Luận văn So sánh phát triển của nấm men saccharomyces.sp phân lập từ tự nhiên và saccharomyces.cerevisia

TR NG I H C C N TH Ơ KHOA NÔNG NGHI P& SINH H C NG D NG LU N V N T T NGH ÊP NGÀNH CÔNG NGH TH C PH M SO SÁNH PHÁT TRI N C A N M MEN SACCHAROMYCES.SP PHÂN L P T T NHIÊN VÀ SACCHAROMYCES.CEREVISIA Gi ng viên h ng d n Th.S. NHAN MINH TRÍ Th.S. NGUY N B O L C NM 2005 i LI C M T Xin chân thành c m t Th.S Nhan Minh Trí và Th.s Nguy n B o L c là nh ng gi ng viên c a B Môn Công Ngh Th c Ph m – Khoa Nông Nghi p và Sinh H c ng D ng - Tr ng i H c C n Th ơ ã t n tình hng d n và truy n t nh ng kinh nghi m quí báu giúp em có th hoàn thành t t lu n v n t t nghi p này. Xin chân thành c m ơn quý Th y Cô c a Tr ng i H c C n Th ơ trong nh ng n m qua ã truy n t nh ng ki n th c r t quí báu em có th b c vào i m t cách t tin có th làm vi c và ph n u c t t sau này. Chân thành c m ơn các cán b phòng thí nghi m B Môn Công Ngh Th c Ph m – Khoa Nông Nghi p và Sinh H c ng D ng - Tr ng i H c C n Th ơ. C m ơn các b n sinh viên l p Công Ngh Th c Ph m K26 ã giúp tôi trong su t th i gian qua. TP.C n Th ơ, ngày 06 tháng 06 n m 2005 Sinh viên th c hi n Nguy n i D ơ ng ii MC LC Trang Li c m t ......................................................................................... i Mc l c .............................................................................................. ii Danh sách b ng ................................................................................. iii Danh sách hình ................................................................................. iv Tóm t t .............................................................................................. v Ch ơ ng 1 T V N ................................................................. 1 t v n ........................................................................... 1 Mc tiêu nghiên c u ............................................................ 1 Ch ơ ng 2 LƯC KH O TÀI LI U .................................................. 2 1.Nguyên li u ...................................................................... 2 Nho ............................................................................. 2 Nm men .................................................................... 2 2.Khái quát quá trình lên men r u ..................................... 6 3.C ơ ch quá trình lên men .................................................. 7 4. Khái quát v r u vang ................................................... 7 5. H vi sinh v t trong lên men r u vang t nhiên ............. 8 6. M t s n m men th ng g p trong s n xu t r u vang .... 9 7. Yêu c u i v i ch n n m men thu n ch ng .................... 10 8. Các y u t nh h ng t i n m men trong lên men ru vang ................................................................................ 10 Ch ơ ng 3 PH ƯƠ NG TI N VÀ PH ƯƠ NG PHÁP NGHIÊN C U ............................................... 12 1. Ph ơ ng ti n thí nghi m.................................................... 12 2. Ph ơ ng pháp thí nghi m .................................................. 13 Sơ thí nghi m ......................................................... 13 chu n b môi tr ng nuôi c y n m men ...................... 13 B trí thí nghi m ......................................................... 16 Ch ơ ng 4 KT QU VÀ TH O LU N .................................... 19 Ch ơ ng 4 KT LU N VÀ NGH ........................................ 28 TÀI LI U THAM KH O iii CH Ơ NG I T V N 1. t v n Ru vang là m t lo i r u nh c lên men t d ch ép trái cây, là m t th c u ng có giá tr dinh d ng cao, h ơ ng v th ơm ngon và có l i cho s c kh e con ng i khi dùng m t cách iu . Trên th gi i, nh t là các n c Châu Âu, r u vang ã có t lâu i và c dùng r t ph bi n. Nh ng n c ta, s n ph m r u vang v n ch a c quan tâm nhi u, qui mô s n xu t ch y u d i d ng th công, lên men t nhiên ch a có c ơ s khoa h c c ng nh ph ơ ng pháp h p lí d n n n ng su t c ng nh ch t l ng s n ph m ch a cao. Vi s phát tri n c a khoa h c k thu t, công ngh s n xu t r u bia c ng ã có s phát tri n m nh m . Trong quá trình s n xu t r u truy n th ng, r u nho c lên men t nhiên do nhi u chúng n m men có s n trên trái nho. s n ph m n nh và t ch t l ng cao, các nghiên c u c n ph i c ti n hành nh m phân l p và ch n nh ng gi ng nâm men t i u. Phân l p m t vi sinh v t là quá trình tách riêng tng vi sinh v t ó t m u v t ho c qu n th vi sinh v t ban u thu nh n gi ng dng thu n khi t. Sau ó các gi ng này c cho lên men trong d ch nho và kh o sát c tính và t c phát tri n trong iu ki n khác nhau . T tr c n nay, nhi u nghiên c u s n xu t r u nho t n m men thu n ch ng S accharomyces.cerevisiaee là lo i n m men c bán ngoài th tr ng s n xu t bánh mì. Do ó tài ch n loài này nghi n c u và so sánh t c lên men c ng nh ch t l ng s n ph m r u thu c t n m men Saccharomyces.cerevisiaee và n m men phân l p gi ng Saccharomyces sp t t nhiên (trên v trái nho). Vi c nghiên c u xem trong 2 gi ng n m men trên gi ng nào có ho t l c lên men m nh nh t, ch t l ng cao nh t, có th t o ra m t r u có ch t l ng tt h ơn, ang là m t nhu c u thi t th c nh m nâng cao hi u su t len men c ng nh ch t l ng sn ph m. 2. M c tiêu nghiên c u T nh ng iu trình bày trên, m c tiêu c a tài là: 2.1 Kh o sát t c phát tri n c a n m men, c n t o thành cùng s thay i pH c a d ch qu nho theo th i gian khi ti n hành lên men d ch qu bng gi ng n m men Saccharomyces sp c phân l p t t nhiên (trên v trái nho) và Saccharomyces cerevisiae . 2.2 So sánh t c phát tri n, c n t o thành i v i hai gi ng n m men kh o sát trên. Qua ó kh o sát nh h ng c a y u t pH ban âu c a d ch qu n tc c a t ng gi ng n m men và so sánh. iv CH Ơ NG II LC KH O TÀI LI U 1. Nguyên li u 1.1 Nho Trong s n xu t r u vang, nho là m t nguyên li u truy n th ng r t c a thích và có giá tr dinh d ng cao. Nho c tr ng nhi u các n c Châu Âu nh t là Pháp và M . n c ta nho c ng ã c tr ng m t s t nh mi n Trung và ang phát tri n ngh tr ng nho v i y tri n v ng phía tr c. Trên qu nho có r t nhi u lo i n m men có m t m t cách t nhiên là nhân t chính tham gia vào quá trình s n xu t r u vang nho lên men t nhiên truy n th ng. Qu nho ép c 85 – 95% d ch qu . N c nho lên men t o ra m t lo i ru vang có giá tr dinh d ng cao, h ơ ng v c tr ng, th ơm ngon và màu sc r t p. Nho có thành ph n hóa h c trung bình nh sau: - Nc : 70 – 80% - ng : 10 – 25% (trong ó ch y u là glucose, fructose và saccharose) - Acid h u c ơ : 0,5 – 1,7% (ch y u là acid malic và factoric) - Protein : 0,1 – 0,9% - Pectin : 0,1 – 0,3% - Khoáng : 0,1 – 0,5% - Vitamin : C, B 1, B 2, PP - Các h p ch t màu: màu chính là anthocyanin. - Các h p ch t th ơm và m t s h p ch t khác. Nho là lo i qu lí t ng nh t lên men ch bi n r u vang vì: - Qu nho có ch t l ng, giá tr dinh d ng cao, t o h ơ ng v m à, c tr ng. - Thành ph n hóa h c trong d ch nho r t thích h p cho n m men phát tri n. - T l d ch n c ép c cao. 1.2. N m men Nm men là tên chung ch nhóm n m men có c u t o và sinh s n b ng cách n y ch i và phân c t. Chúng phân b r ng rãi kh p n ơi. c bi t chúng có m t nhi u t tr ng nho và các n ơi tr ng hoa qu . Ngoài ra th y chúng có v mt trên trái cây chín, trong nh y hoa, trong không khí và c n ơi s n xu t r u vang. 1.2.1 Hình d ng và kích th c - Hình d ng t bào n m men Nm men th ng có hình d ng khác nhau, th ng có hình c u, hình elip, hình tr ng, hình b u d c và c hình dài. M t s loài n m men có t bào hình dài n i v i nhau thành nh ng d ng s i g i là khu n ty ( Mycelium ) hay khu n ty gi ( Pseudo mycelium ). Tuy nhiên hình d ng c a chúng không n nh, ph thu c vào tu i c a n m men và iu ki n nuôi c y. - Kích th c t bào n m men T bào n m men th ng có kích th c r t l n g p t 5 – 10 l n t bào vi khu n. Kích th c trung bình - Chi u dài: 9 – 10 µ m - Chi u r ng: 2 – 7 µ m Kích th c c ng thay i, không ng u các loài khác nhau, các la tu i khác nhau và iu ki n nuôi c y khác nhau. 1.2.2. C u t o t bào n m men T bào n m men c ng nh nhi u lo i t bào khác c c u t o ch y u t các ph n c ơ b n nh sau: - Thành t bào: c u t o t nhi u thành ph n khác nhau. Trong ó ch yu là: glucan, manan, protein, lipid và m t s thành ph n nh khác nh kitin, volutin,… - Màng nguyên sinh ch t: g m các h p ch t ph c t p nh protein, phospholipit enzyme permeaza… - Ch t nguyên sinh: thành ph n c u t o ch y u là n c, protit, gluxit, lipit và các mu i khoáng, enzyme và có các c ơ quan trong ó. - Nhân t bào - Nh ng thành ph n – cơ quan con khác: không bào, ty l p th , riboxom,… 1.2.3.S sinh s n c a n m men Nm men có m t s hình th c sinh s n sau: - Sinh s n b ng cách n y ch i. - Sinh s n b ng cách phân ôi. - Sinh s n b ng bào t và s hình thành bào t . + Ti p h p ng giao + Ti p h p d giao vi + Sinh s n ơn tính 1.2.4. Phân lo i n m men Ch y u có hai l p: n m men th t ( Ascomyces ) và l p n m men gi (Fungi imporfecti ) - Lp n m men th t (l p Ascomyces – lp n m túi): + Ph n l n n m men dùng trong công nghi p thu c l p Ascomyces , a s thu c gi ng Saccharomyces . + Gi ng Endomyces + Gi ng Schizosaccharomyces - Lp n m men gi ( Fungi imporfecti – nm men b t toàn) + Crytococus (toscula, tornlopsis) + Mycoderma + Eandida + Geotrichum (ã c x p vào l p n m m c) + Rhodotorula 1.2.5. Các quá trình sinh lí c a t bào n m men * Sinh d ng c a n m men Cu t o c a t bào n m men thay i khác nhau tùy theo loài, tu i và môi tr ng s ng, nh ng nhìn chung bao g m: - Nc: 75 – 85% - Ch t khô: 15 – 25% . Trong ó ch t khoáng chi m 2 – 14% hàm lng ch t khô. Bảng I.1. Thành ph ần hóa h ọc c ủa n ấm men Các ch t Thành ph n (% ch t khô) Cacbon 49,8 CaO 12,4 Nitro 6,7 Hydro 3,54 P2O5 2,34 K2O 0,04 SO 3 0,42 MgO 0,38 Fe 2O3 0,035 SiO 0,09 Ngu n: L ng, Nguy n c, 1996 vii Nm men c ng nh các sinh v t s ng khác c n oxy, hydro, cacbon, nit ơ, phospho, kali, magiê,… - Dinh d ng Cacbon Ngu n Cacbon cung c p là các lo i ng khác nhau: saccarose, maltose, lactose, glucose… Hô h p hi u khí: C6H12 O6 + 6O 2 6CO 2 + 6H 2O + 674 cal Hô h p k khí C6H12 O6 2CH 3CH 2OH + 2CO 2 + 33 cal - Dinh d ng oxy, hydro: c cung c p cho t bào t n c c a môi tr ng nuôi c y hay d ch. - Dinh d ng Nit ơ: Nm men không có men ngo i bào phân gi i protid, nên không th phân c t albumin c a môi tr ng mà ph i cung c p nit ơ d ng hòa tan, có th là m h u c ơ ho c vô c ơ. D ng h u c ơ th ng dùng là acid amin, pepton, amid, urê. m vô c ơ là các mu i amon kh nitrat, sulfat… - Các vitamin và ch t khoáng: Ch t khoáng có nh h ng to l n n ho t ng s ng c a n m men + Phospho: có trong thành ph n nucleoprotein, polyphosphat c a nhi u enzyme c a s n ph m trung gian c a quá trình lên men r u, chúng to ra liên kt có n ng l ng l n. + L u hu nh: tham gia vào thành ph n m t s acid amin, albumin, vitamin và enzyme. + Magiê: tham gia vào nhi u ph n ng trung gian c a s lên men. + S t: tham gia vào các thành ph n enzyme, s hô h p và các quá trình khác. + Kali: ch a nhi u trong n m men, nó thúc y s phát tri n c a n m men, tham gia vào s lên men r u, t o iu ki n ph c h i phosphorin hóa c a acid pyruvic. + Mangan: óng vai trò t ơ ng t nh magiê. * C ơ ch v n chuy n các ch t dinh d ng vào trong t bào n m men Nm men hoàn toàn không có c ơ quan dinh d ng riêng bi t, các ch t dinh d ng mà nó s d ng ch y u c v n chuy n qua thành t bào theo hai con ng c ơ b n - Th m th u b ng: trên thành t bào n m men có nh ng l nh , nh ng l này có tác dng làm cho ch t dinh d ng v n chuy n vào trong t bào t môi tr ng bên ngoài nh áp su t th m th u, ng c l i ch t th i trong quá trình trao i c ng c th i ra theo con ng này. viii - Hp thu ch ng: các thành ph n dinh d ng không có kh n ng xâm nh p vào t bào theo con ng th nh t thì l p t c có h permeaza ho t hóa. Permeaza là m t protid ho t ng, chúng liên k t v i ch t dinh d ng t o thành h p ch t và h p ch t này chui qua thành t bào trong, t i ây chúng l i tách ra và permeaza l i ti p tc v n chuy n ti p. * Quá trình sinh tr ng và phát tri n - S sinh tr ng Trong quá trình nuôi c y, trong iu ki n dinh d ng y , t bào n m men t ng nhanh v kích th c và ng th i sinh kh i c tích l y nhi u. - S phát tri n Các n m men sinh s n b ng ph ơ ng pháp nhân ôi th ng cho l ng sinh kh i r t l n sau m t th i gian ng n. Trong tr ng h p sinh s n theo ph ơ ng pháp này thì trong d ch nuôi c y s không có t bào già. Vì r ng t bào c phân chia thành hai c nh v y t bào lúc nào c ng tr ng thái ang phát tri n. T bào ch già khi môi tr ng thi u ch t dinh d ng và t bào không có kh n ng sinh s n n a. Tuy nhiên a s n m men sinh s n b ng ph ơ ng pháp n y ch i nên hi n tng phát hi n t bào già r t rõ. Khi ch i non tách kh i t bào m s ng c lp thì n ơi tách ó trên t bào m t o thành m t v t s o. V t s o này s không có kh n ng t o ra ch i m i. C nh v y t bào m s chuy n thành t bào già theo th i gian. xác nh s l ng t bào n m men phát tri n theo th i gian hi n nay ng i ta dùng nhi u ph ơ ng pháp khác nhau nh : + Xác nh s l ng t bào b ng ph ơ ng pháp m tr c ti p trên kính hi n vi hay gián ti p trên m t th ch. + o c c a t bào trong dung d ch nuôi c y trên c ơ s xây d ng mt th chu n c a m t t bào… Quá trình sinh tr ng c a n m men trong d ch lên men t nh có th chia làm 5 giai on: N t H1.1.Quá trình sinh tr ng và phát tri n c a n m men • Giai on ti m phát: giai on này t bào làm quen v i môi tr ng, sinh kh i ch a t ng nhi u. ix • Giai on logarit: ây là giai on phát tri n r t nhanh, sinh kh i tng ào t, kèm theo s thay i m nh m c a d ch lên men. • Giai on ch m d n: t c sinh tr ng n m men gi m d n, thành ph n d ch lên men còn l i ít, các s n ph m lên men c tích t nhiu. • Giai on n nh: s l ng t bào n m men không t ng n a, t c sinh s n b ng t c ch t. • Giai on ch t: t c ch t t ng nhanh, t c sinh s n r t ít do ó s lng t bào n m men gi m d n. 1.2.6. Các hình th c hô h p c a n m men n m men hô h p là quá trình hô h p khá ph c t p, nó x y ra theo hai chi u h ng khác nhau. Vì th ng i ta phân thành 2 lo i hô h p : hô h p hi u khí và hô h p y m khí. 2. Khái quát v quá trình lên men r u Lên men là m t quá trình trao i ch t d i tác d ng c a các enzyme tơ ng ng g i là ch t xúc tác sinh h c. Tùy theo s n ph m tích t sau quá trình lên men mà ng i ta chia làm nhi u ki u lên men khác nhau. Tuy nhiên có hai hình th c lên men chính là lên men y m khí và lên men hi u khí. Lên men r u là quá trình lên men y m khí v i s có m t c a n m men, chúng s chuy n hóa ng lên men thành ethanol và CO 2. Quá trình lên men r u chia làm hai th i k chính: - Th i k phát tri n sinh kh i: giai on này v i s có m t c a oxy, t bào n m men phát tri n sinh kh i. - Th i k lên men chuy n ng thành r u và CO 2: giai on này n m men h p th các ch t dinh d ng và s d ng các enzyme s n có c a mình th c hi n xúc tác sinh h c trong quá trình trao i ch t duy trì s s ng, t o thành ru và CO 2. x 3. C ơ ch c a quá trình lên men Glucose Hexokinaza Glucose – 6 – phosphat Photphoglucoza isomeraza Fructose – 6 – phosphat PhosphoFructokinaza Fructose – 1,6 – diphosphat Aldolaza Triophosphat izomeraza Glyceraldehyd – 3 – phosphat Dihydro aceton phosphat Glyceraldehyd phosphatdehydrogenaza Acid – 1,3 – diphosphoglyceric Phosphoglyceratkinaza Acid – 3 – phosphoglyceric Phosphoglycerat-mutaza Acid – 2 – phosphoglyceric Enoiaza Acid phosphoenolpyruvic Pyruvat kinaza Acid – enol – pyruvic Acid pyruvic Pyruvate – decarboxylaza Ethanal Aldodeshydrogenaza Ethanol Hình II.1. C ơ ch ế phân h ủy đường trong t ế bào n ấm men 4. Khái quát v r u vang xi Sn xu t r u vang d a trên c ơ s v hóa sinh x y ra trong quá trình lên men các lo i n c qu d i tác d ng c a enzyme c a n m men. Trong n c qu (nho, m n, dâu, d a, m ơ…) có ch a ng glucose, fructose, các ch t pectin, các acid h u c ơ (acid tartric, malic, succinic) và mu i ca nh ng acid này, các ch t màu, h p ch t ch a nit ơ (protein, acid amin), vitamin c ng nh các mu i khoáng… Trong quá trình lên men ng trong d ch qu c n m men s d ng t ng sinh kh i và t ng h p m t s s n ph m (r u, khí CO 2 và glycerin, acid acetic, acid lactic, este etylacetat). Các alcol b c cao, aldehyd acetic c to thành t các acid amin. Các ch t pectin b th y phân kéo theo s t o thành mt l ng nh metanol. Lên men r u vang th ng chia thành các giai on: lên men chính nhi t t 20 – 30 0C kho ng 10 ngày ho c dài h ơn. cu i giai on lên men chính d ch lên men trong d n vì protein và pectin l ng xu ng. Lên men ph nhi t t 15 – 18 0C. Khi l ng c n hoàn toàn, d ch trong thì g n, l c xong s c r u vang có th u ng c, nh ng ch a ngon, c n ph i tàng tr nhi t 4 – 10 0C r u vang hoàn thi n h ơ ng v c tr ng. Th i gian tàng tr có th là vài tháng, vài n m, th m chí hàng ch c ho c hàng tr m n m. Ng i ta chia r u vang theo màu s c, theo hàm l ng ng có trong ru ho c theo c n: Theo màu s c: có vang tr ng, vang . Theo l ng ng còn l i trong r u có: vang chát hay vang khô (h t ng) và vang ng t (còn ng). Ngoài ra còn có r u vang n p CO 2 ho c gi CO 2 trong lên men. Sn xu t r u vang d a trên c ơ s bi n i hóa sinh x y ra trong quá trình lên men các lo i n c qu d i tác d ng c a h enzyme c a n m men. Hi n nay, có hai ph ơ ng pháp lên men r u vang c ơ b n: lên men t nhiên và lên men nh các ch ng n m