Luận văn Phát hiện vi khuẩn erwinia carotovora subsp. carotovora trên cây địa lan (cymbidium) bằng phương pháp pcr

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ٭٭٭ 000٭٭٭ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp. carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ٭٭٭ 000٭٭٭ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp. carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN NGUYỄN THỊ THANH HÀ KS. DƢƠNG THÀNH LAM Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 3 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY. HO CHI MINH CITY DEPARMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** TO FIND BACTERIUM: Erwinia carotovora subsp. carotovora ON THE Cymbidium BY THE PCR Graduation thesis Major: Biotechnology Professor: Student: PhD. LE DINH DON NGUYEN THI THANH HA BSc. DUONG THANH LAM Term:2002 – 2006 Ho Chi Minh City 8/2006 4 LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi nhận đƣợc rất nhiều sự ủng hộ và giúp đỡ từ gia đình, thầy cô và bạn bè. Nay tôi xin chân thành cảm ơn đến: Cha mẹ và những ngƣời thân luôn tạo điều kiện, động viên con trong suốt quá trình con học tập tại trƣờng. Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả thầy cô đã tận tình giúp đỡ, dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trƣờng. Thầy Lê Đình Đôn đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. Thầy Dƣơng Thành Lam đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. Anh Nguyễn Văn Lẫm, các anh chị làm việc tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, các anh chị làm việc tại Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật khoa Nông Học trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Các bạn sinh viên lớp công nghệ sinh học 28 đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học và làm đề tài tốt nghiệp. TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006 Nguyễn Thị Thanh Hà 5 TÓM TẮT KHÓA LUẬN NGUYỄN THỊ THANH HÀ, Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.Tháng 8 năm 2006. “PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp. carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR” Giáo viên hƣớng dẫn: Thầy Lê Đình Đôn Thầy Dƣơng Thành Lam Địa điểm: Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Vật – Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh - Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. Đối tƣợng nghiên cứu: vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên địa lan (Cymbidium). Hiện nay, các vƣờn địa lan tại thành phố Đà Lạt bị thiệt hại rất lớn do bệnh thối làm chết cây gây ra. Cho đến thời điểm này ngƣời ta vẫn chƣa xác định chính xác tác nhân gây ra bệnh và chƣa có loại thuốc đặc trị hữu hiệu. Do đó, việc tìm hiểu phƣơng pháp chẩn đoán, phát hiện tác nhân gây ra bệnh là hết sức cần thiết giúp xây dựng quy trình phòng trừ bệnh hiệu quả hơn. Nội dung nghiên cứu bao gồm: 1. Điều tra tình hình bệnh hại trên địa lan tại một số vƣờn trồng địa lan trên địa bàn TP. Đà Lạt – Lâm Đồng. 2. Phân lập mẫu vi khuẩn và chủng bệnh lên củ khoai tây và lá địa lan. 3. Nhân sinh khối các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc. 4. Khuếch đại đoạn DNA nằm trong vùng 16S/23S rDNA và vùng gen pel mã hóa pectate lyase của vi khuẩn bằng phƣơng pháp PCR. Kết quả đạt đƣợc: 1. Tỷ lệ nhiễm bệnh tại các vƣờn điều tra: - Bệnh do vi khuẩn: 20,17%. - Bệnh do virus: 9,5%. - Bệnh do nấm: 11,6%. 2. Phân lập đƣợc 2 dòng vi khuẩn có màu khuẩn lạc rất đặc trƣng: - Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. - Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. 3. Chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan: 6 - Trên củ khoai tây: 9 dòng vi khuẩn có khả năng gây bệnh mạnh sau 48 giờ chủng bệnh (ở nhiệt độ phòng). - Trên lá địa lan: hầu nhƣ các dòng vi khuẩn đều không gây bệnh sau khi chủng bệnh 10 ngày (ở 250C), duy nhất chỉ có một dòng EC06-8 gây bệnh. 4. Khuếch đại đƣợc đoạn DNA có kích thƣớc 1,5 kb nằm trong vùng 16S/23S rDNA của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc. 7 MỤC LỤC Phần Trang Trang tựa ................................................................................................................. ii Lời cảm tạ .............................................................................................................. iii Tóm tắt ................................................................................................................... iv Mục lục .................................................................................................................. vi Danh sách các chữ viết tắt ..................................................................................... ix Danh sách các hình ................................................................................................. x Danh sách các bảng ............................................................................................... xi PHẦN 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1 1.2. Mục đích – yêu cầu .......................................................................................... 1 1.2.1. Mục đích ....................................................................................................... 1 1.2.2. Yêu cầu ......................................................................................................... 1 1.2.3. Giới hạn ........................................................................................................ 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 3 2.1. Điều kiện tự nhiên của TP. Đà Lạt với việc nuôi trồng Cymbidium ..................................................................................... 3 2.2. Giới thiệu về lan Cymbidium ........................................................................... 3 2.2.1. Phân loại – phân bố ...................................................................................... 3 2.2.2. Đặc điểm thực vật học .................................................................................. 4 2.2.3. Yêu cầu sinh thái .......................................................................................... 5 2.2.4. Sâu bệnh ....................................................................................................... 5 2.2.5. Tình hình sản xuất lan Cymbidium của Tp. Đà Lạt và trên thế giới ................................................................................................ 7 2.3. Giới thiệu về vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora và tác hại của nó ................................................................................ 8 2.3.1. Phân loại ....................................................................................................... 8 2.3.2. Erwinia carotovora ...................................................................................... 8 2.3.3. Erwinia carotovora subsp. carotovora ....................................................... 9 2.4. Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh do vi khuẩn gây ra ......................................... 13 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 17 8 3.1. Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................ 17 3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .............................................................. 17 3.1.2. Vật liệu ....................................................................................................... 17 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................... 18 3.2.1. Điều tra tình hình bệnh chết cây trên địa lan tại TP Đà Lạt – Lâm Đồng ......................................................................... 18 3.2.2. Phân lập mẫu vi khuẩn ............................................................................... 18 3.2.3. Quan sát vi khuẩn trên môi trƣờng KB và môi trƣờng YDC .................................................................................... 19 3.2.4. Chủng vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan ............................................ 19 3.2.5. Tăng sinh khối vi khuẩn trên môi trƣờng LB lỏng ..................................... 21 3.2.6. Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn............................................................ 21 3.2.7. Thực hiện phản ứng PCR ........................................................................... 22 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 25 4.1. Tình hình bệnh hại trên địa lan tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng ......................... 25 4.1.1. Các triệu chứng bệnh trên địa lan ............................................................... 25 4.1.2. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vƣờn điều tra ........................................................................ 27 4.2. Phân lập mẫu vi khuẩn .................................................................................. 28 4.3. Quan sát vi khuẩn trên môi trƣờng KB và môi trƣờng YDC ........................ 29 4.3.1. Trên môi trƣờng KB ................................................................................... 29 4.3.2. Trên môi trƣờng YDC ................................................................................ 30 4.4. Chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan ...................................... 31 4.4.1. Trên củ khoai tây ........................................................................................ 31 4.4.2. Trên lá địa lan ............................................................................................. 32 4.5. Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn............................................................... 32 4.6. Phản ứng PCR ............................................................................................... 34 4.6.1. Phản ứng PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 .................................................................................. 34 9 4.6.2. Phản ứng PCR với cặp primer Erw1 và Erw2 .............................................................................................. 35 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 37 5.1. Kết luận.......................................................................................................... 37 5.2. Đề nghị .......................................................................................................... 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 38 10 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT PCR : Polymerase chain reaction DNA : Deoxyribonucleotide acid RNAse : Ribonuclease TE : Tris EDTA SDS : Sodium dodecyl sulfate NaCl : Natri clorua TAE : Tris Acetate EDTA dNTP : Deoxynucleotide triphosphate Taq : Thermus aquaticus UV : Ultra violet LB : Luria – Bertani KB : King et al. 's medium B agar CVP : Crystal violet - pectate PGA : Potato Glucose Agar EtBr : Ethidium bromide YDC : Yeast extract – dextrose – CaCO3 Ecc : Erwinia carotovora subsp. carotovora CTAB : Cethyltrimethylammonium bromide Tm : Melting temperature ELISA : Enzyme linked Immuno Sorbent Assay μl : micro lít μg : micro gam μM : micro mol / lít mM : mili mol / lít ctv : cộng tác viên ha : hecta ng : nano gam bp : base pair 11 DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Hình thái vi khuẩn Erwina carotovora .................................................. 8 Hình 4.1. Các triệu chứng bệnh trên chồi địa lan ................................................. 25 Hình 4.2. Các triệu chứng bệnh trên giả hành ...................................................... 26 Hình 4.3. Các triệu chứng bệnh trên phát hoa ...................................................... 26 Hình 4.4. Vi khuẩn phân lập từ chồi địa lan bị bệnh trên môi trƣờng PGA ............................................................................ 29 Hình 4.5.1. Khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng KB chiếu dƣới tia UV sau 24 giờ nuôi cấy (ở nhiệt độ phòng) .................. 30 Hình 4.5.2. Hình thái của khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng YDC sau 24 giờ nuôi cấy (ở nhiệt độ phòng) ............................................... 30 Hình 4.6.1. Các triệu chứng bệnh trên củ khoai tây chủng vi khuẩn sau 48 giờ (ở nhiệt độ phòng) .................................... 31 Hình 4.6.2. Triệu chứng bệnh trên lá địa lan chủng vi khuẩn sau 10 ngày (ở 250C).................................................. 32 Hình 4.6.3. Vi khuẩn phân lập từ lá địa lan bị bệnh sau khi chủng vi khuẩn 10 ngày trên môi trƣờng PGA ...................... 32 Hình 4.7. Sản phẩm ly trích DNA tổng số của vi khuẩn ...................................... 33 Hình 4.8. Sản phẩm PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 (nhiệt độ bắt cặp 560C) ....................................... 34 Hình 4.9. Sản phẩm PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 (nhiệt độ bắt cặp 580C) ....................................... 34 Hình 4.10. Sản phẩm PCR với cặp primer Erw1 và Erw2 ................................... 35 12 DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ BẢNG TRANG Bảng 4.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vƣờn điều tra ................................................................. 27 ĐỒ THỊ TRANG Đồ thị 4.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vƣờn điều tra .................................................................... 28 13 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Nói đến hoa Đà Lạt, chúng ta không thể nào không nói đến lan Cymbidium. Ngƣời dân Đà Lạt thƣờng gọi lan Cymbidium là địa lan. Địa lan Đà Lạt rất phong phú về chủng loại, đa dạng về cấu trúc và màu sắc. Loài hoa này từng là “sứ giả” của Đà Lạt ở Đông Âu những năm trƣớc 1990. Mặc dù có những biến động bất lợi về thị trƣờng tiêu thụ hoa cắt cành nhƣng gần đây, việc nuôi trồng hoa lan với quy mô lớn nhằm mục đích khai thác kinh doanh đã dần dần đƣợc khôi phục. Hoa địa lan Cymbidium đƣợc nhiều ngƣời quan tâm và đầu tƣ với quy mô lớn. Tuy nhiên trong vài năm trở lại đây, ngƣời nông dân trồng địa lan tại TP. Đà Lạt đang phải đối mặt với bệnh thối làm chết cây. Bệnh phát triển nhiều và lây lan nhanh chóng trong mùa mƣa. Hiện nay, tình trạng bệnh chết cây địa lan vẫn chƣa đƣợc khống chế do chƣa xác định chính xác tác nhân gây ra bệnh và chƣa tìm ra loại thuốc đặc trị hữu hiệu. Thiệt hại về kinh tế do căn bệnh này gây ra là rất lớn. Đây là nỗi trở ngại, băn khoăn của đa số các hộ trồng địa lan trên địa bàn thành phố Đà Lạt. Vấn đề đặt ra là làm sao xác định chính xác tác nhân gây ra bệnh để từ đó xây dựng đƣợc quy trình phòng trừ bệnh hữu hiệu giúp giảm thiệt hại do căn bệnh này gây ra cho ngƣời trồng địa lan. Với tính cấp thiết của vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Phát hiện vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên cây địa lan (Cymbidium) bằng phƣơng pháp PCR”. 1.2. Mục đích – yêu cầu 1.2.1. Mục đích: thiết lập quy trình PCR cho vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên cây địa lan (Cymbidium). 1.2.2. Yêu cầu - Điều tra tình hình bệnh hại tại các vƣờn trồng địa lan tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng. - Phân lập mẫu vi khuẩn. - Nhân sinh khối các dòng vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora. - Nắm vững quy trình ly trích DNA vi khuẩn. 14 - Khảo sát các yếu tố nhƣ chu kỳ nhiệt, nồng độ primer, nồng độ DNA, số chu kì thích hợp để thiết lập quy trình PCR. 1.2.3. Giới hạn - Đề tài đƣợc thực hiện từ 15/02/2006 đến 30/07/2006. - Chỉ làm đƣợc trên một số mẫu. - Do thời gian và kinh phí có hạn nên không tiến hành giải trình tự sản phẩm PCR. 15 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Điều kiện tự nhiên của TP. Đà Lạt với việc nuôi trồng Cymbidium Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới châu Á với nhiều vùng tiểu khí hậu rất khác nhau, là một trong những nơi tập trung nhiều loài lan của thế giới, đặc biệt là từ các vùng cao nguyên Trung Bộ đến miền Đông Nam Bộ. Ở nƣớc ta vƣơng quốc thật sự của các loài lan là những vùng cao nguyên có độ cao từ 800 m đến 1.000 m nhƣng đáng kể nhất vẫn là ở Đà Lạt – Lâm Đồng. Thành phố Đà Lạt đƣợc đặt trọn trên cao nguyên Lâm Viên với độ cao trên dƣới 1.500 m, về phía Đông Bắc tỉnh Lâm Đồng. Phía Bắc giáp huyện Lạc Dƣơng, phía Nam giáp huyện Đức Trọng, phía Đông và Đông Nam giáp huyện Đơn Dƣơng, phía Tây và Tây Nam giáp huyện Lâm Hà. Nhiệt độ trung bình năm là 18,30C, biên độ nhiệt trong ngày 11 – 120C. Khí hậu Đà Lạt chia làm hai mùa rõ rệt, mùa mƣa kéo dài từ tháng 4 đến tháng 10 hàng năm, mùa khô từ tháng 10 năm trƣớc đến tháng 4 năm sau. Lƣợng mƣa bình quân hàng năm ở Đà Lạt đạt 1.800 mm.Cƣờng độ mƣa tập trung vào các tháng 8, 9 hàng năm. Mùa khô kiệt nƣớc là tháng 12, 1 và 2. Nhìn chung, Đà Lạt có khí hậu ôn hòa dịu mát quanh năm, mùa mƣa nhiều, mùa khô ngắn, không có bão. Đây là những điều kiện hết sức thuận lợi để phát triển nuôi trồng các loại hoa ôn đới trong đó địa lan Cymbidium là một trong những loại hoa ôn đới đặc thù của Đà Lạt. 2.2. Giới thiệu về lan Cymbidium 2.2.1. Phân loại – Phân bố Phân loại: theo Otto Swartz (1799), chi Cymbidium thuộc: Giới (Kingdom) : Plantae Lớp (Class) : Liliopsida Bộ(Order) : Asparagales Họ (Family) : Orchidacaea Họ phụ (Subfamily) : Epidendroideae Tông (Tribe) : Cymbidiinae Tông phụ (Subtribe) : Cyrtopodiinae Giống (Genus) : Cymbidium ( 16 Phân bố: trên thế giới, các loài Cymbidium phân bố chủ yếu ở châu Á, từ dãy Hy Mã Lạp Sơn (Hymalaya) đến Nam Trung Quốc (Vân Nam), các nƣớc Đông Dƣơng (Việt Nam, Malaysia, Mianma, Thái Lan) và một vài loài phân bố ở các châu lục khác. Phần lớn các loài trong chi này sống ở các vùng rừng núi khá cao, khô và lạnh, một vài loài khác chịu đƣợc điều kiện nóng ẩm của rừng nhiệt đới (Trƣơng Trỗ, 1988). 2.2.2. Đặc điểm thực vật học Về hình thái bên ngoài, lan Cymbidium là những loài thân thảo, đa niên, đẻ nhánh hằng năm tạo thành những bụi nhỏ. Rễ: có loài rễ mọc bám trên vỏ cây, mặt đất (bì sinh hay phụ sinh); có loài rễ ăn sâu trong bọng cây, trong đất mùn (địa sinh hay thực sinh). Rễ mới thƣờng chỉ mọc ở cây con, cây mẹ khó ra rễ mới mà chỉ thấy phân nhánh từ rễ củ. Thân (căn hành): thân ngầm của chúng (căn hành) thƣờng ngắn, nối những củ lan với nhau. Các củ lan thực chất là những cành ngắn của căn hành. Củ già, khi bị tách khỏi căn hành cũ, có thể mọc ra căn hành mới, từ đó mọc ra những cây con. Do đó mà ngƣời ta xếp Cymbidium vào nhóm lan đa thân. Củ lan (giả hành): thƣờng có dạng con quay hay dạng hột xoài, đƣờng kính từ 1 – 15 cm. Củ thƣờng tƣơi và đƣợc bọc trong các bẹ lá. Lá: thƣờng có hai dạng: dạng vảy đính theo một đoạn căn hành và dạng thực đính trên giả hành. Lá thực thƣờng có cuống lá, giữa bẹ lá và cuống lá có một tầng phân cách. Khi phiến lá rụng vẫn còn đoạn bẹ ôm lấy giả hành. Vài loài không có cuống lá. Tùy theo từng loài mà phiến lá rất khác nhau, có gân dọc nổi rõ hay chìm trong thịt lá. Một số loài ít chịu rợp có phiến lá màu xanh vàng còn lại thƣờng xanh đậm. Bản lá và độ dày của lá thay đổi theo từng loài: các loài sống ở trảng trống có lá hẹp và dày hơn các loài ƣa bóng rợp. Lá có dạng dải, dạng mũi mác, dạng phiến. Đầu lá nhọn ha