Luận văn Tách dòng và xác định trình tự nucleotit một số đoạn trong genome của virut vàng lùn lúa (rgsv) tại Việt Nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -------------- Nguyễn Ngọc Sơn TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA VIRUT VÀNG LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -----  ----- NGUYỄN NGỌC SƠN TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA VIRUT VÀNG LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Trung Nam Viện Công nghệ sinh học (IBT) Thái Nguyên - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố. Tác giả Nguyễn Ngọc Sơn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Trung Nam (Viện Công nghệ Sinh học) đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS. TS Lê Trần Bình, TS. Chu Hoàng Hà, TS. Nguyễn Hữu Cường, KS. Hoàng Thị Thu Hằng và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm đồng thời hỗ trợ tôi trong suốt thời gian thực nghiệm và hoàn thành khóa luận này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS. Nguyễn Như Cường (Viện Bảo vệ Thực vật) chủ nhiệm đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu đặc tính sinh học của virut gây bệnh và môi giới truyền bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá, các biện pháp quản lý tổng hợp cây trồng (ICM) trong sản xuất lúa” đã cung cấp mẫu bệnh và cộng tác trong quá trình tôi thực hiện công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học sư phạm – Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sau đại học, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, các thày cô giáo, và cán bộ trong Khoa đã truyền đạt kiến thức cũng như tạo điều kiện cho tôi được thực hiện khóa luận này. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tác giả luận văn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ 2 MỤC LỤC .............................................................................................................. 3 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. 5 DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... 7 MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 9 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 11 1.1. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VL&LXL TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM .. 11 1.1.1. Thế giới ............................................................................................... 11 1.1.2. Việt Nam ............................................................................................. 12 1.2. TRIỆU CHỨNG LÖA NHIỄM BỆNH VL&LXL ...................................... 13 1.3. ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC LOẠI VIRUT GÂY BỆNH VL&LXL Ở LÖA ..... 14 1.3.1. Virut vàng lùn lúa (RGSV) ............................................................... 14 1.3.2. Các loại virut khác ............................................................................. 16 1.3.2.1. Virut lùn xoắn lá lúa (RRSV)....................................................... 16 1.3.2.2. Virut tungro hình cầu (RTSV) ..................................................... 17 1.3.2.3. Virut tungro hình nhộng (RTBV) ................................................ 18 1.4. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA RẦY NÂU – MÔI GIỚI CHỦ YẾU TRUYỀN BỆNH VL&LXL .............................................................................. 19 1.4.1. Đặc điểm hình thái ............................................................................ 19 1.4.2. Đặc điểm sinh học, sinh thái và gây hại ............................................ 19 1.5. PHÕNG TRỪ BỆNH VL&LXL ................................................................. 20 1.6. MỘT SỐ ENZYM VÀ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU BỆNH VIRUT .......................................................................... 21 1.6.1. Một số enzym sử dụng trong sinh học phân tử ................................. 21 1.6.2. Kỹ thuật RT-PCR .............................................................................. 22 1.6.3. Kỹ thuật PCR ..................................................................................... 23 1.6.4. Kỹ thuật biến nạp plasmit vào E.coli ................................................ 24 1.6.5. Kỹ thuật tách dòng gen ...................................................................... 24 1.6.6. Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR) ...................... 25 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 26 2.1. VẬT LIỆU .................................................................................................. 26 2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM .......................................................... 27 2.2.1. Hóa chất .............................................................................................. 27 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 2.2.2. Thiết bị ................................................................................................ 27 2.2.3. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 27 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 27 2.3.1. Thu mẫu thí nghiệm ........................................................................... 27 2.3.2. Thiết kế mồi đặc hiệu ......................................................................... 28 2.3.3. Tách chiết RNA tổng số của virut ở lúa ............................................ 28 2.3.4. Phản ứng RT-PCR ............................................................................. 29 2.3.5. Tạo plasmit tái tổ hợp mang gen mong muốn (Ligation) ................. 29 2.3.6. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt................................................................................. 30 2.3.7. Colony-PCR........................................................................................ 31 2.3.8. Tách chiết plasmit .............................................................................. 32 2.3.9. Cắt gen bằng enzym giới hạn............................................................. 32 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................. 34 3.1. THIẾT KẾ MỒI.......................................................................................... 34 3.2. TÁCH DÕNG CÁC ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV ................... 34 3.2.1. RT-PCR .............................................................................................. 34 3.2.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α ............. 37 3.2.3. Chọn lọc plasmit tái tổ hợp bằng colony-PCR .................................. 37 3.2.4. Tách plasmit và cắt kiểm tra sự có mặt của gen ............................... 39 3.3. XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT CỦA MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV ..................................................................................... 40 3.4. SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN CP-RGSV CỦA HAI TỈNH NINH THUẬN VÀ BÌNH THUẬN VỚI CÁC TRÌNH TỰ TƢƠNG ỨNG TRÊN GENBANK. 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................. 46 CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ ................................................. 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 48 PHỤ LỤC ............................................................................................................. 53 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT µg microgram µl microlitre µm micrometer bp base pair cDNA Complementary DNA (DNA bổ sung đƣợc tổng hợp nhờ enzym phiên mã ngƣợc từ RNA thông tin) CS Cộng sự CLRRI Cuulong Delta Rice Research Institute (Viện nghiên cứu lúa đồng bằng sông Cửu Long), CP/NCP Coat protein/Nucleocapsid Protein (Protein vỏ) Đ/c Đối chứng ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long DEPC Diethyl pyroCarbonate DNA Deoxyribonucleic acid DPV Description of Plant Viruses (Miêu tả các virus thực vật), EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid ELISA Enzyme linked immunsorbent assay (kỹ thuật hấp thụ miễm dịch liên kết với enzym) g gram ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses (Ủy ban quốc tế về phân loại virus). ICTVdB The Universal Virus Database of the International Committee on Taxonomy of Viruses (Ngân hàng dữ liệu về virus của ICTV), IPTG Isopropylthio-β-D-galactoside IRRI International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu Lúa quốc tế), Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 Kb Kilobase LB Luria và Bertani M Nồng độ mol/lit ml mililitre mm milimeter NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Quốc gia về thông tin Công nghệ Sinh học), ng Nanogram nm Nanometer PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PEG Polyethylene glycon RdRp RNA dependent RNA polymerase (Enzym nhân bản RNA và tạo ra phân tử RNA) RGSV Rice grassy stunt virus (Virut vàng lùn lúa) RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease RRSV Rice ragged stunt virus (Virut lùn xoắn lá lúa) RSV Rice stripe virus RT- PCR Reverse transcription polymerase chain reaction (phản ứng PCR phiên mã ngƣợc) RTBV Rice tungro bacilliform virus (Virut tungro hình nhộng) RTSV Rice tungro spherical virus (Virut tungro hình cầu) RWSV Rice wilted stunt virus (Virut héo lùn lúa) TAE Tris - Acetate – EDTA Taq Thermus aquaticus v/p vòng/phút vcRNA viral complementary RNA (đoạn RNA bổ sung của virus) VL&LXL Vàng lùn, lùn xoắn lá vRNA viral RNA (đoạn RNA của virus) X-gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Cây lúa bị bệnh vàng lùn, bụi lúa giảm chồi........................................ 13 Hình 1.2. RGSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử............................................ 15 Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc bộ gen của RGSV......................................................... 16 Hình 1.4. RRSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử............................................. 17 Hình 1.5. RTSV và RTBV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử............................ 18 Hình 1.6. Các giai đoạn phát triển của rầy nâu..................................................... 19 Hình 2.1. Các điểm thu mẫu lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL tại Nam Trung Bộ.... 26 Hình 2.2. Sơ đồ vectơ pBT ................................................................................. 30 Hình 3.1. Điện di sản phẩm RT-PCR phân đoạn 1 và 4 của RGSV từ mẫu của tỉnh Bình Thuận bằng 2 cặp mồi RNA1-RGSV và RNA4-RGSV....................... 35 Hình 3.2. Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP của RGSV bằng cặp mồi CP-RGSV 36 Hình 3.3. Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP của RGSV bằng cặp mồi CP-RGSV 36 Bảng 3.1. Trình tự mồi sử dụng để nhân một số đoạn trong genome RGSV… 34 Bảng 3.2. Mã số đăng ký trên GenBank của các trình tự đã thu đƣợc............... 41 Bảng 3.3. Hệ số tƣơng đồng và sai khác giữa trình tự nucleotit của gen CP- RGSV tại Bình Thuận, Ninh Thuận với các trình tự tƣơng ứng của các tỉnh ĐBSCL và thế giới (GenBank).......................................................................... 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 Hình 3.4. Khuẩn lạc E.coli DH5α mang vectơ tái tổ hợp của các dòng CP của RGSV tỉnh Bình Thuận trên môi trƣờng LB đặc................................................. 37 Hình 3.5. Điện di sản phẩm colony-PCR các dòng RGSV bằng cặp mồi pUC 18.. 38 Hình 3.6. Điện di sản phẩm colony-PCR từ các dòng của phân đoạn 1 và 4 RGSV bằng cặp mồi pUC 18............................................................................... 38 Hình 3.7. Điện di sản phẩm cắt plasmit mang gen CP của RGSV bằng BamHI.................................................................................................................. 39 Hình 3.8: Điện di sản phẩm cắt plasmit mang phân đoạn 1 và 4 của RGSV tại Bình Thuận bằng BamHI..................................................................................... 40 Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên việc so sánh trình tự 02 gen CP- RGSV Nam Trung Bộ (NT, BT) với các trình tự tƣơng ứng của ĐBSCL và thế giới đã đƣợc đăng ký vào GenBank........................................................... 43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Lúa gạo là nguồn lƣơng thực giàu chất dinh dƣỡng chủ yếu trên thế giới, đứng thứ ba sau ngô và lúa mì về sản lƣợng, cung cấp trên 20% calo, 15% protein, các chất khoáng và chất xơ cho con ngƣời. Năm 2009, Việt Nam dự kiến sẽ tiếp tục đứng thứ hai thế giới về xuất khẩu gạo (khoảng 5,3 triệu tấn/năm) và tổng sản lƣợng đạt khoảng 36 triệu tấn/năm [62]. Khoảng 52% diện tích lúa đƣợc trồng ở ĐBSCL. Khi đánh giá về những thành tựu đạt đƣợc trong sự nghiệp đổi mới kinh tế ở Việt Nam, các nhà kinh tế thế giới đều thống nhất nhận định: Thành công lớn nhất là nông nghiệp và cây lúa vẫn luôn là cây lƣơng thực quan trọng bậc nhất của Việt Nam. Tuy nhiên, sản lƣợng lúa bị giảm sút nghiêm trọng bởi các bệnh virut do rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal) lây truyền, đặc biệt là bệnh VL&LXL xảy ra trong thời gian gần đây. Bệnh này do sự tổ hợp từ một đến bốn loại virut gây ra, gồm virut vàng lùn lúa (Rice Grassy Stunt Virus- RGSV), virut lùn xoắn lá lúa (Rice Ragged Stunt Virus- RRSV), virut tungro hình cầu (Rice Tungro Spherical Virus- RTSV) và virut tungro hình nhộng (Rice tungro bacilliform virus- RTBV) [8], [43], [48], [59]. Trong một số trƣờng hợp, cây lúa bị nhiễm cùng một lúc 2 đến 4 loại virut này. Trong đó, RGSV thƣờng chiếm tỷ lệ cao nhất. Từ năm 2006 đến nay dịch bệnh lại phát triển rộng ở các tỉnh ĐBSCL với diện tích nhiễm rất lớn. Do ảnh hƣởng của dịch bệnh này trên cây lúa, năm 2009 Việt Nam có nguy cơ tiếp tục bị giảm sản lƣợng gạo xuống 1 triệu tấn so với năm 2008 [12]. Rất nhiều thành tựu đã đạt đƣợc trong nghiên cứu các biện pháp phòng chống rầy nâu- môi giới chủ yếu truyền bệnh VL&LXL nhƣ: nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh thái học của rầy nâu, các biện pháp phòng trừ bằng thuốc hóa học, sinh vật học, kỹ thuật canh tác, giống kháng... Tuy nhiên, hiệu quả của các phƣơng pháp này vẫn chƣa cao. Do dịch bệnh VL&LXL đang gây hại nặng nề về sản lƣợng lúa gạo cho các tỉnh ĐBSCL [7] và có nguy cơ lây lan ra các khu vực lân cận, nên nhiệm vụ cấp bách là phải kiểm tra sự có mặt của các chủng virus gây bệnh tại khu vực Nam Trung Bộ, nơi có diện tích trồng lúa khá lớn và tiếp giáp với ĐBSCL. Đồng thời, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 đánh giá độ tƣơng đồng di truyền của các chủng virut gây bệnh, góp phần vào việc đề ra những biện pháp đối phó kịp thời với dịch bệnh tại khu vực miền Trung. Với những lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài : “Tách dòng và xác định trình tự nucleotit một số đoạn trong genome của virut vàng lùn lúa (RGSV) tại Việt Nam”. 2. Mục tiêu Phân lập và so sánh trình tự nucleotit của một số đoạn trong genome của virut vàng lùn lúa (RGSV). 3. Nội dung nghiên cứu 1> Tách dòng, xác định trình tự một số đoạn trong genome của chủng RGSV. 2> So sánh các trình tự nucleotit của gen CP- RGSV thu đƣợc với các trình tự tƣơng ứng trên GenBank để đánh giá độ tƣơng đồng về mặt di truyền giữa các chủng virut. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VL&LXL TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.1.1. Thế giới Từ thập kỷ 70 của thế kỷ XX trở lại đây, rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal) đã nổi lên nhƣ một vấn đề thời sự trong nghề trồng lúa ở Châu Á. Nhiều trận dịch rầy đã xảy ra trên quy mô rộng lớn chƣa từng thấy ở nhiều nƣớc nhƣ Ấn Độ, Indonesia, Triều Tiên, Nhật Bản, Philippin, Đài Loan... gây tổn thất nặng nề về kinh tế [17]. Rầy nâu phá hại làm giảm một phần năng suất, hoặc khi cháy rầy làm mất trắng. Ngoài tác hại trực tiếp, rầy nâu còn là môi giới truyền bệnh virut nguy hiểm cho cây lúa nhƣ bệnh VL&LXL, bệnh héo lùn cây lúa ở Trung Quốc và bệnh vàng lá lúa ở vùng núi phía Bắc Việt Nam. Theo thống kê của Dyck và Thomas (1979) thiệt hại do rầy nâu và bệnh vàng lụi ở Châu Á trong năm 1966 – 1975 lên tới hơn 300 triệu USD [22]. Năm 1966, RGSV lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở Nam và Đông Nam châu Á [43]. Năm 1977, dạng héo lùn do RWSV xuất hiện ở vụ mùa thứ hai ở Đài Loan, biểu hiện cây lúa bệnh và hình thái, cấu tạo của RWSV tƣơng tự RGSV [20]. Năm 1974 – 1977, khoảng 1,2 triệu ha lúa ở Indonesia bị nhiễm rầy và virut, gây thiệt hại 03 triệu tấn thóc [40]. Năm 1992 – 1993 cả vụ mùa giống SP60 ở Thái Lan bị mất do tác hại của rầy nâu [50]. Rầy nâu mang các loại virut gây bệnh trên cây lúa nhƣ RGSV và RRSV, nên có nguy cơ gây “cháy rầy” làm giảm đáng kể năng suất cây trồng. Hai phƣơng pháp truyền thống đƣợc sử dụng để bảo vệ cây lúa là phun thuốc trừ sâu và dùng giống cây kháng rầy. Dùng thuốc trừ sâu hóa học đắt, độc hại và ô nhiễm môi trƣờng, do đó biện pháp trồng cây lúa mang gen kháng rầy thông qua lai giống đƣợc nghiên cứu và áp dụng rộng rãi. Tinjuangjun và CS (2000) đã chuyển gen gna thành công vào hai giống gạo Thái Lan là Khao Dawk Mali 105 (KDML 105) và Supanburi 60 (SP60), 37% số lƣợng rầy giảm đi khi gna biểu hiện bằng promoter RSs1 và 42% khi gna biểu hiện bằng promoter Ubi-1 [50]. Tuy nhiên, việc trồng lúa mang gen kháng rầy đang gặp trở ngại do sự thay đổi đặc điểm thích nghi nhanh chóng của rầy nâu. Tại các Hội nghị quốc tế về rầy nâu họp tại IRRI- Philippin (05/1977), Việt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 Nam (11/2001), Trung Quốc (11/2002) và Việt Nam (04/2006), rầy nâu đƣợc coi là mối đe dọa thƣờng xuyên đối với sản xuất lúa ở Châu Á [41], [61]. 1.1.2. Việt Nam Bệnh VL&LXL trên lúa đƣợc ghi nhận sớm nhất tại Mỹ Tho và Long An vào năm 1963. Tại miền Bắc, bệnh đƣợc ghi nhận trong những năm 1964, 1966 và 1970 trên giống Mộc Tuyền với diện tích khá lớn (khoảng 50.000 ha) [8]. Bệnh cũng xuất hiện và gây thiệt hại 20.000 ha vụ Hè Thu 1990 tại vùng ven biển miền Trung nhƣ Bình Định, Phú Yên và Khánh Hoà. Năm 1999 có 13.120 ha lúa bị nhiễm ở các tỉnh Bến Tre, TPHCM, Bạc Liêu và Long An, riêng TPHCM có 242 ha bị bệnh và không trổ bông đƣợc [9]. Đầu vụ Hè Thu 2006 dịch bệnh lại phát triển và lan rộng trên hầu hết các tỉnh ĐBSCL, với mật số rầy nâu rất cao, diện tích bị nhiễm bệnh vàng lụi riêng tại Đồng Tháp với thiệt hại dƣới 30% là 613 ha, và trên 30% là 2636 ha trong đó tiêu huỷ khoảng 500 ha [54]. Cuối năm 2006, dịch bệnh VL&LXL đã đƣợc công bố ở ĐBSCL và miền Đông Nam bộ. Bệnh VL&LXL lây lan trên lúa vụ Thu Đông và vụ Đông Xuân ở các tỉnh vùng ĐBSC