Luận văn Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME BROMELAIN TỪ VỎ DỨA Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : PHAN THỊ NGỌC CHÂU MSSV: 0811110006 Lớp: 08CSH2 TP. Hồ Chí Minh, 2011 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, khóa luận tốt nghiệp “Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme Bromelain từ vỏ dứa” là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu sử dụng trong khóa luận la trung thực có nguồn gốc cụ thể, rõ ràng. Nội dung khóa luận thực hiện trên cơ sở lý thuyết, kiến thức và co tham khảo thêm một số tài liệu, sách báo và tập chí theo danh mục của khóa luận. Sinh viên thực hiện Phan Thị Ngọc Châu Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu ii MỤC LỤC CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU...........................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề........................................................................................................1 1.2. Mục tiêu dề tài .............................................................................................2 1.2.1. Mục tiêu tổng quát ....................................................................................2 1.2.2. Mục tiêu cụ thể .........................................................................................2 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN....................................................................................3 2.1. Giới thiệu sơ luợc về enzyme...........................................................................3 2.2. Enzyme protease...............................................................................................4 2.2.1.Giới thiệu sơ lược các enzyme protease .....................................................5 2.2.1.1. Protease động vật ...............................................................................5 2.2.1.2 Protease thực vật ................................................................................5 2.2.1.3. Protease vi sinh vật ............................................................................6 2.2.2. Ứng dụng enzyme protease ......................................................................9 2.3. Enzyme bromelain thu nhận từ vỏ dứa .................................................11 2.3.1. Giới thiệu enzyme bromelain .................................................................11 2.3.2. Tính chất vật lí của enzyme bromelain...................................................11 2.3.3. Tính chất hoá học của enzyme bromelain ..............................................12 2.3.3.1. Cấu tạo hoá học................................................................................12 2.3.3.2. Cấu trúc không gian của bromelain .................................................12 2.3.4. Hoạt tính của enzyme bromelain ............................................................13 2.3.4.1. Cơ chế tác động................................................................................13 2.3.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Bromelain .................14 2.3.5. Ứng dụng của enzyme Bromelain ..........................................................15 2.3.5.1. Trong công nghiệp thực phẩm .........................................................15 2.3.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme bromelain .........16 2.3.6.1. Tình hình nghiên cứu enzyme bromelain trong nước......................16 2.3.6.2. Tình hình nghiên cứu enzyme bromelain ngoài nước .....................17 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu iii CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................18 3.1. Vật liệu và hóa chất .......................................................................................18 3.1.1. Nguyên liệu.............................................................................................18 3.1.2. Hóa chất ..................................................................................................18 3.1.3. Thiết bị ....................................................................................................18 3.2. Quy trính tách chiết Enzyme Bromelain .......................................................19 3.2.1. Thuyết minh quy trình ............................................................................20 3.2.2. khảo sát các tác nhân tủa enzyme bằng cồn 960, muối Ammonium sulfate (NH4)2SO4 và aceton (CH3COCH3) .......................................................20 3.2.2.1 Nguyên tắc ........................................................................................20 3.2.2.2. Tủa enzyme bằng cồn 960 ................................................................20 3.2.2.3. Tủa enzyme bằng muối Ammonium sulfate (NH4)2SO4 .................21 3.2.2.4. Tủa enzyme bằng aceton (CH3COCH3)...........................................21 3.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng protein và hoạt tính bromelain từ dịch chiết enzyme ......................................................................................................22 3.2.3.1. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford ..............22 3.3. Enzyme cố định .............................................................................................28 3.3.1. Định nghĩa enzyme cố định ....................................................................28 3.3.2. Tính chất ưu và nhược điểm của enzyme cố định ...................................29 3.2.2.1. Ưu điểm .............................................................................................29 3.3.2.2. Nhược điểm ......................................................................................29 3.3.3. Một số phương pháp cố định enzyme.....................................................30 3.3.3.1. Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định (carrier binding) ........................................................................................................................30 3.3.3.2. Phương pháp hấp thụ vật lí (physical adsorption) ...........................30 3.3.3.4. Phương pháp khâu mạch (cross – linking).......................................32 3.3.4. Cố định enzyme bromelain trên cơ chất Natrialginate bằng phương pháp nhốt ....................................................................................................................33 3.3.4.1. Đặc điểm, tính chất của Natrialginate..............................................33 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu iv 3.3.4.2. Tạo dung dịch Natrialginate 3% ......................................................33 3.3.4.3. Tiến hành cố định.............................................................................33 3.3.4.4. Phương pháp xác định hiệu suất cố định protein và hiệu suất cố định hoạt tính của enzyme cố định.........................................................................33 3.3.5. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố lý hóa đến hoạt tính của enzyme bromelain được cố định trên Natrialginate...........................................34 3.3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH.............................................................34 3.3.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ .....................................................34 3.3.5.3. Khảo sát độ bền nhiệt.......................................................................35 3.3.5.4. Khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định trên Natrialginate .35 3.3.6. Tinh sạch enzyme bromelain bằng sắc ký lọc gel ..................................35 3.3.6.1. Nguyên tắc .......................................................................................36 3.3.6.2. Thiết bị và hóa chất. .........................................................................36 3.3.6.3. Các bước tiến hành...........................................................................36 3.3.6.4. Tính hiệu suất về hoạt tính enzyme Bromelain và độ tinh sạch của enzyme sau tinh sạch bằng sắc ký lọc gel......................................................38 3.3.7. Xác định trọng lượng phân tử enzyme Bromelain bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamid (SDS – PAGE)..................................................39 3.3.7.1. Nguyên tắc .......................................................................................39 3.3.7.2. Thiết bị và hóa chất ..........................................................................39 3.3.7.3. Phương pháp ....................................................................................41 3.3.7.4. Xác định trọng lượng phân tử của enzyme Bromelain ....................43 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................44 4.1. Kết luận .........................................................................................................44 4.2. Kiến nghị .......................................................................................................44 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................46 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Tính chất vật lý của enzyme bromelain.................................................... 11 Bảng 2.2. Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản .................................... 15 Bảng 3.1. Tỷ lệ bằng cồn 96o đối với dịch enzyme từ vỏ dứa .................................. 20 Bảng 3.2. Nồng độ tủa bằng muối (NH4)2SO4 đối với dịch enzyme từ vỏ dứa........ 21 Bảng 3.3. Tỉ lệ tủa bằng aceton đối với dịch enzyme từ vỏ dứa .............................. 22 Bảng 3.4. Bảng số liệu dựng đường chuẩn albumin ................................................ 24 Bảng 3.5. Bảng số liệu dựng đường chuẩn tyrosine ................................................ 26 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Cấu trúc gian của enzyme protease .................................................4 Hình 2.2. Nguồn enzyme protease từ thực vật ................................................6 Hình 2.3. Vi khuẩn Clostridium ......................................................................7 Hình 2.4. Vi khuẩn Bacillus ............................................................................7 Hình 2.5. Nấm mốc .........................................................................................8 Hình 2.6. Xạ khuẩn .........................................................................................8 Hình 3.1. Thiết bị lọc gel áp suất thấp ............................................................35 Hình 3.2. Loại muối trước khi chạy sắc ký .....................................................38 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 1 CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Hầu như mọi phản ứng hóa học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác của enzyme – chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, những nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học ở các lĩnh vực liên quan khác nhằm tìm ra được những công dụng khác nhau của mỗi enzyme. Nghiên cứu về công nghệ enzyme đã được tiến hành bởi nhiều tác giả như sử dụng phủ tạng của lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, tripsin, sử dụng mầm mạ để sản xuất amylase. Đã có những thử nghiệm công nghệ như sản xuất amino acid từ nhộng tằm bằng protease, bột protein thịt bằng enzyme bromelain từ vỏ dứa…. Nghiên cứu enzyme còn có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng, đối với một số bệnh, đặc biệt là bệnh mang tính di truyền, có thể do thiếu hay mất hẳn một hoặc số enzyme trong các mô, các điều kiện không bình thường cũng có thể xuất hiện do hoạt tính dư thừa của một số enzyme đặc hiệu. Do đó xác định hoạt tính của một số enzyme trong huyết tương, hồng cầu hoặc trong các mô là rất quan trọng trong việc chẩn đoán bệnh. Enzyme đã trở thành các công cụ thực tế quan trọng không những trong y học mà cả trong công nghệ hóa học, trong chế biến thực phẩm…Đối với nước ta nguồn enzyme từ thực vật có triển vọng lớn vì nguồn nghiên liệu rất phong phú ( dứa, đu đủ,… ). Trong quá trình chế biến dứa đóng hộp chỉ sử dụng một phần của quả dứa, phần còn lại là phụ phẩm. Nếu tận dụng được nguồn phế phẩm thì vừa có thể giảm thiểu chất hữu cơ gây ô nhiễm môi trường vừa có thể sản xuất sản phẩm enzyme bromelain có từ cây dứa. Enzyme bromelain có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase, esterase có thể phân hủy cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp, chúng có giá trị kinh tế cao. Từ những lợi ích của enzyme bromelain mang lại, được sự chấp nhận của Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, chúng tôi xin tiến hành thực hiện khóa luận “Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa”. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 2 1.2. Mục tiêu dề tài 1.2.1. Mục tiêu tổng quát Quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa. Cố định enzyme bromelain trên Natrialginate. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể Thu nhận dịch enzyme bromelain từ vỏ dứa. Khảo sát các tác nhân tủa enzyme bằng cồn 960, muối Ammonium sulfate ((NH4)2SO4 ) và aceton ( CH3COCH3 ). Cố định enzyme bromelain trên Natrialginate. Tinh sạch enzyme bromelain. Xác định trọng lượng phân tử enzyme bromelain bằng phương pháp điện di. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 3 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1. Giới thiệu sơ luợc về enzyme Enzyme là các chất xúc tác của hệ thống sinh học. Chúng có khả năng xúc tác đặc biệt, thường là mạnh hơn nhiều so với các chất xúc tác tổng hợp. Tác dụng xúc tác của chúng mang tính đặc hiệu đối với cơ chất, làm tăng đáng kể tốc độ các phản ứng hóa học xảy ra trong môi trường nước trong các điều kiện nhiệt độ và pH thích hợp. Enzyme là một trong các chìa khóa để hiểu biết quá trình hoạt động sống của tế bào. Hoạt động trong những trật tự có tính tổ chức cao, chúng xúc tác hàng trăm phản ứng theo trật tự xác định trong các con đường trao đổi chất mà nhờ đó các chất dinh dưỡng bị phân hủy, năng lượng hóa học được lưu dữ và biến đổi, các đại phân tử sinh học được tạo ra từ các chất tiền thân đơn giản. Một số enzyme tham gia trong quá trình trao đổi chất là những enzyme điều hòa, chịu trách nhiệm đối với các tín hiệu trao đổi chất khác nhau bằng cách thay đổi hoạt tính xúc tác của chúng một cách thích hợp. Thông qua hoạt động của enzyme điều hòa các hệ thống enzyme phối hợp chặt chẽ với nhau để tạo ra mối quan hệ hài hòa giữa các hoạt tính trao đổi chất cần thiết cho việc duy trì sự sống. Enzyme có trong mọi cơ thể sinh vật, nó không những làm nhiệm vụ xúc tác cho các phản ứng hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào. Vì có nguồn gốc từ sinh vật cho nên enzyme thường được gọi là chất xúc tác sinh học ( biocatalisateur ) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học khác.Chính nhờ sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hóa học rất khó xảy ra trong điều kiện thường ở ngoài cơ thể (do cần nhiệt độ, áp suất cao, acid mạnh hay kiềm mạnh…) nhưng trong cơ thể nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác trong điều kiện hết sức êm dịu, nhẹ nhàng (370C, áp suất thường, không kiềm mạnh hay acid mạnh…). Đặc tính quan trọng nhất của enzyme là tính đặc hiệu. Tính đặc hiệu là khả năng xúc tác chọn lọc, xúc tác sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định: đặc hiệu cảm ứng và đặc hiệu cơ chất. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 4 Enzyme không thể tổng hợp bằng con đường hóa học. Do đó muốn thu nhận enzyme chỉ có con đường duy nhất là thu nhận từ cơ thể sinh vật. Tất cả các tế bào động vật, thực vật, vi sinh vật đều chứa enzyme nhưng mức độ enzyme thì hoàn toàn khác nhau. Hiện nay người ta khai thác enzyme từ ba nguồn cơ bản: − Nguồn động vật. − Nguồn thực vật. − Nguồn vi sinh vật. 2.2. Enzyme protease Nhóm enzyme protease ( peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptit ( -CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptitde đến sản phẩm cuối cùng là axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển axit amin. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật ( vi khuẩn, nấm, virus) đến thực vật ( đu đủ, dứa…) và động vật ( gan, dạ dày…). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất có thể tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhât . Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng. Hình 2.1. Cấu trúc gian của enzyme protease Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 5 2.2.1.Giới thiệu sơ lược các enzyme protease 2.2.1.1. Protease động vật Tuy tạng: Đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều enzyme nhất. Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm protease tên renin. Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệ phomat. Renin làm biến đổi cazein thành paracasein có khả năng kết tủa trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca2+. Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất. Trong thực tế nhiều chế phẩm renin bị nhiễm pepxin (trong trường hợp thu chế phẩm renin ở bê quá thì khi đó dạ dày bê đã phát triển đầy đủ có khả năng tiết ra pepxin) thì khả năng đông tụ sữa kém đi. Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở các loài Eudothia Parasitica và Mucor Purillus. Các loại nội tạng khác: Gan, lá lách, thận, phổi, cơ hoành tim, dạ con, huyết, các loại bộ phận này đều chứa enzyme chúng tồn tại trong tế bào. Chỉ có một số loại được sản xuất dưới dạng chế phẩm như: gan, tim lợn để tách aspartac-glutamate aminotransferase, huyết tương ( từ huyết ) để tách ra trombia ( Proenzyme chống đông máu ). 2.2.1.2 Protease thực vật Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu được từ nhựa của lá, thân quả đu đủ (Carica papaya) còn bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa ( Pineapple plant ). Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh ( chilling proofing ) do kết tủa protein. Những ứng dụng khác của protease thực vật này là công nghệ làm mềm thịt và trong mục tiêu hóa. Ficin thu được từ nhựa cây cọ ( Ficus carica). Enzyme được sử dụng thủy phân protein tự nhiên. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 6 Hình 2.2. Nguồn enzyme protease từ thực vật. 2.2.1.3. Protease vi sinh vật Enzyme protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn…gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số loại nấm men. ™ Vi khuẩn Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng. Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai lọai trên.