Thị Kim Loan đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Chân thành cảm ơn toàn thể bạn bè đã động viên, chia sẽ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài. iv TÓM TẮT LUẬN VĂN Qua thời gian thực hiện đề tài “Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất, khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng phân lập đƣợc.” từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 tại Phòng thực hành Vi Sinh khoa Chăn Nuôi-Thú Y, chúng tôi có những kết luận sau: - Có thể phân lập được vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất với tỷ lệ 8,16 %. - Đánh giá sơ bộ khả năng ức chế aflatoxin của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được từ đất trên môi truờng thạch nước cốt dừa: sau 7 ngày nuôi cấy chung Bacillus subtilis và Aspergillus flavus trên môi trường thạch nước cốt dừa, quan sát bên ngoài và dưới ánh đèn tia cực tím (UV) cho thấy một số chủng có khả năng ức chế sinh trưởng và sản sinh aflatoxin của nấm mốc Aspergillus flavus. - Khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được từ đất: môi trường bắp sau 7 ngày nuôi cấy bào tử nấm mốc và bào tử vi khuẩn , ghi nhận một số chủng có khả năng làm giảm aflatoxin trên môi trường bắp so với mẫu đối chứng chỉ có bào tử Aspergillus flavus không có bào tử Bacillus subtilis. - Khảo sát tỷ lệ nuôi cấy giữa bào tử nấm mốc/bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis ảnh hưởng đến khả năng sản sinh aflatoxin trên môi trường bắp phối trộn tỷ lệ bào tử nấm mốc/bào tử vi khuẩn là 1/103, 1/104 và 1/105. Sau 7 ngày nuôi cấy cho thấy khi tỷ lệ bào tử vi khuẩn tăng lên thì tăng khả năng làm giảm aflatoxin. - Nguyên liệu bắp nhiễm aflatoxin có xử lý với vi khuẩn Bacillus subtilis gây chết vịt ít hơn nguyên liệu bắp nhiễm aflatoxin nhưng không xử lý với vi khuẩn. v SUMMARY The thesis: “ Isolation of Bacillus subtilis in soil and survey their ability in inhibition of aflatoxin production by Aspergillus flavus on maize.” The thesis Bacillus subtilis in inhibition of aflatoxin production by Aspergillus flavus on maize and in protection of duck frome aflatoxin infection was carried out in Microbiology and Infections Diseases Department of Freulty of Animal sciences and Veterinary, Nong Lam University, Ho Chi Minh cty frome 03/2007 to 08/2007. The results showed: - Bacillus subtilis could inhibite the aflatoxin production of Aspergillus flavus on maize in times. - Bacillus subtilis treatment could reduce the neortility rate, health affect of the ducks fed with 100 ppb aflatoxin containated maize. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang bìa 1…………………………………………………………………........….......i Trang bìa 2………………………………………………………………........……......ii LỜI CẢM TẠ………………………………………………………….......……….....iii MỤC LỤC…………………………………………………………….……........….....iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT…………………………………………...........ix DANH MỤC CÁC BẢNG…………………………………………………….......…..x DANH MỤC CÁC HÌNH…………………………………………………….......…..xi DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ……………………………………………………..........xii TÓM TẮT LUẬN VĂN….…………………………………………….…….......….xiii 1. MỞ ĐẦU………………………………………………………………….…........…1 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ….....………………………………………………...…..........……1 1.2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI….........…………………………………………...........……2 1.3. YÊU CẦU ĐỀ TÀI………….........………………………………..…..........….…2 2. TỔNG QUAN…………………………..............………………………..….........…3 2.1. KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS…….......................…….3 2.1.1. Lịch sử phát hiện………………………………………………..........................3 2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis....................3 2.1.2.1. Đặc điểm phân loại……………………………............….……………......….3 2.1.2.2. Sự phân bố…………………………………………………..................……...4 2.1.3. Đặc điểm hình thái………………….…………………………….............…….4 2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy………………………………………………........….....…...4 vii 2.1.5. Đặc điểm sinh hóa………………………………………......……......................5 2.1.6. Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên………………………......…...…..................6 2.1.7. Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis………………………….....……...................7 2.1.7.1. Cấu tạo của bào tử…………………………………………..........….......…..7 2.1.7.2. Đặc điểm và tác dụng của bào tử………………………..........…….......…...8 2.1.8. Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với vi sinh vật gây bệnh.................9 2.1.9. Những nghiên cứu về tác dụng đố kháng Aspergillus của Bacillus subtilis...11 2.2. KHÁI QUÁT VỀ NẤM MỐC SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN……...…..........12 2.2.1. Khái niệm về nấm mốc……………………………………….............…….....12 2.2.2. Các loài nấm mốc sinh độc tố aflatoxin…………….......................................12 2.2.3. Độc tố aflatoxin…………………………………..............................................13 2.2.3.1. Các loại độc tố aflatoxin……………………….............................................13 2.2.3.2. Cơ chế gây bệnh của aflatoxin…………………….......................................14 2.2.3.3. Những tác hại do aflatoxin gây ra…………………….................................14 2.2.3.4. Các phƣơng pháp phân hủy aflatoxin………………………...………........15 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH..................................................19 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM................................................................................19 3.1.1. Thời gian ............................................................................................................19 3.1.2. Địa điểm..............................................................................................................19 3.2. ĐỐI TƢỢNG KHẢO SÁT...................................................................................19 3.3. THIẾT BỊ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM ................................................................19 3.4. MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY................................................................................20 3.4.1. Môi trƣờng tự nhiên ..........................................................................................20 3.4.2. Môi trƣờng tổng hợp.........................................................................................20 viii 3.5. NỘI DUNG...........................................................................................................20 3.6. PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU...............................................20 3.6.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất.......................................................20 3.6.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn........................................................20 3.6.1.2. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis .......................................21 3.6.2. Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập đƣợc..............................21 3.6.2.1. Quan sát hình thái vi khuẩn dƣới kính hiển vi.............................................21 3.6.2.2. Khảo sát các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn phân lập đƣợc…………....22 3.6.3. Thí nghiệm 1: Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của chủng nấm mốc Aspergillus flavus và đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc........................................................................22 3.6.3.1. Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của chủng nấm mốcAspergillusflavus..22 3.6.3.2. Thí nghiệm đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc………………………………..…………..…23 3.6.4.Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng làm giảm aflatoxin sản sinh trên môi trƣờng bắp của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập đƣợc……..…........23 3.6.4.1. Phƣơng pháp thu hoạch và xác định số lƣợng bào tử nấm mốc Aspergillus flavus………………………………………………………………...….. 23 3.6.4.1.1. Phƣơng pháp thu hoạch bào tử nấm mốc Aspergillus flavus...................23 3.6.4.1.2. Phƣơng pháp xác định số lƣợng bào tử nấm mốc Aspergillus flavus……………………………………………………………………..24 3.6.4.2. Phƣơng pháp thu hoạch và xác định số lƣợng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis.............................................................................................................24 3.6.4.2.1. Phƣơng pháp thu hoạch huyễn dịch bào tử vi khuẩnBacillus subtilis…24 ix 3.6.4.2.2. Phƣơng pháp xác định số lƣợng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis..........25 3.6.4.3. Bố trí thí nghiệm..............................................................................................26 3.6.4.3.1. Xử lý nguyên liệu bắp ban đầu trƣớc khi tiến hành thí nghiệm……….26 3.6.4.3.2. Nuôi cấy chung bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis và bào tử nấm Aspergillus flavus trên môi trƣờng nguyên liệu bắp..................................................26 3.6.5. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ bào tử nấm mốc /bào tử vi khuẩn đối với sự sản sinh aflatoxin............................................................................27 3.6.5.1. Phƣơng pháp thu hoạch và xác định số lƣợng bào tử nấm mốc Aspergillus flavus..........................................................................................................28 3.6.5.2. Phƣơng pháp thu hoạch và xác định số lƣợng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis.............................................................................................................28 3.6.5.3. Bố trí thí nghiệm..............................................................................................28 3.6.6. Thí nghiệm 4: Thử mức độ an toàn của ngƣyên liệu bắp đã nhiễm aflatoxin sau khi xử lý bằng vi khuẩn Bacillus subtilis (có khả năng ức chế aflatoxin) trên vịt..........................................................................................................29 3.7. PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MẪU……………………………………….....30 3.8. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU....................................................................30 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………………………..31 4.1. KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BACILLUS SUBTILIS………...31 4.1.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis……………..…..31 4.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis sau nhuộm Gram………………………………………………………………………….32 4.1.3. Khảo sát các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillussubtilis..32 x 4.2.THÍ NGHIỆM 1: KIỂM TRA KHẢ NĂNG SINH AFLATOXIN CỦA CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS FLAVUS VÀ ĐÁNH GIÁ SƠ BỘ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SẢN SINH AFLATOXIN CỦA CÁC CHỦNG BACILLUS SUBTILIS PHÂN LẬP ĐƢỢC...............................................................35 4.2.1. Kiểm tra khả năng sinh khả năng sinh aflatoxin của chủng nấm mốc Aspergillus flavus..........................................................................................................35 4.2.2. Thí nghiệm đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc……………………………………………..…..……35 4.3. THÍ NGHIỆM 2 : KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM GIẢM AFLATOXIN SẢN SINH TRÊN MÔI TRƢỜNG BẮP CỦA CÁC CHỦNG BACILLUS SUBTILIS PHÂN LẬP ĐƢỢC……………………………………...……………....38 4.4. THÍ NGHIỆM 3: KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA TỶ LỆ BÀO TỬ NẤM MỐC/BÀO TỬ VI KHUẨN ĐỐI VỚI SỰ SẢN SINH AFLATOXIN…….40 4.5. THÍ NGHIỆM 4: THỬ MỨC ĐỘ AN TOÀN CỦA NGHUYÊN LIỆU BẮP ĐÃ NHIỄM AFLATOXIN SAU KHI XỬ LÝ BẰNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS (CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ AFLATOXIN) TRÊN VỊT NUÔI............43 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ…………………………………………...……….…..48 5.1. KẾT LUẬN……………………………………………………………..………..48 5.2. ĐỀ NGHỊ…………………………………………………………………...…….48 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………...……49 xi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Nguyên chữ Nghĩa ADN Acid Deoxyribonucleic ARN Acid Ribonucleic CFU Colony Formation Unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc ppb part per billion Phần triệu (mg/kg) TLC Thin Layer Chromatography Phương pháp sắc ký lớp mỏng UV Ultra Violet Tia cực tím xii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Các phản ứng sinh hóa của Bacillus sutilis………………………............…. 6 Bảng 2.2. Sự khác nhau giữa bào tử và tế bào dinh dưỡng của Bacillus subtilis….........8 Bảng 2.3: Số lượng của Escherichia coli sau 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ và 36 giờ nuôi cấy (CFU/ml)........................................................................................................................10 Bảng 2.4: Khả năng ức chế aflatoxin B1 của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong thí nghiệm của Norio Kimura………………………….................................…..12 Bảng 2.5: Một số loài nấm mốc có khả năng sản sinh aflatoxin……………............…13 Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm nghiệm 2............................................................................27 Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm 3………………………………………………………….28 Bảng 4.1: Kết quả thử phản ứng sinh hóa của các chủng phân lập được……………...33 Bảng 4.2: So sánh khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của 8 chủng Bacillus subtilis...38 Bảng 4.3: Kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin của thí nghiệm 2…………………..39 Bảng 4.4: Kết quả thí nghiệm 3……………………………………...………………..41 Bảng 4.5: Kết quả thí nghiệm 4………………………………………...……………..43 Bảng 4.6: So sánh sự khác nhau về bệnh tích đại thể các mẫu gan vịt…………….....45 Bảng 4.7: Kết quả bệnh tích vi thể gan của vịt ở các lô thí nghiệm…………………...46 xiii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis……………………...…………...…..…….4 Hình 2.2: Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis……………………..………………….………..7 Hình 3.1: Nuôi cấy bào tử vi khuẩn và bào tử nấm mốc trên môi trường bắp………...28 Hình 4.1: Khuẩn lạc nghi ngờ Bacillus subtilis trên môi trường TSA…………....…...31 Hình 4.2: Hình dạng tế bào và bào tử của Bacillus subtilis sau khi nhuộm Gram…….32 Hình 4.3: Kết quả các phản ứng sinh hóa xác định Bacillus subtilis……..…………...34 Hình 4.4: Khuẩn lạc Aspergillus flavus sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch nước cốt dừa………………………………………………….…………....……35 Hình 4.5: Khuẩn lạc Aspergillus flavus tiếp xúc và chưa tiếp xúc với khuẩn lạc Bacillus subtilis trên môi trường thạch nước cốt dừa...............................................36 Hình 4.6: Sự ức chế phát triển của khuẩn lạc vi khuẩn đối với nấm mốc..…………....36 Hình 4.7: Vòng sáng aflatoxin không đều ở các phía của khuẩn lạc Aspergillus flavus...........................................................................................................37 Hình 4.8: So sánh các mẫu bắp………………………………….……………….…....42 Hình 4.9: Kết quả thí nghiệm lô 2 sau 4 ngày…………………….……………….......44 Hình 4.10: Sự khác nhau giữa 2 mẫu gan vịt………………………………….……....45 Hình 4.11: Bệnh tích vi thể các mẫu gan vịt ở các lô thí nghiệm……………….….....47 xiv DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 3.1: Các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis………………….….22 Sơ đồ 3.2: Phương pháp thu hoạch huyễn dịch bào tử Bacillus subtilis……………....25 Sơ đồ 3.3: Phương pháp xác định số lượng bào tử Bacillus subtilis………………………….26 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Mycotoxin hay độc tố nấm mốc là một trong những nhóm độc chất tự nhiên do các loài nấm mốc sản xuất ra trong quá trình phát triển trên các cơ chất, đặc biệt là lương thực, thực phẩm dành cho con người và gia súc. Người ta đã phát hiện khoảng 3000 loại mycotoxin nhưng độc tố quan trọng nhất cho đến hiện nay là aflatoxin do nấm mốc Aspergillus sản sinh. Aflatoxin không chỉ là độc tố gây nhiễm độc, gây rối loạn chức năng, gây suy giảm miễn dịch, thoái hóa gan thận mà còn gây chết gia súc, gia cầm trong trường hợp nhiễm độc hàm lượng lớn. Aflatoxin cũng được chứng minh là chất độc gây ung thư cho động vật thí nghiệm. Trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm thích hợp của nước ta, nếu không được bảo quản tốt thì các loại nguyên liệu cũng như thức ăn gia súc thành phẩm rất dễ bị nhiễm các loại nấm mốc sinh aflatoxin. Một khi điều đó xảy ra sẽ gây tổn thất rất lớn cho nhà chăn nuôi, ngành chăn nuôi nước nhà và nguy hiểm hơn là ảnh hưởng gián tiếp đến sức khỏe của người tiêu dùng sản phẩm chăn nuôi. Xuất phát từ tình hình thực tế đó, đã có nhiều nghiên cứu khoa học trong và ngoài nước được tiến hành nhằm giải quyết vấn đề này: như dùng nhiệt độ, ánh sáng, chất oxy hóa để làm mất hiệu lực của aflatoxin, .... Một trong những xu hướng hiện nay là áp dụng phương pháp vi sinh vật học. Các loài nấm mốc (Rhizopus stolonifer, 2 Rhizopus arrhizus), vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus pulimus), nấm men (Saccharomyces cerevisiae), xạ khuẩn đã được thử nghiệm về khả năng làm giảm aflatoxin thu được kết quả cũng rất khả quan. Được sự phân công của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, sự cho phép của phòng vi sinh Khoa Chăn Nuôi-Thú Y và dưới sự hướng dẫn của thầy Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành đề tài: “ Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất, khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng phân lập đƣợc.” 1.2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Phân lập, tìm ra chủng Bacillus subtilis có khả năng ức chế afltoxin để có thể ứng dụng trong bảo quản nguyên liệu, thức ăn gia súc thành phẩm. 1.3. YÊU CẦU ĐỀ TÀI - Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất. - Khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của chủng vi khuẩn phân lập được. - Khảo sát khả năng ức chế aflatoxin theo tỷ lệ nuôi cấy giữa bào tử của nấm mốc và bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis. - Thử nghiệm độ an toàn của nguyên liệu bắp nhiễm aflatoxin sau khi đã được xử lý với vi khuẩn Bacillus subtilis thu được trên vịt nuôi. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN 2.1. KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 2.1.1. Lịch sử phát hiện Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi.Việc ứng dụng điều trị phải đợi tới những năm 1949 - 1957 khi Henrry, Albot và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Từ đó “subtilis therapy “ có nghĩa là thuốc subtilin ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hóa. Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi, (trích dẫn bởi Lê Văn Hiệp, 2004). 2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.2.1. Đặc điểm phân loại Theo đặc điểm phân loại của Bergey (1994), vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc: Bộ: Eubacterriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis 4 2.1.2.2. Đặc điểm phân bố Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc của đường ruột, chúng được phân bố hầu hết trong tự nhiên như: cỏ khô, bụi, đất, nước, Phần lớn chúng tồn tại trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở sa mạc, đất hoang thì B