Luận văn Phân lập virus prrs trên môi trường tế bào marc-145 và xác định virus bằng kỹ thuật rt-pcr

iii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: VÕ NGỌC THƠ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 iv BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS. TRẦN THỊ BÍCH LIÊN VÕ NGỌC THƠ BSTY. HOÀNG THANH HẢI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 iii LỜI CẢM ƠN  Chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Các Thầy Cô và anh chị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. Thầy Hải, Cô Hà và các Thầy Cô Bộ Môn Vi Sinh-Truyền Nhiễm đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Anh Lê Hồng Phong ở Cục Thú Y vùng 6 đã rất tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khoá luận. Anh Uyên đã động viên và chia sẻ vấn đề của tôi. Các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 (nhất là các bạn trong phòng 14A, cƣ xá B) đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.  Đặc biệt tôi xin gởi lời biết ơn sâu sắc đến Cô Trần Thị Bích Liên và Anh Hoàng Thanh Hải đã rất tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận.  Con xin gởi lòng mang ơn đặc biệt nhất đến với cha mẹ, những ngƣời sinh thành, nuôi dƣỡng, dạy dỗ và luôn cho con một tinh thần thoải mái để luôn chú tâm vào chuyện học.  Và lời cám ơn đặc biệt nhất tôi xin gởi đến ngƣời bạn thân thiết nhất, Nguyễn Minh Khôi, đã luôn luôn bên tôi, an ủi và động viên để tôi làm tốt nhất. Xin cám ơn, cám ơn từ tận đáy lòng tôi. Thủ Đức, tháng 8 năm 2007 iv Võ Ngọc Thơ TÓM TẮT Đề tài: “Phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC-145 và xác định virus bằng kỹ thuật RT-PCR”. Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 tại phòng Vi Sinh Truyền Nhiễm Khoa Chăn Nuôi Thú Y và tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh. Mục tiêu của đề tài là phân lập virus từ các loại mẫu khác nhau và xác định sự hiện diện của virus bằng kỹ thuật RT-PCR. Nội dung nghiên cứu gồm:  Hồi phục tế bào và xác định thời gian một lần cấy chuyển (thời gian tế bào phát triển đầy bề mặt nuôi cấy tạo thành tế bào một lớp) trên bình nuôi cấy 25cm2 với những lƣợng tế bào là 7.105 và 106.  Khảo sát bệnh tích tế bào MARC-145 sau khi nuôi cấy phân lập từ các loại mẫu khác nhau: huyết thanh, hạch amiđan, phổi, hạch phổi.  Xác định sự hiện diện của virus PRRS từ bệnh tích tế bào MARC-145 sau gây nhiễm bằng kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction). Sau thời gian thực hiện, chúng tôi có các kết quả sau: o Thời gian một lần cấy chuyển ở lọ 25cm2 với những lƣợng tế bào: 7.105, 106 lần lƣợt là 72,56 giờ và 46 giờ. o Tế bào MARC-145 sau khi đƣợc hồi phục từ nitơ lỏng vẫn phát triển bình thƣờng. o Phân lập virus PRRS từ hạch phổi, phổi, huyết thanh trên môi trƣờng tế bào MARC-145. Ghi nhận đƣợc 3 mẫu có biểu hiện bệnh tích tế bào là 2 mẫu hạch phổi và 1 mẫu phổi chiếm tỷ lệ 27,27% (3/11). o Bằng kỹ thuật RT-PCR, trong 3 mẫu có bệnh tích tế bào có 1 mẫu cho kết quả dƣơng tính chiếm tỷ lệ 33,33% trên mẫu xét nghiệm. v SUMMARY Graduating thesis: " Isolating PRRS virus by MARC-145 cell and confirming the virus by RT-PCR technology". The thesis have been done from March to August, 2007 at Microbiology And Infectious Diseases Dept. of Faculty Of Animal Science Veterinary and Center For Chemical And Biological Analysis And Experiment of Nong Lam university Hồ Chí Minh city. Purpose of this reseach: Isolate PRRS virus from different specimens and determine its appearance by RT-PCR technology. The contain is concerned about:  Reviewing the cell and determine how long once transfer, length of time for cells grows to make monolayer, in flash with the amount of 7.10 5 and 10 6 .  Observating MARC-145 cell`s pathology after infecting the cells with different specimens such as: serum, lung, lympho nodes.  Determine virus` appearance from MARC-145 cell's pathology after days postinfection by RT-PCR technology (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction). Finally, we have results: o The average period of one transfer with the amount of 7.105 cells is 72,565 hours, 10 6 cells is 46 hours. o MARC-145 after reviewing from liquid nitrogen grow normally. o Isolating PRRS virus from lung, lympho nodes, serum in MARC-145 cell invironment. 3 specimens have MARC-145 cell's pathology postinfection: 2 lymphonotes, 1 lung (3/11 specimens). o We detect the positive form of PRRS RNA by RT-PCR: lympho node. vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... iii TÓM TẮT ............................................................................................................ iv SUMMARY ........................................................................................................... v MỤC LỤC ............................................................................................................ vi DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ ................................................................................ ix DANH SÁCH CÁC HÌNH .................................................................................... x DANH SÁCH CÁC BẢNG ................................................................................. xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................ xii Chƣơng 1: MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................... 1 1.2. Mục đích - Yêu cầu ...................................................................................... 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN .................................................................................... 3 2.1. Tổng quan về nuôi cấy tế bào ...................................................................... 3 2.1.1. Một số đặc điểm của tế bào động vật .................................................... 3 2.1.2. Thành phần cơ bản của môi trƣờng nuôi cấy ........................................ 4 2.1.3. Điều kiện nuôi cấy ................................................................................ 6 2.1.4. Sự tạp nhiễm và cách hạn chế ............................................................... 6 2.2. Phƣơng pháp PCR ........................................................................................ 6 2.2.1. Nguyên tắc ............................................................................................ 7 2.2.2. Thực nghiệm ......................................................................................... 7 2.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR ............................................ 8 2.2.4. Phƣơng pháp RT-PCR .......................................................................... 9 2.3. Sơ lƣợc về căn bệnh, bệnh do virus ........................................................... 10 2.3.1. Lịch sử bệnh ........................................................................................ 10 2.3.2. Căn bệnh học ....................................................................................... 11 2.3.2.1. Phân loại ..................................................................................... 11 2.3.2.2. Một số đặc điểm về hình thái và cấu trúc .................................. 12 vii 2.3.2.3. Đặc điểm nuôi cấy ...................................................................... 14 2.3.2.4. Sức đề kháng .............................................................................. 16 2.3.3. Dịch tễ học bệnh PRRS ....................................................................... 16 2.3.3.1. Loài mắc bệnh ............................................................................ 16 2.3.3.2. Phƣơng thức lây lan ................................................................... 16 2.3.3.3. Đƣờng xâm nhập ........................................................................ 17 2.3.3.4. Cơ chế sinh bệnh ........................................................................ 17 2.3.4. Triệu chứng lâm sàng .......................................................................... 20 2.3.5. Chẩn đoán ............................................................................................ 20 2.3.5.1. Chẩn đoán lâm sàng ................................................................... 20 2.3.5.2. Chẩn đoán phi lâm sàng ............................................................. 21 2.3.5.2.1. Phƣơng pháp phát hiện kháng thể .................................. 21 2.3.5.2.2. Các phƣơng pháp phát hiện kháng nguyên .................... 22 2.3.5.2.3. Phát hiện gen của virus PRRS........................................ 23 2.3.5.2.4. Phân lập virus trên môi trƣờng tế bào ............................ 23 Chƣơng 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ......................... 25 3.1. Thời gian và địa điểm................................................................................. 25 3.2. Đối tƣợng và số lƣợng mẫu ........................................................................ 25 3.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 25 3.4. Vật liệu và dụng cụ .................................................................................... 26 3.4.1. Thiết bị và dụng cụ dùng cho nuôi cấy tế bào và phân lập virus ........ 26 3.4.2. Vật liệu dùng cho nuôi cấy tế bào MARC-145 ................................... 26 3.4.3. Thiết bị và dụng cụ dùng cho phản ứng PCR ..................................... 27 3.4.4. Vật liệu và hoá chất cho chiết tách RNA ............................................ 27 3.4.5. Vật liệu và hoá chất sử dụng cho RT-PCR ......................................... 27 3.4.6. vật liệu và hoá chất cho điện di sản phẩm RT-PCR ........................... 28 3.5. Phƣơng pháp tiến hành ............................................................................... 28 3.5.1. Phƣơng pháp lấy mẫu .......................................................................... 28 3.5.2. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào MARC-145 .......................................... 28 viii 3.5.2.1. Hồi phục tế bào .......................................................................... 28 3.5.2.2. Cấy chuyển tế bào ...................................................................... 29 3.5.3. Phƣơng pháp phân lập virus ................................................................ 30 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 34 4.1. Thời gian một lần cấy chuyển tế bào MARC-145 ..................................... 34 4.2. Kết quả gây nhiễm lần một trên môi trƣờng tế bào MARC-145 ............... 35 4.3. Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trƣờng tế bào MARC-145 ................ 37 4.4. Kết quả RT-PCR ........................................................................................ 40 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 44 5.1. Kết luận ...................................................................................................... 44 5.2. Tồn tại ........................................................................................................ 44 5.3. Đề nghị ....................................................................................................... 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 45 PHỤ LỤC ix DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Sơ đồ cơ chế sinh bệnh của virus PRRS ............................................ 19 Sơ đồ 3.1. Sơ đồ phân lập và xác định virus PRRS ............................................ 31 Sơ đồ 3.2. Sơ đồ thực hiện phản ứng RT-PCR ................................................... 33 x DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Virus PRRS ......................................................................................... 12 Hình 2.2. Đại thực bào bình thƣờng .................................................................... 15 Hình 2.3. Đại thực bào bị nhiễm virus PRRS ..................................................... 15 Hình 2.4. Triệu chứng bệnh tai xanh................................................................... 20 Hình 2.5. Sảy thai do virus PRRS ....................................................................... 20 Hình 3.1. Buồng đếm Neubauer .......................................................................... 30 Hình 4.1. Đối chứng âm ..................................................................................... 40 Hình 4.2. Mẫu không có bệnh tích tế bào ........................................................... 40 Hình 4.3. Đối chứng dƣơng ................................................................................ 40 Hình 4.4. Bệnh tích tế bào vào ngày thứ 7 sau gây nhiễm ở mẫu HP ................ 41 Hình 4.5. Bệnh tích tế bào vào ngày thứ 7 sau gây nhiễm ở mẫu P2 ................. 41 Hình 4.6. Kết quả RT-PCR mẫu ly trích từ dịch nuôi cấy tế bào ....................... 42 xi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 4.1. Thời gian một lần cấy chuyển tế bào MARC-145 .............................. 34 Bảng 4.2. Kết quả gây nhiễm lần một trên môi trƣờng tế bào MARC-145 ........ 36 Bảng 4.3. Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trƣờng tế bào MARC-145 ......... 38 Bảng 4.4. Kết quả RT-PCR từ mẫu dịch tế bào sau gây nhiễm .......................... 46 xii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AMV: Avian Myeloblastosis Virus cDNA: Complement Deoxynucleotide Acid DEPC: Diethyl Pyrocarbonate DNA: Deoxynucleotide Acid dNTP: Deoxynucleotide Triphosphate EDTA: Ethylene Diamine Tetra Acetate ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay EMEM: Eagle Minimum Essential Medium FA: Florescent Antibody Staining HRPO: Horseradish Peroxidase IFA: Immuno Peroxidase Monolayer Assay IHC: Immunohistochemistry Staining IPMA: Immuno peroxidase Monolayer Assay LAH: Lactalbumin Hydrolysate MSD: Mystery Swine Disease Nu: Nucleotide ORF: Open Reading Frame PAM: Porcine Alveolar Macrophage PBS: Phosphate Buffer Saline PBSA: Phosphate Buffer Saline Solution A PCR: Polymerase Chain Reaction PRRS: Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome RNA: Ribonucleotide Acid RT-PCR: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction SN: Serum Neutralization TBE: tris Borate EDTA µl: Microlit 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Từ nhiều năm nay, ngành chăn nuôi chiếm một vai trò quan trọng trong nền kinh tế ở nƣớc ta vì nƣớc ta là một nƣớc nông nghiệp. Nó đã cung cấp một phần nhu cầu thực phẩm thiết yếu của cuộc sống con ngƣời. Trong đó ngành chăn nuôi heo không ngừng phát triển để cung cấp đủ số lƣợng cũng nhƣ chất lƣợng cho ngƣời tiêu dùng. Do nhu cầu xã hội phát triển nên số lƣợng heo nuôi ngày càng tăng cao. Song song với quá trình phát triển của ngành chăn nuôi heo thì giới chăn nuôi cũng phải đối mặt với không ít khó khăn, đặc biệt là những bệnh ảnh hƣởng trực tiếp đến thành tích sinh sản và tăng trƣởng của heo nhƣ: bệnh FMD, bệnh dịch tả heo, bệnh đóng dấu son, bệnh giả dại…và gần đây nhất là một vấn đề đang làm đau đầu giới chăn nuôi, nó ảnh hƣởng không nhỏ đến hiệu quả kinh tế của ngành chăn nuôi là hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS: porcine reproductive and respiratory syndrome). Bệnh do virus PRRS tiến triển phức tạp, khó khống chế lại ít biểu hiện triệu chứng, tỷ lệ mắc bệnh cao, bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi. Bệnh gây sảy thai ở thời kỳ cuối, chậm động dục, gia tăng số thai chết và heo con sơ sinh yếu, heo con chết trƣớc khi sinh, còi cọc, chậm lớn. Những nghiên cứu về PRRS trƣớc đây chỉ dừng lại ở việc điều tra tỷ lệ nhiễm bằng phản ứng ELISA để phát hiện kháng thể kháng virus PRRS. Mặc dù việc nuôi cấy phân lập virus trên môi trƣờng tế bào khó, tuy nhiên xác định sự hiện diện của virus từ mẫu huyết thanh dƣơng tính và các mẫu lâm sàng là rất cần thiết để làm cơ sở cho công tác phòng bệnh và các nghiên cứu sau này. 2 Xuất phát từ thực tế trên, đƣợc sự phân công của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM, dƣới sự hƣớng dẫn tận tình của ThS. Trần Thị Bích Liên và BSTY Hoàng Thanh Hải, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC- 145 và xác định virus bằng kỹ thuật RT- PCR”. 1.2. Mục đích – Yêu cầu 1.2.1. Mục đích Xác định sự hiện diện của virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC- 145 bằng kỹ thuật RT- PCR góp phần hoàn thiện dần quá trình chẩn đoán bệnh PRRS trên heo và lấy đó làm cơ sở cho những nghiên cứu sau này. 1.2.2. Yêu cầu Khảo sát đặc tính của tế bào MARC-145 bằng cách hồi phục tế bào và xác định thời gian một lần cấy chuyển. Phân lập virus PRRS từ huyết thanh, phổi, hạch phổi của heo nghi ngờ bệnh trên môi trƣờng tế bào MARC-145. Ghi nhận bệnh tích tế bào sau 7 ngày nuôi cấy. Dùng kỹ thuật RT- PCR (Reverse Trascriptase - Polymerase Chain Reaction) để xác định sự hiện diện của virus PRRS từ dịch tế bào nuôi cấy. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN 2.1. Tổng quan về nuôi cấy tế bào Nuôi cấy tế bào là kỹ thuật duy trì và phát triển các tế bào ở ngoài cơ thể sống nhƣng vẫn thực hiện đầy đủ các chức năng biến dƣỡng và chức năng chuyên biệt của tế bào. Quá trình nuôi cấy tế bào cho phép mỗi tế bào đóng vai trò nhƣ những tế bào độc lập, nó có thể phân chia nhờ quá trình nguyên phân và quần thể tế bào tiếp tục phát triển cho đến khi bị giới hạn bởi bề mặt nuôi cấy hay sự cạn kiệt dinh dƣỡng. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào đƣợc tiến hành lần đầu tiên vào năm 1907 bởi Harrison. Ngày nay kỹ thuật này đã đƣợc ứng dụng rộng rãi trong y học và thú y học để nghiên cứu tác động của các chất lên tế bào hay nghiên cứu virus để phân lập, giám định, chuẩn độ virus, xác định tính chất huyết thanh học, quan sát hình thái siêu cấu trúc của virus và đặc biệt là sản xuất vaccine. Quá trình nuôi cấy thƣờng gồm những tế bào thuộc cùng một loại. 2.1.1. Một số đặc điểm của tế bào động vật Tính cơ học yếu: tế bào động vật không vách và kích thƣớc tế bào khá lớn (khoảng 10 µm) nên tính bền cơ học yếu. Do đó, khi nuôi cấy, tế bào động vật rất dễ vỡ do các lực tác động khi thao tác trên tế bào nhƣ khuấy trộn để tách tế bào, di chuyển mẫu tế bào. Tăng trƣởng và phân chia chậm: thời gian tăng trƣởng gấp đôi của tế bào trung bình là 30 giờ. Trong khi đó thời gian này của vi khuẩn chỉ khoảng 30 phút. Tính cần giá đỡ: hầu hết tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống và phân chia. Thông thƣờng, tế bào phát triển tốt khi gắn vào bề mặt rắn. Tế bào sẽ ngừng phân chia khi đã hình thành một lớp đơn liên tục trên bề mặt dụng cụ nuôi. Tuy vậy một số tế bào nhƣ tế bào ung thƣ có thể sinh trƣởng và phân chia ở trạng thái lơ lửng không cần giá đỡ. 4 Tế bào động vật có thể đƣợc bảo quản trong nitơ lỏng ở nhiệt độ -1960C, ở nhiệt độ này tế bào có thể giữ đƣợc khả năng sống không hạn định