Luận văn Thử nghiệm điều chế auto-Vaccine phõng tiêu chảy do e. coli trên heo con sau cai sữa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM ĐIỀU CHẾ AUTO-VACCINE PHÕNG TIÊU CHẢY DO E. coli TRÊN HEO CON SAU CAI SỮA Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: CAO VĂN HÕA Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************ THỬ NGHIỆM ĐIỀU CHẾ AUTO-VACCINE PHÕNG BỆNH TIÊU CHẢY DO E. coli TRÊN HEO CON SAU CAI SỮA Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI CAO VĂN HÕA Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM TẠ Đề tài nghiên cứu này tuy Con làm còn nhiều thiếu sót và chƣa tốt nhƣng Con cũng xin dành tặng ba mẹ. Đây là kết quả mà 22 năm ba mẹ làm lụng để nuôi dạy con. Con hy vọng món quà bé nhỏ này sẽ làm vui và vơi bớt phần nào nỗi khổ cực, lo âu của ba mẹ. Con trai của ba mẹ yêu ba mẹ nhiều lắm. Em xin chân thành cảm tạ Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trƣờng. Và ngƣời có ảnh hƣởng rất lớn đến sự hoàn thành đề tài này là thầy Hải (TS. Nguyễn Ngọc Hải). Em cám ơn thầy rất nhiều về những gì mà thầy đã dành cho em. Em đến với thầy trong một hoàn cảnh rất khác với các bạn, nhƣng với sự quan tâm hƣớng dẫn ân cần của thầy đã giúp em có nhiều nghị lực và niềm vui mà vƣợt qua các giai đoạn khó khăn. Khi làm việc với thầy, em không chỉ học hỏi đƣợc ở thầy kiến thức, kỹ năng mà em còn thấy ở thầy nhiều đức tính cao đẹp để em học tập. Thầy có lối sống thật đơn giản, nhƣng thầy rất giàu tình cảm và đức hy sinh. Thầy là một Nhà Giáo mẫu mực đầu tiên mà em đƣợc gặp. Em xin cảm ơn TS. Lê Anh Phụng, ThS. Trần Thị Bích Liên, cô Lê Thị Hà và BSTY. Nguyễn Thị Kim Loan đã giúp đỡ và cho em điều kiện thực hiện đề tài này. Em cũng xin cảm ơn Ban lãnh đạo và các anh chị ở công ty Gia Nam đã nhiệt tình giúp em hoàn thành đề tài này. Và các bạn của tôi (Uyên, Thái, Phi, Linh, Vy), những ngƣời đã chia sẻ, giúp đỡ tôi khi gặp khó khăn. Cuối cùng, anh cám ơn Em. Em luôn bên cạnh cổ vũ khi anh mệt mỏi và động viên khi anh cảm thấy chán. Em là nguồn tinh thần vô cùng quý báu của anh. CAO VĂN HÒA Tp. Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2007 iv TÓM TẮT CAO VĂN HÕA. Đề tài: “Thử Nghiệm Điều Chế Auto-Vaccine Phòng Bệnh Tiêu Chảy Do E. coli Trên Heo Con Sau Cai Sữa”. Thời gian: 01/05/2007 - 02/08/2007. Địa điểm: phòng thí nghiệm vi sinh, Bộ môn Vi Sinh – Truyền Nhiễm, khoa Chăn Nuôi – Thú Y, trƣờng đại học Nông Lâm TPHCM và công ty TNHH Gia Nam, huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dƣơng. Hội đồng hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Bƣớc 1, phân lập vi khuẩn E. coli từ các mẫu phân tiêu chảy ở trại heo, các chủng E. coli này sẽ đƣợc kiểm tra sinh hóa bằng nghiệm pháp IMViC và đƣợc định type kháng nguyên F4, F5, F6. Bƣớc 2, lựa chọn 5 chủng E. coli có kết quả phản ứng rõ ràng để sản xuất auto- vaccine. Bƣớc 3, bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả auto-vaccine: Lô 1: 3 bầy heo con, đƣợc tiêm auto-vaccine 1 lần. Lô 2: 3 bầy heo con, đƣợc tiêm auto-vaccine 2 lần. Lô đối chứng: 2 bầy heo con, đƣợc tiêm chất bổ trợ. Việc đánh giá hiệu quả auto-vaccine dựa vào hiệu giá kháng thể, tỷ lệ heo tiêu chảy, tăng trọng trung bình tuyệt đối và các phản ứng phụ sau tiêm, Kết quả: Auto-vaccine thực nghiệm tạo đáp ứng miễn dịch cao và kéo dài. Auto-vaccine thực nghiệm không gây tác dụng phụ sau tiêm và không ảnh hƣởng đến tăng trọng heo con. Chƣa thể đánh giá chính xác đƣợc hiệu quả bảo hộ tiêu chảy do E. coli của auto-vaccine. v SUMMARY CAO VAN HOA, Nong Lam University, HCM city. Graduating thesis topic: “The experiment of auto-vaccine production to protect the post – weaning piglet from the diarrhoea caused by E. coli”. The thesis was carried out at Microbiology lab, Microbiology and Infectious Diseases Dept. of Faculty of Animal Science and Veterinary, Nong Lam University and Gia Nam Ltd. Company, Binh Duong province from 5/2007 to 8/2007. Supervisor: Dr. NGUYEN NGOC HAI First, isolate E. coli from the diarrhoea feces and identify them by IMViC test, then serotype with F4, F5, F6 antiserum. Second, selecte 5 E. coli isolates of serotype F4 or F5 to produce the auto- vaccine. Third, set up the experiment to evaluate the efficiency of auto-vaccine (the experiment was repeated in 2 times): The first group: 3 litters (28 piglets, from 14 to 20 days aged), vaccine injection one times. The second group: 3 litters (28 piglets, from 14 to 20 days aged), vaccine injection two times with 10 days interval. The control group: 2 litters (22 piglets, from 14 to 20 days aged), adjuvant injection two times with 10 days interval. The efficacy of auto-vaccine was evaluated by antiody titers, medium daily gain and the side effects. Result: The auto-vaccine made a high antibody titers and long immunization. The auto-vaccine did not bring neither the bad effects to piglets vaccinated health nor the gain weight of piglet. The results could not conclude exactly the efficacy of auto-vaccine on E. Coli diarrhoea control. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang bìa 1 .............................................................................................................. i Trang bìa 2 ............................................................................................................. ii Lời cảm tạ .............................................................................................................. iii Tóm tắt tiếng Việt ................................................................................................. iv Tóm tắt tiếng Anh .................................................................................................. v Mục lục .................................................................................................................. vi Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................... xii Danh sách các hình .............................................................................................. xiii Danh sách các bảng ............................................................................................. xiv Danh sách các biểu đồ .......................................................................................... xv Danh sách các sơ đồ ............................................................................................ xvi 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1 1.2. Mục đích và yêu cầu ....................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích ....................................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu ......................................................................................................... 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................. 3 vii 2.1. Vi khuẩn Escherichia coli ............................................................................... 3 2.1.1. Định nghĩa .................................................................................................... 3 2.1.2. Đặc tính sinh hóa .......................................................................................... 4 2.1.3. Yếu tố kháng nguyên ................................................................................... 4 2.1.3.1. Kháng nguyên thân O................................................................................ 4 2.1.3.2. Kháng nguyên bề mặt hay kháng nguyên K ............................................. 5 2.1.3.3. Kháng nguyên F (fimbriae) ....................................................................... 5 2.1.3.4. Kháng nguyên H hay kháng nguyên lông roi (flagella) ............................ 6 2.2. Bệnh tiêu chảy ................................................................................................. 6 2.2.1. Khái niệm ..................................................................................................... 6 2.2.2. Nguyên nhân gây tiêu chảy .......................................................................... 7 2.2.2.1. Điều kiện ngoại cảnh bất lợi ..................................................................... 7 2.2.2.2. Nuôi dƣỡng không đúng kỹ thuật ............................................................. 7 2.2.2.3. Vi sinh vật ................................................................................................. 8 2.3. Sự miễn dịch.................................................................................................... 9 2.3.1. Khái niệm miễn dịch .................................................................................... 9 2.3.2. Phân loại miễn dịch ...................................................................................... 9 2.3.2.1. Miễn dịch không đặc hiệu ......................................................................... 9 2.3.2.2. Miễn dịch đặc hiệu .................................................................................. 10 2.3.3. Khái niệm về kháng nguyên (antigen) và kháng thể (antibody) ................ 11 viii 2.3.3.1. Kháng nguyên (antigen) .......................................................................... 11 2.3.3.2. Kháng thể (antibody)............................................................................... 13 2.4. Auto-vaccine ................................................................................................. 16 2.4.1. Định nghĩa vaccine ..................................................................................... 16 2.4.2. Phân loại vaccine ........................................................................................ 16 2.4.2.1. Vaccine giảm độc lực (attenuated) .......................................................... 16 2.4.2.2. Vaccine bất hoạt (inactivated) ................................................................. 16 2.4.2.3. Các “toxoid” ............................................................................................ 17 2.4.2.4. Vaccine từng phần hay vaccine dƣới đơn vị (subunit) ........................... 17 2.4.2.5. Một số loại vaccine mới đang nghiên cứu .............................................. 17 2.4.3. Định nghĩa auto-vaccine ............................................................................ 18 2.4.4. Quy trình sản xuất auto-vacine .................................................................. 18 2.4.5. Ƣu điểm và nhƣợc điểm của việc sản xuất, sử dụng auto-vaccine ............ 18 2.4.5.1. Ƣu điểm ................................................................................................... 18 2.4.5.2. Nhƣợc điểm ............................................................................................. 19 2.5. Chất bổ trợ ..................................................................................................... 19 2.5.1. Định nghĩa chất bổ trợ ................................................................................ 19 2.5.2. Tác dụng của chat bổ trợ ............................................................................ 20 2.5.3. Chất bổ trợ MONTANIDE (chất bổ trợ đƣợc sử dụng trong đề tài này)... 20 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ............................................. 21 ix 3.1. Thời gian và địa điểm .................................................................................... 21 3.1.1. Thời gian .................................................................................................... 21 3.1.2. Địa điểm ..................................................................................................... 21 3.2. Vật liệu .......................................................................................................... 21 3.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu................................................................................. 21 3.2.2. Vật liệu và thiết bị ...................................................................................... 21 3.3. Nội dung ........................................................................................................ 22 3.4. Phƣơng pháp tiến hành .................................................................................. 22 3.4.1. Phƣơng pháp lấy mẫu ................................................................................. 22 3.4.2. Nghiên cứu vi sinh vật ............................................................................... 23 3.4.2.1. Nuôi cấy phân lập .................................................................................... 23 3.4.2.2. Kiểm tra sinh hóa .................................................................................... 23 3.4.3. Điều chế auto-vaccine ................................................................................ 28 3.4.4. Kiểm tra độ vô trùng của auto-vaccine ...................................................... 30 3.4.5. Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả auto-vaccine ..................................... 30 3.4.5.1. Yếu tố thí nghiệm .................................................................................... 30 3.4.5.2. Phân phối heo vào các lô thí nghiệm ...................................................... 30 3.4.6. Phƣơng pháp kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm ......................................................................................... 32 3.4.6.1. Lấy mẫu máu và bảo quản ...................................................................... 32 3.4.6.2. Chuẩn bị dịch kháng nguyên ................................................................... 33 x 3.4.6.3. Tiến hành phản ứng ................................................................................. 34 3.4.6.4. Đọc kết quả ............................................................................................. 34 3.5. Các chỉ tiêu theo dõi ...................................................................................... 35 3.6 Xử lý số liệu ................................................................................................... 36 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................... 37 4.1. Kết quả lựa chọn chủng E. coli làm auto-vaccine ......................................... 37 4.2. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm ...................................................................... 38 4.3. Hiệu giá kháng thể ........................................................................................ 39 4.3.1. Thí nghiệm 1 .............................................................................................. 39 4.3.1.1. Lần rút máu thứ nhất ............................................................................... 40 4.3.1.2. Lần rút máu thứ hai ................................................................................. 40 4.3.1.3. Lần rút máu thứ ba .................................................................................. 41 4.3.2. Thí nghiệm 2 .............................................................................................. 43 4.3.2.1. Lần rút máu thứ nhất ............................................................................... 43 4.3.2.2. Lần rút máu thứ hai ................................................................................. 44 4.3.2.3. Lần rút máu thứ ba .................................................................................. 44 4.3.3. Kết quả tổng kết hiệu giá kháng thể ........................................................... 46 4.4. Tỷ lệ heo tiêu chảy ........................................................................................ 47 4.4.1. Thí nghiệm 1 .............................................................................................. 47 4.4.2. Thí nghiệm 2 .............................................................................................. 48 xi 4.5. Tăng trọng tuyệt đối ...................................................................................... 50 4.5.1. Thí nghiệm 1 .............................................................................................. 50 4.5.2. Thí nghiệm 2 .............................................................................................. 51 4.5.3. Tổng kết tăng trọng trung bình tuyệt đối của các lô qua 2 thí nghiệm ...... 52 4.6. Các chỉ số khác .............................................................................................. 52 4.7. Kết quả chung ............................................................................................... 52 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................................. 54 5.1. Kết luận ......................................................................................................... 54 5.2. Đề nghị .......................................................................................................... 54 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 55 7. PHỤ LỤC ......................................................................................................... 57 xii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT E. coli: Escherichia coli EMB: Eosin Methylene Blue Lactose KIA: Kligler Iron Agar TSA: Tryptone Soya Agar TSB: Tryptone Soya Broth SCA: Simmons Citrate Agar TN: Thí Nghiệm KT: Kháng Thể IMViC: Indol – Methyl Red – Voges Proskauer – Citrate xiii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 3.1. Lấy mẫu phân tiêu chảy ở heo con ....................................................... 22 Hình 3.2. Phân lập E. coli trên môi trƣờng EMB ................................................ 23 Hình 3.3. Vi khuẩn E. coli lên men lên men đƣờng sinh hơi trong môi trƣờng KIA .................................................................................... 24 Hình 3.4. Vi khuẩn E. coli hình que, màu hồng Gram âm ................................... 24 Hình 3.5. Phản ứng Indol ..................................................................................... 25 Hình 3.6. Phản ứng Methyl Red ........................................................................... 25 Hình 3.7. Phản ứng Voges Proskauer .................................................................. 26 Hình 3.8. Phản ứng Citrate ................................................................................... 26 Hình 3.9. Rút máu heo con ................................................................................... 33 xiv DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1. Tỷ lệ các vi sinh vật gây tiêu chảy trên heo........................................... 8 Bảng 3.1. Phân lô và liều tiêm heo con ................................................................ 31 Bảng 4.1. Hiệu giá kháng thể của 3 lô qua 3 lần rút máu (thí nghiệm 1) ............ 39 Bảng 4.2. Hiệu giá kháng thể của 3 lô qua 3 lần rút máu (thí nghiệm 2) ............ 43 Bảng 4.3. Tổng kết hiệu giá kháng thể của 2 thí nghiệm ..................................... 46 Bảng 4.4. Kết quả heo bị tiêu chảy ở thí nghiệm 1 .............................................. 47 Bảng 4.5. Kết quả heo bị tiêu chảy ở thí nghiệm 2 .............................................. 48 Bảng 4.6. Tỷ lệ tiêu chảy của heo toàn thí ng