Luận văn Tuyển chọn, nuôi cấy chủng aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-Β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN HỮU QUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC HÀ NỘI-2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN HỮU QUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Quyền Đình Thi Thực hiện tại: Viện Công nghệ Sinh học Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam HÀ NỘI-2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Quyền Đình Thi trƣởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Phó viện trƣởng Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hƣớng ý tƣởng nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn nghiên cứu, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hóa chất cũng nhƣ trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ Thị Tuyên, CN. Đào Thị Tuyết và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình hƣớng dẫn thí nghiệm, thƣờng xuyên chỉ bảo kiến thức chuyên môn, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi học tập và rèn luyện trong suốt quá trình thực tập. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Sinh trƣờng ĐHSP - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điều kiện chu đáo cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận. Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những ngƣời thân đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có đƣợc kết quả nhƣ ngày hôm nay. Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quí báu đó ! Thái Nguyên, tháng 10 năm 2009 Học Viên Nguyễn Hữu Quân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 2 1.1. ĐỊNH NGHĨA ......................................................................................... 2 1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI............................................................. 2 1.2.1. Nguồn gốc ............................................................................................ 2 1.2.2. Phân loại enzyme ................................................................................. 3 1.3. CẤU TRÚC ............................................................................................. 5 1.3.1. Cấu trúc bậc nhất .................................................................................. 5 1.3.2. Cấu trúc không gian ............................................................................. 6 1.4. CƠ CHẾ XÚC TÁC ................................................................................ 8 1.5. Khái quát về Aspergillus oryzae ............................................................ 10 1.6. Ứng dụng .............................................................................................. 11 1.6.1. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy ...................................... 11 1.6.2. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm .............................................. 12 1.6.3. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi ................................... 13 1.6.4. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ .................................... 14 1.6.5. Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh .............. 14 1.7. ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE ......................................... 16 1.7.1. Nguồn carbon ..................................................................................... 16 1.7.2. Nguồn nitrogen .................................................................................. 17 1.7.3. Nhiệt độ nuôi cấy ............................................................................... 18 1.7.4. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng ........................................................... 18 1.8. TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENZYME ............................................... 19 1.8.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ..................................................................... 19 1.8.2. Ảnh hƣởng của pH ............................................................................. 20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1.8.3. Ảnh hƣởng của các ion kim loại ......................................................... 20 1.8.4. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa ......................... 21 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ...................................... 22 2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT ........................................................ 22 2.1.1. Chủng giống ....................................................................................... 22 2.1.2. Thiết bị ............................................................................................... 22 2.1.3. Hóa chất ............................................................................................. 22 2.1.4. Dung dịch và đệm phá tế bào ............................................................. 23 2.1.5. Môi trƣờng ......................................................................................... 24 2.2. PHƢƠNG PHÁP ................................................................................... 25 2.2.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme ......................................................... 25 2.2.2. Định tính endo-β-1,4-glucanase.......................................................... 25 2.2.3. Xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase............................................ 25 2.2.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng lên khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase .................................................................... 27 2.2.5. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase ................................................ 29 2.2.6. Điện di SDS-PAGE ............................................................................ 30 2.2.7. Xác định tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase ........................... 30 2.2.8. Các phƣơng pháp sinh học phân tử ..................................................... 32 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 36 3.1. Sàng lọc chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4- glucanase cao ............................................................................................... 36 3.2. Phân loại chủng nấm sợi A. oryzae VTCC-F-045 dựa vào đoạn gene 28S rRNA............................................................................................................ 37 3.3. Tối ƣu các điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase ..................... 39 3.3.1. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian ........................... 39 3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng ........................................... 40 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3.3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon ............................................................. 41 3.3.4. Ảnh hƣởng của nồng độ carbon .......................................................... 43 3.3.5. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen .......................................................... 44 3.3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ nitrogen ....................................................... 45 3.3.7. Nhiệt độ nuôi cấy ............................................................................... 46 3.3.8. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy ............................................................... 47 3.4. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase ................................................... 48 3.5. Tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase ............................................ 50 3.5.1. Nhiệt độ phản ứng tối ƣu .................................................................... 50 3.5.2. pH phản ứng tối ƣu ............................................................................. 51 3.5.3. Độ bền nhiệt ....................................................................................... 52 3.5.4. Độ bền pH .......................................................................................... 54 3.5.5. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ ....................................................... 55 3.5.6. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa .................................................... 56 3.5.7. Ảnh hƣởng của ion kim loại ............................................................... 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 59 KẾT LUẬN .................................................................................................. 59 KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 61 TIẾNG VIỆT ............................................................................................... 61 TIẾNG ANH ................................................................................................ 64 PHỤ LỤC .................................................................................................... 69 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ....................................... 22 Bảng 2.2. Các hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ............................... 23 Bảng 2.3. Danh sách các dung dịch và đệm đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 23 Bảng 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của 35 chủng A. oryzae .............. 37 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 42 Bảng 3.2. Tóm tắt quá trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 ..................................................................................... 49 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của ion kim loại lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 57 Bảng 4.1. Đƣờng chuẩn glucose................................................................... 69 Bảng 4.2. Trình tự nucleotide của đoạn gene 28S rRNA từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 ................................................................................................ 69 Bảng 4.3. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian ..................... 70 Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 70 Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 71 Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 71 Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 72 Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng tới khả năng sinh endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 72 Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 72 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Bảng 4.10. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 73 Bảng 4.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 73 Bảng 4.12. Ảnh hƣởng của pH phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 74 Bảng 4.13. Độ bền nhiệt của endo-β-1,4-glucanase...................................... 75 Bảng 4.14. Độ bền pH của endo-β-1,4-glucanase......................................... 76 Bảng 4.15. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 77 Bảng 4.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ tới hoạt tính endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 77 Bảng 4.17. Ảnh hƣởng của ion kim loại tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 78 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc không gian từ trên xuống (A) và từ bên sang (B) của Cel12A từ H. grisea ....................................................................................... 7 Hình 1.2. Cấu trúc vùng liên kết enzyme - cơ chất của Cel12A từ H. grisea .. 8 Hình 1.3. Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của cellulase ......................................................................................................... 9 Hình 1.4. Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase .............. 10 Hình 1.5. Cấu trúc bộ gene của A. oryzae .................................................... 11 Hình 2.1. Đƣờng chuẩn glucose ................................................................... 26 Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 ................................................................................................ 29 Hình 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của một số chủng A. oryzae ........ 36 Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng A. oryzae (A); Sản phẩm Plasmid (B) và Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI (C). ............................................................................................................... 38 Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................... 39 Hình 3.4. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ..................................................................................... 40 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 41 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose đến khả năng sinh tổng hợp endo- β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................... 44 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 45 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng đến khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................. 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh tổng hợp enzyme endo- β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................... 47 Hình 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng tới khả năng sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 48 Hình 3.11. Sắc kí đồ trên cột Sephadex G100 (A) Điện di đồ SDS-PAGE của chủng A. oryzae VTCC-F-045 (B) ................................................................ 49 Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 51 Hình 3.13. Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4-glucanase ở chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 52 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 53 Hình 3.15. Ảnh hƣởng của pH lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ..................................................................................... 54 Hình 3.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 55 Hình 3.17. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 56 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT g Microgram l Microliter APS Ammonium persulphate Cel Cellulose CMC Carboxyl methyl cellulase cs Cộng sự EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid kb Kilobase kDa Kilo Dalton M Marker (thang protein chuẩn) MTK Môi trƣờng khoáng MW Molecular Weight OD Optical density PCR Polymerase chain reaction SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis TEMED N,N’,N,N’- Tetramethyl ethylene diamine Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane U Unit v/v Volume/volume w/v Weight/volume Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU Endo-β-1,4-glucanase là một trong ba dạng của cellulase. Chúng thuộc nhóm enzyme thủy phân, có khả năng phân cắt liên kết β-1,4-glucosidie một cách ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số chất tƣơng tự khác có cầu nối β-glucan. Endo-β-1,4-glucanase phân giải mạnh mẽ cellulose vô định hình. Endo-β-1,4-glucanase đƣợc sinh tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau nhƣ động vật (thuộc các nhóm thân mềm, lợn, gà); thực vật (mầm của các hạt ngũ cốc nhƣ đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật. Tuy nhiên, nguồn thu enzyme chủ yếu vẫn từ vi sinh vật. Vi sinh vật sinh enzyme hết sức đa dạng nhƣ nấm sợi (Aspergillus niger, A. oryzae, A. aculeatus, Trichoderma viride) và vi khuẩn (thuộc họ Bacillus). Endo-β-1,4-glucanase đƣợc ứng dụng rộng rãi vào nhiều ngành khác nhau nhƣ công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy; công nghiệp chế biến thực phẩm; công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi; công nghiệp chế biến dung môi hữu cơ; hay công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh. Với tiềm năng ứng dụng to lớn của endo-β-1,4-glucanase và nguồn vi sinh vật tổng hợp enzyme rất đa dạng, đồng thời nhằm tận dụng các phế phụ phẩm trong nông nghiệp, chúng tôi đã chọn đề tài: Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó Với mục tiêu: a) Tuyển chọn chủng nấm A. oryzae sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase cao; b) Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase ngoại bào từ chủng A. oryzae và xác định tính chất hóa lý của endo-β-1,4- glucanase. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ĐỊNH NGHĨA Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase là một trong ba dạng cellulase. Chúng thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết β-1,4-glucoside bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tƣơng tự khác để giải phóng ra cellulosedextrin, cellobiose và glucose. Enzyme này thể hiện hoạt tính mạnh mẽ trên ce