Luận văn Tối ưu quy trình chuyển gene gfp vào vi khuẩn pseudomonas fluorescens bằng phương pháp tiếp hợp ba thành phần

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỐI ƢU QUY TRÌNH CHUYỂN GENE gfp VÀO VI KHUẨN Pseudomonas fluorescens BẰNG PHƢƠNG PHÁP TIẾP HỢP BA THÀNH PHẦN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: TRẦN NGUYỄN THÚY AN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỐI ƢU QUY TRÌNH CHUYỂN GENE gfp VÀO VI KHUẨN Pseudomonas fluorescens BẰNG PHƢƠNG PHÁP TIẾP HỢP BA THÀNH PHẦN Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN TRẦN NGUYỄN THÚY AN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09 / 2007 iii LỜI CẢM ƠN Thành kính ghi ơn ông bà, cha mẹ đã nuôi nấng, dạy bảo con trƣởng thành nhƣ ngày hôm nay, cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo mọi điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Tôi xin chân thành cám ơn: Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Ban chủ nhiệm cùng thầy cô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt mọi kiến thức, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập ở trƣờng. Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hƣớng dẫn và động viên tôi trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp này. Thầy Zhang Liqun ở Đại Học Nông Nghiệp Trung Quốc đã cung cấp mẫu vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp, vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pRK600 và các tài liệu phục vụ cho thí nghiệm. Ban giám đốc cùng các anh chị trực thuộc Trung Tâm Phân Tích – Thí Nghiệm Hóa Sinh Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã hƣớng dẫn và chia sẻ cùng tôi những khó khăn trong thời gian thực hiện khóa luận. Anh Nguyễn Văn Lẫm đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tất cả các anh chị thuộc Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật Khoa Nông Học đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Các bạn bè lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt những năm học cũng nhƣ thời gian thực hiện khóa luận. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2007 Sinh viên Trần Nguyễn Thúy An iv TÓM TẮT Đề tài “Tối ƣu quy trình chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần” do Trần Nguyễn Thúy An, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh thực hiện. Địa điểm: trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 03/2007 đến tháng 08/2007. Pseudomonas fluorescens là tác nhân kiểm soát sinh học đƣợc nghiên cứu nhiều nhất do chúng có khả năng kháng nấm mạnh và có phổ kí chủ rộng. Việc phát triển các phƣơng pháp nhạy để quan sát những tế bào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trong biofilm hay trên rễ cây trồng đóng vai trò quan trọng khi muốn nghiên cứu những hệ thống này. Đáp ứng nhu cầu đó, gần đây những marker phân tử mới đã đƣợc phát triển nhƣ những phƣơng pháp chuyên biệt để đánh dấu sự phân bố, quần thể và hoạt tính chuyển hóa của các vi sinh vật mục tiêu trong môi trƣờng. Trong số những marker này, green fluorescent protein (GFP) từ loài sứa Aequorea victoria đã đƣợc chứng tỏ là công cụ hữu hiệu nhất. Những dòng Pseudomonas fluorescens đƣợc đánh dấu bởi marker GFP có thể dễ dàng quan sát và phát hiện qua kính hiển vi phát huỳnh quang mà không cần phải phá hủy cấu trúc và cũng không cần thêm vào các cơ chất ngoại sinh. Nội dung nghiên cứu 1. Chọn lọc dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có đặc tính đối kháng mạnh với nấm, phát sáng mạnh trên môi trƣờng KB và có khả năng kháng kháng sinh thích hợp cho mục đích nghiên cứu. 2. Khảo sát các điều kiện tối ƣu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần. 3. Thực hiện PCR để kiểm tra sự hiện diện của gene gfp trong vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau khi tiếp hợp. Kết quả đạt đƣợc Chọn đƣợc dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens thích hợp cho mục đích nghiên cứu. Đạt đƣợc quy trình tối ƣu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần. v SUMMARY Tran Nguyen Thuy An, Nong Lam university, Ho Chi Minh city, “Establishing an optimal protocol to transfer gfp gene into Pseudomonas fluorescens by triparental mating”. This subject was conducted at Nong Lam University from March to August in 2007. Pseudomonas fluorescens is the most extensively studied biocontrol-agent because of their strongly antifungal ability and their broad host range. The development of sensitive methods for observing Pseudomonas fluorescens cells in a population in biofilms or in plant roots is of great importance for studying these systems. In response to this problem, novel molecular markers have been developed recently as specific methods for tracing the distribution, population and metabolic activity of target microorganisms in a certain environment. Among them, the green fluorescent protein (GFP) of the jellyfish Aequorea victoria has proved to be the most powerful tool. The GFP-marked Pseudomonas fluorescens strain can be conveniently observed by using fluorescence microscopy to study their behaviour. Researching contents are 1. Selecting the Pseudomonas fluorescens strains which have strongly antifungal ability, appropriate antibiotic resistance and fluoresce under short wave length ultraviolet light. 2. Researching the optimal conditions to transfer gfp gene into Pseudomonas fluorescens by triparental mating. 3. Performing PCR to confirm the gfp gene in Pseudomonas fluorescens after conjugation. Obtaining results The appropriate Pseudomonas fluorescens strains have been selected. The optimal protocol to transfer gfp gene into Pseudomonas fluorescens by triparental mating has been obtained. vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT aa acid amin bp base pair DNA Deoxyribonucleic acid 2,4 – DAPG: 2,4 – Diacetylphloroglucinol ETDA Ethylenediamine tetraacetic acid F Fertility GFP Green Fluorescent Protein Hfr High frequency recombinance IS Insert sequence kb Kilo base kDa Kilo dalton MCS Multi cloning site Nm Nano metre PCR Polymerase Chain Reaction RBS Ribosome binding site RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris Acetate EDTA Tn Tranposon UV Ultraviolet (light) w/v Weight for volume KB King’s B NST Nhiễm sắc thể TGE Transposable genetic element dNTP deoxyribonucleotide_5_triphosphate LB Luria – Bertain vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cơ chế lai giữa F+ và F- ......................................................................................... 7 Hình 2.2 Sự hình thành thể Hfr từ thể F+ ............................................................................ 8 Hình 2.3 Cơ chế lai giữa Hfr và F- ...................................................................................... 8 Hình 2.4 Cơ chế hình thành thể F’ từ thể Hfr .................................................................... 8 Hình 2.5 Cơ chế lai giữa F’và F- .......................................................................................... 9 Hình 2.6 Cấu trúc một trình tự chèn .................................................................................. 11 Hình 2.7 Cấu trúc transposon ............................................................................................. 12 Hình 2.8 Cơ chế phƣơng pháp tiếp hợp 3 thành phần .................................................... 15 Hình 2.9 Cơ chế hoạt động của thiết bị electroporation ................................................. 17 Hình 2.10 Quy trình biến nạp bằng phƣơng pháp CaCl2 ................................................ 18 Hình 2.11 Cấu trúc protein GFP ........................................................................................ 24 Hình 3.1 Cấu trúc plasmid pUT-gfp ......................................................................... 29 Hình 4.1 Khuẩn lạc Pseudomonas fluorescens trên môi trƣờng KB ............................ 36 Hình 4.2 Khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 ....................................................... 38 Hình 4.3 Khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 ....................................................... 39 Hình 4.4 Khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 ....................................................... 40 Hình 4.5 Đối chứng trên môi trƣờng M9 .......................................................................... 41 Hình 4.6 Kết quả đối chứng ............................................................................................... 45 viii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Đặc tính và nguồn gốc một số dòng vi khuẩn và plasmid liên quan trong thí nghiệm ........................................................................................................ 30 Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra tính kháng với kháng sinh kanamycin của một số dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ................................................................. 34 Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra tính kháng với kháng sinh chloramphenicol của một số dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ...................................................... 35 Bảng 4.3 Nguồn gốc các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens thích hợp làm đối tƣợng nghiên cứu .................................................................................. 36 Bảng 4.4 Kết quả đếm số khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 thay đổi theo thời gian nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn ............................................................... 37 Bảng 4.5 Kết quả đếm số khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 thay đổi theo tỉ lệ vi khuẩn ...................................................................................................... 38 Bảng 4.6 Kết quả đếm số khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 thay đổi theo nhiệt độ ủ khi nuôi chung trên môi trƣờng KB ................................................. 40 ix MỤC LỤC Chƣơng 1 ............................................................................................................................... 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1 1.2 Mục đích ....................................................................................................... 2 1.3 Yêu cầu ......................................................................................................... 3 Chƣơng 2 ............................................................................................................................... 4 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................................... 4 2.1 Sự trao đổi thông tin di truyền ở vi khuẩn ................................................... 4 2.1.1 Giới thiệu ....................................................................................................... 4 2.1.2 Những cơ chế chuyển gene ở vi khuẩn .......................................................... 4 2.1.2.1 Biến nạp (transformation) .......................................................................... 4 2.1.2.2 Tải nạp (transduction) ................................................................................ 5 2.1.2.3 Tiếp hợp (conjugation) .............................................................................. 7 2.1.3 Những yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị (transposable genetic element_TGE) .............................................................................................................. 10 2.1.3.1 Đặc tính của những yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị ................... 11 2.1.3.2 Các loại yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị ..................................... 11 2.2 Plasmid ....................................................................................................... 13 2.3 Các phƣơng pháp thƣờng dùng để chuyển DNA plasmid ......................... 15 2.3.1 Phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần (triparental mating) .......................... 15 2.3.2 Phƣơng pháp điện biến nạp .......................................................................... 16 2.3.2.1 Phƣơng pháp ............................................................................................ 16 2.3.3 Phƣơng pháp Calcium chloride.................................................................... 18 2.5 Phòng trừ sinh học bệnh cây và tác nhân phòng trừ sinh học .................... 19 2.5.1 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ............................................................ 20 2.5.1.1 Phân loại vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ......................................... 20 2.5.1.2 Các nghiên cứu về vi khuẩn Pseudomonas fluorescens .......................... 21 2.6 Protein GFP ................................................................................................ 24 2.6.1 Cấu trúc và đặc điểm ................................................................................... 24 2.6.2 Tình hình nghiên cứu về gene gfp ............................................................... 25 Chƣơng 3 ............................................................................................................................. 28 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................. 28 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ................................................................. 28 3.2 Vật liệu và hóa chất, dụng cụ thí nghiệm ................................................... 28 3.2.1 Vật liệu ......................................................................................................... 28 3.2.1.1 Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp ............................. 28 3.2.1.2 Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pRK600 ............................. 29 3.2.1.3 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ........................................................ 29 3.2.2 Các loại môi trƣờng dùng trong nuôi cấy vi khuẩn ..................................... 31 3.2.3 Các loại dụng cụ, thiết bị dùng trong nghiên cứu ........................................ 31 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 31 Chƣơng 4 ............................................................................................................................. 34 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................................. 34 4.1 Kết quả ....................................................................................................... 34 4.1.1 Kết quả kiểm tra tính kháng kháng sinh của vi khuẩn ................................. 34 x 4.1.2 Kết quả kiểm tra khả năng phát sáng trên môi trƣờng KB .......................... 36 4.1.3 Kết quả khảo sát các điều kiện tối ƣu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần ........................ 37 4.1.3.1 Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn .............. 37 4.1.3.2 Khảo sát ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn ................................................ 38 4.1.3.3 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ khi nuôi chung trên môi trƣờng KB ... 39 4.1.3.4 Kết quả đối chứng .................................................................................... 40 4.2 Thảo luận .................................................................................................... 41 4.2.1 Các thông số tối ƣu cho quá trình tiếp hợp .................................................. 41 4.2.2 Cơ chế quá trình tiếp hợp ba thành phần ..................................................... 41 4.2.3 Môi trƣờng tối ƣu cho chọn lọc ................................................................... 43 4.2.4 Kết quả đối chứng ........................................................................................ 42 4.2.5 Quy trình tiếp hợp tối ƣu cho dòng vi khuẩn nhận Pseudomonas fluorescens 1.8 44 Chƣơng 5 ............................................................................................................................. 47 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................................. 47 5.1 Kết luận ...................................................................................................... 47 5.2 Đề nghị ....................................................................................................... 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 48 PHỤ LỤC ............................................................................................................................ 51 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Thuốc trừ sâu hóa học đƣợc sử dụng trong sản xuất nông nghiệp đem lại cho chúng ta năng suất cao và nhiều lợi ích kinh tế, tuy nhiên chúng cũng đem đến những vấn đề nhƣ ô nhiễm môi trƣờng và ảnh hƣởng đến sức khỏe của con ngƣời. Do đó, nhu cầu ngày càng cao trong nông nghiệp là tìm ra phƣơng pháp bảo vệ cây trồng hòa hợp với hệ sinh thái tự nhiên. Kiểm soát sinh học là một sự lựa chọn thay thế có nhiều tiềm năng trong việc ngăn cản sự tàn phá do bệnh cây trồng mà không gây ô nhiễm. Kiểm soát sinh học liên quan đến việc sử dụng vi sinh vật để ức chế bệnh cây và tăng cƣờng sức khỏe cây trồng. Nó đặc biệt thích hợp để ngăn chặn những bệnh từ đất mà việc sử dụng thuốc trừ sâu tổng hợp hóa học cho đến nay vẫn chƣa đem lại hiệu quả. Kháng sinh đƣợc cho là một trong những cơ chế quan trọng nhất trong việc kiểm soát sinh học những bệnh từ đất. Nhiều loài vi khuẩn sử dụng trong những nghiên cứu kiểm soát sinh học là những loài có thể tạo ra kháng sinh. Agrobacterium tạo ra agrocin 84 và 434 có nguồn gốc từ nucleoside. Chủng Baccillus kiểm soát bệnh cây trồng tạo ra lipopeptide fengycin, một phức hợp aminopolyol zwittermycin A và kanosamine. Tác nhân kiểm soát sinh học Pseudomonas là đối tƣợng đƣợc nghiên cứu nhiều nhất về khả năng tạo ra kháng sinh. Chúng tạo ra một chuỗi những kháng sinh phenolic, nhƣ là 2,4- diacetylphloroglucinol (2,4-DAPG), pyoluteorin, pyrrolnitrin, và ít nhất 4 loại phenazine khác nhau. Bên cạnh đó, chúng có phổ kí chủ rộng, bao gồm cà chua, bí, cà rốt, và bắp cải. Những điều kiện trên đem đến cho chúng tiềm năng phát triển nhƣ một loại thuốc trừ sâu sinh học đối với nhiều loại cây trồng. Vì vậy, việc nghiên cứu xác định khả năng định cƣ của vi khuẩn Pseudomonas trên rễ cây trồng 2 rất quan trọng. Cần phát triển một phƣơng pháp hữu hiệu để quan sát những tế bào vi khuẩn riêng lẻ trong một tập đoàn vi khuẩn trong những mô hình thí nghiệm và môi trƣờng tự nhiên nhƣ trong biofilm hay trên rễ cây trồng khi muốn nghiên cứu những hệ thống này. Protein green fluorescent (gfp) từ loài sứa Aequorea victoria đã đƣợc chứng minh là có giá trị trong nhiều nghiên cứu sinh học khác nhau. Theo Bloemberg và ctv (1997) gfp mang lại khả năng nghiên cứu nghiên cứu tế bào mà không phải phá hủy cấu trúc và cũng không cần thêm vào các cơ chất ngoại sinh. Thêm vào đó, những tế bào đƣợc đánh dấu gfp có thể quan sát bằng kính hiển vi có gắn bộ lọc huỳnh quang thông thƣờng nếu đƣợc kích thích ở bƣớc sóng thích hợp, đáp ứng đầy đủ tính chất cho một hệ thống “marker gene”, “reporter gene” nhằm kiểm soát khả năng định cƣ của vi khuẩn đối kháng trên đất hay cây trồng. Để đánh dấu vi khuẩn Pseudomonas fluorescens với marker GFP chúng ta có thể sử dụng nhiều phƣơng pháp, trong đó tiếp hợp ba thành phần là một trong những phƣơng pháp đơn giản, dễ thực hiện và có chi phí thấp.