Luận văn Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi b bằng phương pháp real-Time pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM GAN SIÊU VI B BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : VÕ THỊ HẢI YẾN MSSV: 0811110105 Lớp: 08CSH2 TP. Hồ Chí Minh, 2011 – LỜI CAM ĐOAN — Tôi xin cam đoan bài luận văn tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của cá nhân, được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết. Các số liệu, những kết quả thí nghiệm trong báo cáo luận văn tốt nghiệp là trung thực. Nội dung bài báo cáo này có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tạp chí và các trang web theo danh mục tài liệu tham khảo. Khóa luận tốt nghiệp SVTH : Võ Thị Hải Yến i MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3 1.1. Đại cương về bệnh viêm gan siêu vi B .......................................................... 3 1.1.1. Định nghĩa bệnh viêm gan siêu vi B ..................................................... 3 1.1.2. Lịch sử bệnh viêm gan siêu vi B ........................................................... 3 1.2. Đặc điểm sinh học của Hepatitis B Virus ...................................................... 4 1.2.1. Kích thước và cấu trúc của virus hoàn chỉnh ........................................ 4 1.2.2. Cấu trúc bộ gen của HBV ...................................................................... 5 1.2.3. Sự tái bản DNA ..................................................................................... 6 1.2.4. Các thành phần kháng nguyên .............................................................. 6 1.2.5. Cách thức tồn tại và khả năng gây bệnh ............................................... 7 1.3. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trên thế giới và Việt Nam ...................... 9 1.3.1. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trên thế giới ................................... 9 1.3.2. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trong nước ................................... 10 1.4. Đường lây của HBV, triệu chứng lâm sàng, biện pháp phòng ngừa và điều trị HBV ............................................................................................................. 11 1.4.1. Đường lây của HBV ............................................................................ 11 1.4.2. Triệu chứng lâm sàng ........................................................................... 13 1.4.3. Biện pháp phòng ngừa và điều trị HBV .............................................. 13 1.5. Các phương pháp chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B ................................. 15 1.5.1. Phương pháp huyết thanh học (phát hiện kháng thể) và hóa miễn dịch (phát hiện kháng nguyên) ................................................................................. 15 1.5.2. Phương pháp sinh học phân tử ............................................................ 16 CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................... 34 2.1. Vật liệu thiết bị ............................................................................................. 34 2.1.1. Vật liệu sinh học .................................................................................. 34 Khóa luận tốt nghiệp SVTH : Võ Thị Hải Yến ii 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ .................................................................................. 34 2.1.3. Hóa chất ............................................................................................... 37 2.2. Phương pháp tiến hành ................................................................................. 37 2.2.1. Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu ................................................... 38 2.2.2. Phương pháp tách chiết ....................................................................... 39 2.2.3. Phản ứng Real-time PCR ..................................................................... 40 CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 42 KẾT LUẬN .............................................................................................................. 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 46 Khóa luận tốt nghiệp SVTH : Võ Thị Hải Yến iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT bDNA branched DNA Bp base pair cDNA complementary DNA Ct Threshold cycle (chu kỳ ngưỡng) DNA Deoxyribonucle acid dNTPs Deoxyribonucleotide triphosphate ELISA Enzyme Linked Immuno Assay HBV Hepatitis B Virus HBcAg Hepatitis B core Antigen HBeAg Hepatitis B envelope Antigen HBsAg Hepatitis B surface Antigen KN Kháng nguyên KT Kháng thể Nu Nuleotide PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucle acid Tm Nhiệt độ nóng chảy của mồi Khóa luận tốt nghiệp SVTH : Võ Thị Hải Yến iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Virus viêm gan siêu vi B trong máu của một bệnh nhân nhìn dưới kính hiển vi điện tử ............................................................................................................. 3 Hình 1.2. Cấu trúc viêm gan B ................................................................................... 4 Hình 1.3. Cấu trúc bộ gene HBV ................................................................................ 5 Hình 1.4. Sự xâm nhiễm và sao chép HBV ................................................................ 8 Hình 1.5. Sự phân bố HBsAg trên thế giới...............................................................11 Hình 1.6. Nguyên lý phát hiện HBV bằng phương pháp bDNA.............................. 17 Hình 1.7. Nguyên lý PCR .........................................................................................19 Hình 1.8. Tóm tắt cơ chế hoạt động của Beacon probe trong Real-time PCR ......... 24 Hình 1.9. Tóm tắt cơ chế hoạt động của probe đôi trong Real-time PCR ............... 26 Hình 1.10. Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong Real-time PCR ..... 28 Hình 1.11. Biểu đồ biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhân được ánh sáng kích thích vào mỗi chu kỳ nhiệt .............33 Hình 2.1. Máy ly tâm thu huyết thanh ......................................................................34 Hình 2.2. Máy Stratagene Mx300P .......................................................................... 34 Hình 2.3. Máy ly tâm ................................................................................................ 35 Hình 2.4. Máy vortex ................................................................................................35 Hình 2.5. Máy ủ nhiệt khô ........................................................................................ 36 Hình 2.6. Máy ly tâm eppendorf 0.2ml .................................................................... 36 Hình 2.7. Quy trình phát hiện HBV bằng phương pháp Real-time PCR .................38 Hình 2.8. Chu trình nhiệt của Real-time PCR .......................................................... 41 Hình 3.1. Đường biểu diễn khuếch đại mẫu thử nghiệm ......................................... 43 Hình 3.2. Biểu đồ đường chuẩn ................................................................................ 44 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 1 LỜI MỞ ĐẦU I. Đặt vấn đề Viêm gan siêu vi B do Hepatitis B virus (HBV) gây bệnh phổ biến trên toàn cầu, có diễn biến phức tạp, tỷ lệ chuyển sang mãn tính cao, thường dẫn tới xơ gan và ung thư gan. Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), hiện nay có khoảng 2 tỉ người nhiễm virus viêm gan siêu vi B trên thế giới, trong đó có khoảng 6% nhiễm viêm gan siêu vi B cấp và 5 - 10% trong số này chuyển sang mãn tính ở người lớn, riêng với trẻ em tỉ lệ này lên đến 90%. Tỷ lệ tử vong trong giai đoạn cấp tính là 1%, biến chứng của viêm gan B cấp là viêm gan mãn, xơ gan, xơ gan mất bù và ung thư nguyên phát, dẫn tới tử vong 1 triệu người mỗi năm. Tại Việt Nam, hiện nay có khoảng 15 - 20% dân số nhiễm HBV, trong đó có khoảng 80 - 92% bệnh nhân xơ gan và ung thư gan nguyên phát có nhiễm HBV. Một trong những kỹ thuật phổ biến dùng để chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B được sử dụng hiện nay là phương pháp Real-time PCR, cho kết quả nhanh chóng, độ tin cậy cao, góp phần vào việc điều trị viêm gan mãn tính. II. Mục tiêu đề tài Do tỷ lệ nhiễm HBV khá cao nên ngoài biện pháp phòng ngừa thì vấn đề điều trị nhiễm HBV hay tình trạng mạng virus lâu dài trong máu cũng đang rất quan tâm. Nhưng để có thể có được những hiểu biết về các vấn đề kể trên thì cần phải xác định được một người đang mang HBsAg trong máu có thật sự đang nhiễm HBV hay không. Ngoài ra, để có được chỉ định điều trị đặc hiệu cũng như theo dõi được hiệu quả điều trị thì phải phát hiện cũng như định lượng được HBV trong máu. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 2 Trước yêu cầu thực tế đó, khóa luận “Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B bằng phương pháp Real-time PCR” được thực hiện với mục đích đề xuất phương pháp định lượng HBV-DNA trong huyết thanh của người bệnh, nhằm giải quyết các vấn đề nói trên. III. Nhiệm vụ đề tài Giới thiệu sơ lược về virus gây bệnh viêm gan siêu vi B. Tìm hiểu các phương pháp chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B. Tìm hiểu quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B bằng phương pháp Real-time PCR. IV. Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu tài liệu, lý thuyết. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cương về bệnh viêm gan siêu vi B 1.1.1. Định nghĩa bệnh viêm gan siêu vi B [19] Viêm gan siêu vi B là bệnh viêm gan do virus viêm gan B (Hepatitis B Virus) gây ra, truyền nhiễm theo đường máu và sinh dục lây đến gần 1/3 dân số trên toàn thế giới, nhiều nhất tại các nước đang phát triển. 1.1.2. Lịch sử bệnh viêm gan siêu vi B [5] Bệnh được biết từ năm 1883 qua một vụ dịch viêm gan trên 191 người trong số 1289 công nhân đóng tàu ở Bremen (Anh) được chủng đậu mùa. Tất cả bệnh nhân là những người được chủng cùng một loại vaccine đậu mùa. Năm 1965, Blumberg phát hiện kháng nguyên gây bệnh viêm gan lây truyền qua huyết thanh, đặt tên là kháng nguyên Úc Châu (vì tìm thấy trên một người ở Châu Úc). HBV do Dane phát hiện năm 1970 trong huyết thanh của những bệnh nhân viêm gan bằng kỹ thuật miễn dịch hiển vi điện tử và được gọi là hạt Dane. Hình 1.1. Virus viêm gan siêu vi B trong máu của một bệnh nhân nhìn dưới kính hiển vi điện tử [23] Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 4 1.2. Đặc điểm sinh học của Hepatitis B Virus [8],[15],[18] Tác nhân gây viêm gan siêu vi B là một loại virus thuộc họ Hepadnaviridae, là tác nhân chủ yếu gây viêm gan và ung thư gan, được tìm thấy trong tế bào gan và trong huyết thanh của người bị nhiễm bệnh. 1.2.1. Kích thước và cấu trúc của virus hoàn chỉnh Hình 1.2. Cấu trúc viêm gan B [24] Virus hoàn chỉnh (virion) là một tiểu thể hình cầu có đường kính từ 42 - 47nm được gọi là hạt tử Dane, gồm: - Một vỏ protein có bề dày khoảng 7nm chứa kháng nguyên bề mặt HBsAg, glycoprotein và lipid. - Lõi có đường kính khoảng 28nm chứa một phân tử DNA, 2 loại kháng nguyên lõi là HBcAg, HBeAg và một số enzyme quan trọng như DNA polymerase, protein kinase. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 5 1.2.2. Cấu trúc bộ gene của HBV Phân tử DNA của virus có dạng vòng, chứa khoảng 3,2Kb gồm hai mạch đơn có chiều dài khác nhau: một mạch dài hay mạch [-] là mạch hoàn chỉnh và một mạch ngắn là mạch [+] liên kết với phân tử DNA polymerase. Hình 1.3. Cấu tạo bộ gene HBV [18] Mạch [-] có 4 vùng mã hóa đã được xác định: gene S, gene C, gene P và gene X. v Gene S (surface) Mã hóa kháng nguyên bề mặt HBsAg, gồm ba vùng (pre S1, pre S2, S) mã hóa ba loại protein của HBsAg. - Vùng S mã hóa protein nhỏ (là protein chủ yếu vì nó chiếm đa số) chứa 226 acid amin, có vị trí gắn glucose. - Vùng S và pre S2 mã hóa loại protein trung bình chứa 281 acid amin, có vị trí gắn glucose. - Vùng S, pre S1, pre S2 mã hóa protein lớn chứa 389 - 400 acid amin, không có vị trí gắn glucose. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 6 v Gene C (core) Mã hóa các polypeptide ở phần lõi của virus, gồm kháng nguyên lõi là HBcAg. Gene C có một trình tự ngắn là pre C (precore) mã hóa HBeAg. Nếu có một đột biến tại mã ngừng (stop codon) sẽ làm cho virus không sản xuất được HBeAg trong khi HBsAg vẫn được tổng hợp. Dòng đột biến này cũng có vai trò trong viêm gan siêu vi mãn và viêm gan siêu vi tối cấp. v Gene P (pol hay polymerase) Gene P chiếm 3/4 bộ gene của virus. Gene này gối lên phần cuối gene C, phần đầu gene X và toàn bộ gene S. Gene P mã hóa một polypeptide cơ bản, có hoạt tính DNA polymerase và ribonuclease H. v Gene X Đây là gene có kích thước nhỏ nhất, mã hóa một polypeptide gồm 154 acid amin, có chức năng điều hòa sự phiên mã của virus. 1.2.3. Sự tái bản DNA Trong sự tái bản DNA, mạch DNA [-] làm khuôn mẫu phiên mã ra mạch RNA [+] gọi là mRNA. Các bản sao mRNA này sẽ được đưa vào lõi của virus ở giai đoạn cuối của quá trình tái bản, mRNA sẽ làm khuôn mẫu cho giai đoạn phiên mã ngược để tổng hợp mạch cDNA [-] nhờ enzyme reverse transcriptase cũng là enzyme DNA polymerase. Sau đó, mRNA bị phân hủy bởi hoạt tính ribonuclease. Mạch cDNA [-] lại làm khuôn mẫu tổng hợp mạch [+] nhưng sự tổng hợp không được hoàn tất trước khi virus trưởng thành và được giải phóng. Vì thế, các virus hoàn chỉnh thường có sự khác nhau về chiều dài hai mạch DNA và mạch [+] luôn ngắn hơn mạch [-]. 1.2.4. Các thành phần kháng nguyên v Kháng nguyên bề mặt (HBsAg) HBsAg được tìm thấy trong huyết thanh người dưới dạng một thành phần của virus hoàn chỉnh hay dạng không hoàn chỉnh. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 7 Năm 1968, Bayer và cộng sự đã quan sát được hai dạng HBsAg dưới kính hiển vi điện tử. - Dạng hình cầu có đường kính 17 - 25nm. - Dạng hình ống có đường kính khoảng 20nm, chiều dài thay đổi có thể lên đến vài trăm nm. Cấu tạo hóa học của cả hai dạng này gồm: protein, carbohydrate, lipid, không có nucleic acid nên được xem là dạng không hoàn chỉnh của HBV. HBsAg là chỉ điểm huyết thanh học thường được dùng để xác định nhiễm HBV. Đồng thời các mẫu huyết thanh có HBsAg sẽ là nguồn cung cấp kháng nguyên rất tốt, có thể làm vật liệu cho các phản ứng huyết thanh học áp dụng trong chẩn đoán. v Kháng nguyên lõi Gồm hai loại: HBcAg và HBeAg - HBcAg được tìm thấy trong nhân tế bào gan bị nhiễm HBV, trong huyết thanh người bị nhiễm. HBcAg hiện diện như là một thành phần của một virus hoàn chỉnh, chứ không có ở dạng tự do. - HBeAg là loại kháng nguyên hòa tan trong huyết thanh. Ở tế bào gan HBeAg hiện diện trong tế bào chất, sẽ được giải phóng khỏi phần lõi của virus khi xử lý với các chất mạnh. 1.2.5. Cách thức tồn tại và khả năng gây bệnh Các HBV gắn vào các receptor của nó trên màng tế bào gan. Sau đó, chúng bị tế bào nuốt vào trong theo kiểu ẩm bào. Vỏ capsid của nó (khi đã lọt vào tế bào) sẽ được một enzyme thích hợp của tế bào phân hủy và acid nucleic của HBV được giải phóng. Acid nucleic này đi vào nhân tế bào gan, tại đây sẽ tái tổng hợp tiến hành phiên mã, dịch mã và cuối cùng tạo sợi DNA mới. Các sợi này được lắp ráp qua lưới nội chất tạo ra các virion, và cuối cùng các virion được xuất bào ra ngoài. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 8 Virus gắn vào bề mặt tế bào gan: HBV gắn vào bề mặt tế bào gan cảm thụ nhờ sự phù hợp giữa thụ thể của tế bào với protein trên màng của virus. Virus xâm nhập tế bào: Sau khi bám vào thụ thể của tế bào chủ, có sự hòa nhập vỏ virus với màng tế bào, sau đó capsid được phóng thích vào trong tế bào. Virus nhân lên trong tế bào: Đầu tiên, các thông tin di truyền của virus được mã hóa trong các phân tử DNA sẽ được phiên mã sang các RNA thông tin của virus. Quá trình này cần đến sự tham gia của các enzyme RNA polymerase. Các tRNA của virus sẽ đóng vai trò truyền tin để tạo ra các DNA của virus và các protein của vỏ capsid của virus, các virus mới sẽ được lắp ráp từ DNA và protein. Hình 1.4. Sự xâm nhiễm và sao chép HBV [27] Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 9 1.3. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trên thế giới và Việt Nam [2],[4] 1.3.1. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trên thế giới Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), hiện nay trên thế giới có khoảng 2 tỉ người bị nhiễm HBV và 350 triệu người mang mầm bệnh mãn tính. Viêm gan siêu vi B thường là nguyên nhân dẫn đến viêm gan mãn tính, xơ gan và ung thư gan nguyên phát với tỷ lệ tử vong là 1 - 2 triệu người. Các genotype HBV khác nhau phân bố ở vùng địa lý đặc trưng khác nhau: - Genotype A phổ biến ở Bắc Mỹ, Châu Âu, Nam Phi và Ấn Độ. - Genotype B và C thì phổ biến ở Châu Á. - Genotype D phổ biến ở Châu Âu (vùng Địa Trung Hải), Trung Đông, Ấn Độ và Nam Phi. - Genotype E phổ biến ở Tây Phi. - Genotype F phổ biến ở Trung và Nam Mỹ, Alaska. - Genotype G phổ biến ở Châu Âu, Mexico, Mỹ. - Genotype H thường thấy ở Trung Mỹ, Mỹ, Nhật Bản. Tình hình HBV thay đổi theo từng khu vực địa lý. Tùy theo tỷ lệ người mang HBsAg [+] mà người ta chia làm 3 khu vực chính: 1.3.1.1. Khu vực lưu hành thấp Tỷ lệ HBsAg [+] khoảng 0,1 - 0,5% dân số như ở Bắc Mỹ, Tây Âu và Úc. Tỷ lệ người mang HBsAg cao nhất ở khoảng tuổi từ 20 - 40, trẻ em hiếm khi bị nhiễm HBV. 1.3.1.2. Khu vực lưu hành trung bình Tỷ lệ HBsAg [+] khoảng 2 - 7% ở một số quốc gia miền Nam Châu Âu và Đông Âu, Nga, Nam Mỹ. Kiểu lây truyền thường là phối hợp nhưng lây nhiễm qua đường tình dục thường là quan trọng hơn. Tuổi bị lây nhiễm cao nhất là từ 25 tuổi (khoảng 50% dân số). Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 10 1.3.1.3. Khu vực lưu hành cao Tỷ lệ HBsAg [+] vào khoảng 8 - 15%. Đặc điểm dịch tễ học quan trọng của vùng này là nhiễm HBV thường gặp ở trẻ em và lây nhiễm qua đường chu sinh (đường lây từ mẹ sang con). Trung Quốc, Phi Châu, Đông Nam Á được xếp vào khu vực này. Ngoài ra người ta cũng ghi nhận sự lây nhiễm còn xảy ra ở tuổi thiếu niên do các trẻ bị lây lẫn nhau trong gia đình, hoặc trong bạn bè, thường gặp ở trẻ em châu Phi. Vì vậy, hầu hết dân số bị nhiễm có huyết thanh chẩn đoán HBV dương tính rất sớm, thường là sau 10 tuổi. Tuy nhiên, bệnh lại thường được phát hiện ở tuổi trưởng thành, lúc mà các biến chứng mãn tính của nhiễm HBV có thể đã xuất hiện như viêm gan mãn, xơ gan và ung thư gan nguyên phát. Do nhiễm ở tuổi còn nhỏ nên nguy cơ mang siêu vi mãn tính rất cao, những phát hiện này chứng tỏ rằng người trẻ mang HBV là người có khả năng lây nhiễm nhất. Việt Nam cũng được xếp vào khu vực lưu hành cao, nghĩa là nhiễm HBV khá phổ biến, tuy chưa có những nghiên cứu dịch tễ học thống nhất. 1.3.2. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trong nước Ở Việt Nam, cứ 5 - 7 người dân thì có một người nhiễm, chủ yếu là kiểu gene B và C. Virus B xâm nhập tế bào gan, biến chúng thành nơi sản xuất virus mới. Khi phát hiện ra sự bất thường này, hệ miễn dịch sẽ tấn công kẻ xâm lược. Nếu “cuộc chiến“ thắng lợi, tế bào gan tổn thương sẽ được thay thế bằng những tế bào khỏe mạnh và bệnh nhân sẽ được phục hồi. Nhưng ở một số người, hệ miễn dịch không loại trừ được virus và họ trở thành người mang virus viêm gan B mãn tính. Khoảng 10% số người nhiễm virus B rơi vào trường hợp này. Trong các trường hợp xấu nhất, các tế bào gan bị virus phá hoại bị thay thế bằng các mô sợi bất thường, dẫn đến xơ gan và ung thư gan. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 11 Trên bản đồ dịch tễ của thế giới, tỷ lệ dân số Việt Nam mang kháng nguyên HBsAg (chứng tỏ nhiễm HBV) là trên 8%, xếp vào hàng các quốc gi