Luận văn Sản xuất bộ kit tách chiết dna và bộ kit pcr phát hiện gen halothan trên heo

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** LƢƠNG QUÝ PHƢƠNG SẢN XUẤT BỘ KIT TÁCH CHIẾT DNA VÀ BỘ KIT PCR PHÁT HIỆN GEN HALOTHAN TRÊN HEO Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** SẢN XUẤT BỘ KIT TÁCH CHIẾT DNA VÀ BỘ KIT PCR PHÁT HIỆN GEN HALOTHAN TRÊN HEO Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. NGUYỄN NGỌC TUÂN Lƣơng Quý Phƣơng PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN Khóa: 2002-2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 3 MINISTRY OF TRAINING AND EDUCATION HCMC NONG LAM UNIVERSITY DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** PRODUCTION DNA EXTRACTION KIT AND PCR KIT TO DETECT HALOTHAN GENE IN THE PIG Engineer essay Speciality: Biotechnology Advisor: Student: Assoc.Prof.Dr NGUYEN NGOC TUAN Luong Quy Phuong Assoc.Prof.Dr TRAN THI DAN Course: 2002-2006 Ho Chi Minh city August-2006 1 LỜI CẢM TẠ Đầu tiên, con xin gửi đến ba má lòng thành kính ghi ơn. Con kính chúc ba má sức khỏe dồi dào, con sẽ luôn phấn đấu để trở thành ngƣời có ích cho xã hội để không phụ công dƣỡng dục của ba má. Chân thành gửi lời cảm ơn đến:  Ban giám hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả các quý thầy cô đã tận tụy truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt quãng thời gian học tập tại trƣờng.  Ban giám đốc cùng tập thể cán bộ nhân viên Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực tập tốt nghiệp.  Tập thể cán bộ thú y và các cô chú tại lò mổ tập trung huyện Dĩ An, tỉnh Bình Dƣơng đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình lấy mẫu. Em trân trọng biết ơn thầy Nguyễn Ngọc Tuân và cô Trần Thị Dân đã tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu và tạo điền kiện thuận lợi cho em trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Em gửi lời cảm ơn chân thành đến anh Nguyễn Văn Út và chị Bùi Thị Thu Trang đã giúp đỡ, động viên, chỉ dẫn tận tình trong lúc em tiến hành đề tài tốt nghiệp. Cảm ơn tất cả bạn bè đã chia sẻ cùng tôi những khó khăn vất vả, vui buồn trong quá trình học tập tại trƣờng và trong thời gian thực tập tốt nghiệp. 2 TÓM TẮT KHÓA LUẬN Lƣơng Quý Phƣơng, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, tháng 8/2006, “SẢN XUẤT BỘ KIT TÁCH CHIẾT DNA VÀ BỘ KIT PCR PHÁT HIỆN GEN HALOTHAN TRÊN HEO” Hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Nguyễn Ngọc Tuân 2. PGS. TS. Trần Thị Dân Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 28-02-2006 đến ngày 28-07-2006 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Gen halothan là gen có những tác động quan trọng đến phẩm chất thịt, sự sinh trƣởng và sinh sản của heo. Do đó, sản xuất bộ kit tách chiết DNA và bộ kit PCR để phát hiện gen halothan trong đàn heo giống một cách nhanh chóng, tiện lợi, hiệu quả. Quá trình thực hiện đề tài đạt đƣợc những kết quả sau: 1. Rút ngắn thời gian tách chiết DNA: Giảm thời gian ủ mẫu trong dung dịch phân giải tế bào từ 1 giờ còn 30 phút, giảm thời gian tủa DNA lần 1 từ 2 giờ còn 1 giờ, không thực hiện giai đoạn tủa DNA lần 2, thực hiện việc hòa tan DNA trong TE trong 2 giờ thay vì để qua đêm. Độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA ở các thí nghiệm khác biệt không có ý nghĩa so với độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA tách chiết theo qui trình của Lê Thị Thu Phƣơng (2004). 2. Thiết lập đƣợc bộ kit tách chiết DNA cho 100 mẫu xét nghiệm. Thành phần bộ kit gồm có 5 dung dịch. Độ tinh sạch, hàm lƣợng DNA và hiệu quả phản ứng PCR của DNA tách chiết theo bộ kit khác biệt không có ý nghĩa so với qui trình của Lê Thị Thu Phƣơng (2004). Nhƣng thời gian thực hiện công việc tách chiết DNA theo bộ kit ngắn hơn (5 giờ so với 24 giờ). Có thể dùng bộ kit để tách chiết DNA từ mô cơ, mô máu, da. Bộ kit tách chiết DNA có thể bảo quản ở 4oC trong 3 tháng. 3. Thiết lập bộ kit PCR phát hiện gen halothan cho 10 phản ứng. Nồng độ glycerol 20% trong Master Mix 2X sau 1 tháng bảo quản ở 4oC cho hiệu quả PCR cao hơn so với nồng độ glycerol 10% (100% so với 20%). Bảo quản Master Mix 2X ở hai nhiệt độ 4oC và 10oC sau 1 tháng đều cho tỷ lệ thành công phản ứng PCR là 100%. 4. Bộ kit PCR halothan phát hiện gen halothan với nồng độ DNA mẫu tối thiểu 1ng. 5. Bộ kit PCR halothan dùng để phát hiện gen halothan trên nhiều nguồn mẫu khác nhau nhƣ cơ vân, máu, da. 3 MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Bìa ..................................................................................................................................... i Trang tựa .......................................................................................................................... ii Lời cảm tạ ...................................................................................................................... iii Tóm tắt khóa luận ........................................................................................................... iv Mục lục ............................................................................................................................ v Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................. vii Danh sách các bảng ..................................................................................................... viii Danh sách các hình và biểu đồ ....................................................................................... ix PHẦN I. MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1 1.2 Mục tiêu và yêu cầu ................................................................................................... 2 1.2.1 Mục tiêu ............................................................................................................ 2 1.2.2 Yêu cầu ............................................................................................................. 2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3 2.1 Khái quát về gen halothan và cách phát hiện ............................................................ 3 2.1.1 Gen halothan ..................................................................................................... 3 2.1.2 Ảnh hƣởng của gen halothan đến phẩm chất thịt ............................................. 3 2.1.3 Ảnh hƣởng của gen halothan đến sức sinh sản ................................................. 5 2.1.4 Những tác động tích cực của gen halothan ....................................................... 5 2.1.5 Cách phát hiện gen halothan ............................................................................. 6 2.2 Phƣơng pháp tách chiết DNA từ tế bào động vật và kỹ thuật PCR .......................... 7 2.2.1 Phƣơng pháp tách chiết DNA từ tế bào động vật ............................................. 7 2.2.2 Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế ............................................................... 8 2.2.3 Phƣơng pháp PCR ............................................................................................ 9 2.2.3.1 Nguyên tắc của phản ứng PCR .............................................................. 9 2.3 Enzym cắt giới hạn .................................................................................................. 11 2.4 Nguyên tắc tạo kit tách chiết DNA và kit PCR ....................................................... 13 2.4.1 Kit là gì ? ......................................................................................................... 13 2.4.2 Nguyên tắc tạo kit ........................................................................................... 13 2.4.3 Kit tách chiết DNA ......................................................................................... 13 2.4.4 Kit thực hiện phản ứng PCR ........................................................................... 14 2.5 Tình hình sản xuất kit trên thế giới và Việt Nam .................................................... 16 PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................... 17 3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành .............................................................................. 17 3.2 Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 17 3.2.1 Tối ƣu hóa qui trình tách chiết DNA .............................................................. 17 3.2.2 Tạo kit tách chiết DNA .................................................................................. 17 3.2.3 Tạo kit PCR để phát hiện gen halothan trên heo ............................................ 17 3.3 Vật liệu và hóa chất ................................................................................................. 17 3.3.1 Nguồn mẫu chiết xuất DNA ........................................................................... 17 3.3.2 Các primer sử dụng ......................................................................................... 18 4 3.3.2.1 Đối với gen trên nhiễm sắc thể giới tính của bò .................................. 18 3.3.2.2 Đối với gen thụ thể estrogen trên heo .................................................. 18 3.3.2.3 Đối với gen halothan trên heo ............................................................. 18 3.3.3 Hóa chất .......................................................................................................... 19 3.3.3.1 Hóa chất dùng trong tách chiết DNA .................................................. 19 3.3.3.2 Hóa chất dùng trong điện di ................................................................ 19 3.3.3.3 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR .................................................... 19 3.3.3.4 Hóa chất dùng trong phản ứng cắt enzyme giới hạn HhaI .................. 19 3.3.4 Thiết bị và dụng cụ ......................................................................................... 19 3.4 Phƣơng pháp tiến hành ............................................................................................ 19 3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu ...................................................................................... 19 3.4.2 Thiết lập bộ kit tách chiết DNA ..................................................................... 19 3.4.2.1 Tách chiết DNA từ cơ vân (Lê Thị Thu Phƣơng, 2004) (qui trình I).. 19 3.4.2.2 Phƣơng pháp tối ƣu hóa qui trình tách chiết DNA .............................. 21 3.4.2.3 Xây dựng bộ kit tách chiết DNA ......................................................... 23 3.4.2.4 Hiệu quả của bộ kit tách chiết DNA đối với mô máu và da ............... 24 3.4.2.5 Thực hiện phản ứng PCR .................................................................... 25 3.4.3 Thiết lập bộ kit PCR phát hiện gen halothan trên heo .................................... 27 3.4.3.1 Thiết lập thành phần bộ kit PCR và qui trình dùng bộ kit PCR ......... 27 3.4.3.2 Khảo sát một số đặc tính của bộ kit PCR halothan ............................. 29 3.4.4 Cắt enzym giới hạn ......................................................................................... 30 3.4.5 Điện di và quan sát kết quả ............................................................................. 30 3.4.5.1 Chuẩn bị gel agarose 1,5 % và 2 % ..................................................... 30 3.4.5.2 Điện di và đọc kết quả ......................................................................... 30 3.5 Xử lý số liệu ............................................................................................................ 30 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................... 31 4.1 Kết quả tối ƣu hóa qui trình tách chiết DNA ........................................................... 31 4.1.1 Giảm thời gian ủ mẫu trong dung dịch phân giải tế bào ................................. 31 4.1.2 Giảm thời gian tủa DNA lần 1 ........................................................................ 32 4.1.3 Không thực hiện giai đoạn tủa DNA lần 2 ..................................................... 32 4.1.4 Giảm thời gian hòa tan DNA trong TE ........................................................... 33 4.2 Kết quả thiết lập bộ kit tách chiết DNA .................................................................. 34 4.2.1 So sánh hiệu quả tách chiết DNA theo qui trình bộ kit và qui trình I ........... 34 4.2.1.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR ........................................................ 35 4.2.2 Thử nghiệm tính ổn định của bộ kit ly trích DNA từ cơ vân .......................... 38 4.3 Kết quả thiết lập bộ kit PCR phát hiện gen halothan .............................................. 39 4.3.1 Kết quả khảo sát nồng độ glycerol trong Master Mix 2X .............................. 39 4.3.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ bảo quản Master Mix 2X ...................................... 41 4.3.3 Kết quả khảo sát độ nhạy của bộ kit PCR halothan ........................................ 42 4.3.4 Hiệu quả của bộ kit PCR halothan với DNA tách chiết từ máu và da ............ 44 4.3.5 Hiệu quả kinh tế của bộ kit tách chiết DNA và bộ kit PCR halothan ............. 46 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 48 5.1 Kết luận.................................................................................................................... 48 5.2 Đề nghị .................................................................................................................... 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 49 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 52 5 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp: base pair ctv: cộng tác viên DNA: deoxyribonucleic acid DTT: dithiothreitol EDTA: ethylene diamine tetra acetate NST: nhiễm sắc thể OD: optical density PCR: polymerase chain reaction SDS: sodium dodecyl sulfate Taq: Taq polymerase TBE: Tris borate EDTA TE: Tris EDTA TN: Thí nghiệm Tỷ số OD: tỷ số OD260 nm / OD280 nm UI: unit USD : United States Dollar UV: ultra violet VNĐ : Việt Nam Đồng 6 DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1 Trình tự các đoạn primer cho gen giới tính.................................................... 18 Bảng 3.2 Trình tự cặp primer của gen thụ thể estrogen ................................................ 18 Bảng 3.3 Trình tự cặp primer của gen halothan ............................................................ 18 Bảng 3.4 Những yếu tố thay đổi để tối ƣu hóa qui trình tách chiết DNA từ cơ ........... 22 Bảng 3.5 Thành phần hóa chất trong bộ kit tách chiết DNA ........................................ 23 Bảng 3.6 Thành phần hoá chất PCR .............................................................................. 26 Bảng 3.7 Qui trình phản ứng PCR ................................................................................. 26 Bảng 3.8 Thành phần hoá chất PCR .............................................................................. 27 Bảng 3.9 Qui trình phản ứng PCR ................................................................................. 27 Bảng 3.10 Thành phần hóa chất PCR (Lê Thị Thu Phƣơng, 2004) .............................. 28 Bảng 3.11 Thành phần hóa chất PCR Master Mix 2X .................................................. 28 Bảng 3.12 Hỗn hợp thực hiện 1 phản ứng PCR với bộ kit ............................................ 28 Bảng 4.1 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc theo qui trình tách chiết I và II ...... 31 Bảng 4.2 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc theo qui trình tách chiết I và III ..... 32 Bảng 4.3 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc theo qui trình I và IV ..................... 33 Bảng 4.4 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc theo qui trình I và V ..................... 33 Bảng 4.5 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc theo qui trình I và bộ kit ................ 35 Bảng 4.6 Tỷ lệ thành công khi PCR với primer của gen giới tính ................................ 36 Bảng 4.7 Tỷ lệ thành công khi PCR với primer của gen thụ thể estrogen ................... 36 Bảng 4.8 Kết quả đo OD của DNA tách chiết theo bộ kit ở các thời điểm bảo quản ... 38 Bảng 4.9 Tỷ lệ thành công của phản ứng PCR với Master Mix 2X.............................. 39 Bảng 4.10 Tỷ lệ thành công của phản ứng PCR ở hai phƣơng pháp ............................ 39 Bảng 4.11 Tỷ lệ thành công của bộ kit PCR halothan ở 10oC ...................................... 41 Bảng 4.12 Kết quả PCR ở các nồng độ DNA mẫu ..................................................... 43 Bảng 4.13 Chi phí hóa chất sản xuất bộ kit tách chiết DNA và bộ kit PCR ................. 46 7 DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ HÌNH TRANG Hình 2.1 Heo Pietrain bị stress ........................................................................................ 4 Hình 2.2 Sự tác động của gen halothan lên phẩm chất thịt ............................................. 4 Hình 2.3 Nguyên lý của phản ứng PCR ........................................................................ 11 Hình 2.4 Cấu tạo của glycerol ....................................................................................... 15 Hình 2.5 Cấu tạo của DTT ............................................................................................ 15 Hình 2.6 Cấu tạo của Tween 20 .................................................................................... 16 Hình 3.1 Bộ kit tách chiết DNA .................................................................................... 23 Hình 3.2 Bộ kit PCR halothan ....................................................................................... 27 Hình 4.1 Sản phẩm PCR gen giới tính từ DNA tách chiết của hai qui trình ................. 37 Hình 4.2 Sản phẩm PCR gen thụ thể estrogen từ DNA tách chiết của hai qui trình .... 37 Hình 4.3 Sản phẩm PCR gen halothan ở hai nồng độ glycerol ..................................... 41 Hình 4.4 Sản phẩm PCR gen halothan ở hai nhiệt độ bảo quản ................................... 42 Hình 4.5 Sản phẩm PCR gen halothan ở các nồng độ DNA mẫu ................................. 43 Hình 4.6 Sản phẩm PCR gen halothan từ mẫu máu ...................................................... 44 Hình 4.7 Sản phẩm PCR gen halothan từ mẫu da ......................................................... 44 Hình 4.8 Sản phẩm cắt enzym giới hạn HhaI của gen halothan ................................... 45 BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1 DNA tách chiết theo qui trình I và II ......................................................... 31 Biểu đồ 4.2 DNA tách chiết theo qui trình I và III ........................................................ 32 Biểu đồ 4.3 DNA tách chiết theo qui trình I và IV ....................................................... 33 Biểu đồ 4.4 DNA tách chiết theo qui trình I và V ......................................................... 34 Biểu đồ 4.5 DNA tách chiết theo qui trình I và qui trình bộ kit .................................... 35 Biểu đồ 4.6 Hiệu quả tách chiết DNA của bộ kit ở các thời điểm bảo quản ................. 38 8 PHẦN I. MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Thế kỷ 21 đƣợc đánh giá là thế kỷ của công nghệ sinh học, không thể phủ nhận những tác động to lớn và đầy tiềm n