Luận văn Thử nghiệm khả năng ứng dụng protease từ nội tạng tôm trong sản xuất chitin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG PROTEASE TỪ NỘI TẠNG TÔM TRONG SẢN XUẤT CHITIN Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện : TRẦN THỊ NGỌC HÀ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VĂN BẰNG KỸ SƢ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG PROTEASE TỪ NỘI TẠNG TÔM TRONG SẢN XUẤT CHITIN Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS - TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG TRẦN THỊ NGỌC HÀ ThS. NGUYỄN LỆ HÀ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Ba mẹ và những ngƣời thân trong gia đình đã giúp con có sự thành đạt nhƣ hôm nay. Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm TP. HCM, ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. PGS – TS. Nguyễn Tiến Thắng, ThS. Nguyễn Lệ Hà, CN. Đỗ Thị Tuyến đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. Các anh chị tại phòng Các chất có hoạt tính sinh học đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Bạn Lê Minh Thông, Trƣơng Minh Dũng, Ngô Thị Thu Ngân và Cao Thị Thanh Loan. Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K29 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hổ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. iv TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu “Thử nghiệm khả năng ứng dụng Enzyme protease từ nội tạng tôm trong sản xuất Chitin” đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm Viện Sinh học nhiệt đới, thời gian từ tháng 4 đến tháng 7/2007 với mục đích xem xét Enzyme từ nội tạng tôm có thể dùng để thủy phân, loại protein thay thế cho việc dùng NaOH hay không. Thử nghiệm sản xuất Chitin đƣợc bố trí trên cả 2 loại nguyên liệu là vỏ tôm khô và tƣơi, dƣới cả 2 hình thức khử: khử khoáng trƣớc và khử protein trƣớc. Công đoạn khử khoáng thực hiện bằng cách: xử lý với HCl 10%; trong 5 giờ; ở nhiệt độ phòng; tỷ lệ giữa nguyên liệu vỏ tôm tƣơi và dung dịch HCl là 1:5 (W/V), đối với vỏ tôm khô là 1:10 (W/V). Đối với công đoạn tẩy màu: với KMnO4 1%, H2SO4 10%; trong 1,5 giờ và với Na2S2O3 2%; trong 15 phút. Kết quả đã xác định đƣợc các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân protein vỏ tôm bằng chế phẩm protease thô từ nội tạng tôm nhƣ sau:  Đối với quá trình sản xuất Chitin thực hiện thủy phân protein trƣớc: - Nồng độ Enzyme thủy phân tốt nhất ở cả vỏ khô và vỏ tƣơi là 6%. - Nhiệt độ thủy phân tốt nhất: ở vỏ khô là 550C, ở vỏ tƣơi là 600C. - pH thủy phân tốt nhất ở cả vỏ khô và vỏ tƣơi là 7 - Thời gian thủy phân tốt nhất ở cả 2 loại vỏ là 4 giờ.  Đối với quá trình sản xuất Chitin thực hiện khử khoáng trƣớc: - Nhiệt độ thủy phân tốt nhất: ở vỏ khô là 600C, ở vỏ tƣơi là 550C. - pH thủy phân tốt nhất ở cả vỏ khô và vỏ tƣơi là 7. - Thời gian thủy phân tốt nhất ở cả 2 loại vỏ là 4 giờ. v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ơn .................................................................................................................... iii Tóm tắt .......................................................................................................................... iv Mục lục ........................................................................................................................... v Danh sách các hình ...................................................................................................... viii Danh sách các bảng ....................................................................................................... ix Chƣơng 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1 1.2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................... 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Những khái niệm chung về Enzyme ....................................................................... 3 2.1.1. Đại cƣơng về Enzyme ........................................................................................ 3 2.1.1.1. Lịch sử phát triển ........................................................................................ 3 2.1.1.2. Định nghĩa .................................................................................................... 4 2.1.1.3. Bản chất của Enzyme ................................................................................... 4 2.1.1.4. Phân loại ....................................................................................................... 5 2.1.1.5. Hoạt tính Enzyme ......................................................................................... 6 2.1.2. Đại cƣơng về Enzyme protease .......................................................................... 6 2.1.2.1. Định nghĩa .................................................................................................... 6 2.1.2.2. Nguồn thu nhận ............................................................................................ 7 2.1.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến tốc độ phản ứng thủy phân bằng Enzyme ........ 8 2.1.2.4. Ứng dụng .................................................................................................... 10 2.2. Đại cƣơng về tôm và Enzyme protease từ tôm .................................................... 11 2.2.1. Đại cƣơng về tôm ............................................................................................. 11 2.2.2. Thành phần hoá học trong các phần của tôm ................................................... 14 2.2.3. Enzyme protease từ tôm ................................................................................... 15 2.2.3.1. Tính chất ..................................................................................................... 15 2.2.3.2. Phân loại ..................................................................................................... 17 2.3. Chitin ..................................................................................................................... 17 vi 2.3.1. Đại cƣơng về Chitin ......................................................................................... 17 2.3.2. Đặc tính lý hoá học .......................................................................................... 19 2.3.3. Sự tổng hợp Chitin ở loài giáp xác................................................................... 20 2.3.4. Ứng dụng của Chitin ....................................................................................... 21 2.3.5. Tình hình nghiên cứu Chitin trên thế giới và ở Việt Nam ............................... 23 2.3.5.1. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và tiêu thụ Chitin trên thế giới ................ 23 2.3.5.2. Tình hình nghiên cứu Chitin ở Việt Nam .................................................. 24 2.3.6. Các phƣơng pháp chiết tách Chitin .................................................................. 26 2.3.6.1. Phƣơng pháp hóa học ................................................................................. 26 2.3.6.2. Phƣơng pháp sinh học ................................................................................ 30 Chƣơng 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Địa điểm thí nghiệm .............................................................................................. 32 3.2. Nguyên liệu ........................................................................................................... 32 3.3. Hóa chất và các thiết bị thí nghiệm chủ yếu đã sử dụng ....................................... 33 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................................... 34 3.4.1. Các phƣơng pháp sử dụng trong nghiên cứu .................................................. 34 3.4.1.1. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein theo Bradford .......................... 34 3.4.1.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính Enzyme protease (phƣơng pháp Amano)36 3.4.2. Phƣơng pháp tách chiết và thu nhận Enzyme protease .................................... 38 3.4.3. Phƣơng pháp sản xuất Chitin bằng Enzyme protease từ nội tạng tôm ............ 40 3.4.4. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thủy phân vỏ tôm thích hợp bằng chế phẩm thô protease nội tạng tôm ................................................................................... 42 3.4.4.1. Xác định nồng độ Enzyme thủy phân thích hợp ........................................ 42 3.4.4.2. Xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp ...................................................... 43 3.4.4.3. Xác định pH thủy phân thích hợp ............................................................. 43 3.4.4.4. Xác định thời gian thủy phân thích hợp ..................................................... 44 3.5. Các phƣơng pháp xử lý số liệu .............................................................................. 44 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Quá trình thủy phân vỏ tôm bằng chế phẩm thô protease nội tạng tôm trên vỏ tôm đƣợc thủy phân protein trƣớc ................................................................................ 45 4.1.1. Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme thủy phân .................................................... 45 4.1.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân ................................................................. 47 vii 4.1.3. Ảnh hƣởng của pH thủy phân .......................................................................... 49 4.1.4. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân ................................................................. 51 4.2. Quá trình thủy phân vỏ tôm bằng chế phẩm thô protease nội tạng tôm trên vỏ tôm đƣợc khử khoáng trƣớc ......................................................................................... 52 4.2.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân ................................................................. 52 4.2.2. Ảnh hƣởng của pH thủy phân ......................................................................... 54 4.2.3. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân ................................................................ 55 4.3. Kết quả so sánh hiệu suất và đánh giá cảm quan giữa các mẫu sản phẩm Chitin thu đƣợc ........................................................................................................................ 56 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận ................................................................................................................. 58 5.2. Đề xuất ý kiến ....................................................................................................... 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 60 PHỤ LỤC .................................................................................................................... 61 viii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Tôm .............................................................................................................. 12 Hình 3.1: Nội tạng tôm ................................................................................................. 33 Hình 3.2: Máy ly tâm lạnh ........................................................................................... 33 Hình 3.3: Bể ổn nhiệt ................................................................................................... 33 Hình 3.4: Máy đo quang phổ UV- Vis ......................................................................... 34 Hình 4.1a: Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân đến sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan và hoạt tính Enzyme protease trong quá trình thủy phân vỏ tôm khô ......................................................................................................................... 46 Hình 4.1b: Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân đến sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan và hoạt tính Enzyme protease trong quá trình thủy phân vỏ tôm tƣơi ........................................................................................................................ 46 Hình 4.2a: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô ........................................................ 48 Hình 4.2b: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi ........................................................ 48 Hình 4.3a: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô ..................................................................... 50 Hình 4.3b: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi .................................................................... 50 Hình 4.4a: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô ...................................... 51 Hình 4.4b: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi ..................................... 51 Hình 4.5a: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng .............................. 52 Hình 4.5b: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng ............................. 53 ix Hình 4.6a: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng .......................................... 54 Hình 4.6b: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng .......................................... 54 Hình 4.7a: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng ........... 55 Hình 4.7b: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng .......... 56 Hình 4.8: Nguyên liệu và sản phẩm ............................................................................. 57 Hình 3.5: Đƣờng chuẩn protein .................................................................................... 61 Hình 3.6: Đƣờng chuẩn protease .................................................................................. 61 x DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 4.1a: Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân đến sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan và hoạt tính Enzyme protease trong quá trình thủy phân vỏ tôm khô ......................................................................................................................... 62 Bảng 4.1b: Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân đến sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan và hoạt tính Enzyme protease trong quá trình thủy phân vỏ tôm tƣơi ........................................................................................................................ 62 Bảng 4.2a: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô ........................................................ 63 Bảng 4.2b: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi ........................................................ 63 Bảng 4.3a: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô ..................................................................... 64 Bảng 4.3b: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi .................................................................... 64 Bảng 4.4a: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô ...................................... 65 Bảng 4.4b: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi ..................................... 65 Bảng 4.5a: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng .............................. 66 Bảng 4.5b: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng ............................. 66 Bảng 4.6a: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng ......................................... 67 Bảng 4.6b: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng .......................................... 67 Bảng 4.7a: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng ........... 68 xi Bảng 4.7b: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng ........... 68 xii 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Chitin là polysaccharide đứng thứ hai về lƣợng trong tự nhiên, chỉ sau cellulose. Chitin/Chitosan và các sản phẩm từ chúng hiện nay đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực đời sống nhƣ y - dƣợc học, nông nghiệp, bảo vệ môi trƣờng… Chitin đã đƣợc chiết tách từ hơn một thế kỉ nay, nhƣng cho đến nay việc tách chiết này vẫn đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp hóa học là chính. Phƣơng pháp này có nhƣợc điểm là tốn nhiều hóa chất, chất lƣợng của sản phẩm lại không cao, độc hại cho ngƣời lao động và gây ô nhiễm môi trƣờng. Điều này các nhà môi trƣờng học đã lên tiếng cảnh báo. Trong thời gian gần đây, phƣơng pháp chế biến sinh học, bằng phƣơng pháp công nghệ Enzyme đã đƣợc nghiên cứu và bƣớc đầu áp dụng để thay thế phƣơng pháp hóa học trong sản xuất Chitin nhằm hạn chế những khiếm khuyết do phƣơng pháp hóa học gây ra. Với mức đóng góp 70-80% giá trị tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản Việt Nam, nên hiện nay tôm là mặt hàng chế biến xuất khẩu chủ lực của ngành, chủ yếu là tôm đông lạnh. Tôm là thực phẩm có giá trị dinh dƣỡng cao (chứa 21,04% protein theo nghiên cứu của TS. Nguyễn Việt Dũng về tôm sú) nên nó là mặt hàng rất đƣơc ƣa chuộng trên thị trƣờng thế giới. Theo báo cáo của Bộ Thủy Sản, sản lƣợng tôm năm 2003 là 193.973 tấn. Tùy thuộc vào phƣơng pháp chế biến và sản phẩm cuối cùng, phế liệu tôm có thể chiếm từ 40-70% khối lƣợng tôm nguyên liệu. Tƣơng ứng với sản lƣợng tôm nƣớc ta, hằng năm sẽ có một khối lƣợng tôm khổng lồ gồm đầu và vỏ tôm đƣợc tạo ra. Đặc biệt trong đầu tôm có nội tạng chứa Enzyme protease, Enzyme có hoạt tính rất cao, có khả năng thủy phân protein rất tốt. Ở nƣớc ta hiện nay, nguồn phế liệu đầu và vỏ tôm chƣa đƣợc tận dụng triệt để hoặc chƣa tận dụng những phế liệu này trên quy mô lớn hay không có hƣớng tận dụng trực tiếp nguồn phế liệu này, đầu tôm đƣợc bán với giá rất rẻ hoặc cho, bán không hết phải bỏ đi. 2 Tình trạng trên đặt ra yêu cầu cấp bách cho các nhà khoa học, công nghệ ngành thủy sản là: sử dụng hợp lý và