Luận văn Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR xác định Macrobrachium rosenbergii Nodavirus (MrNV) và Extra small vius (XSV) trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC *****000***** KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KYÕ THUAÄT RT-PCR XAÙC ÑÒNH Macrobrachium rosenbergii NODAVIRUS (MrNV) VAØ EXTRA SMALL VIRUS (XSV) TRÊN TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: PHẠM DUY LÃM Thành Phố Hồ Chí Minh 8/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC *****000***** KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KYÕ THUAÄT RT-PCR XAÙC ÑÒNH Macrobrachium rosenbergii NODAVIRUS (MrNV) VAØ EXTRA SMALL VIRUS (XSV) TRÊN TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN VĂN HẢO PHẠM DUY LÃM Th.S. NGÔ XUÂN TUYẾN Thành Phố Hồ Chí Minh 8/2005 iii LÔØI CAÛM ÔN Em xin chaân thaønh caûm ôn quyù thaày coâ tröôøng Ñaïi Hoïc Noâng Laâm ñaõ taän tình daïy soã, truyeàn ñaït kieán thöùc cho em trong suoát thôøi gian em hoïc taïi tröôøng. Vôùi loøng bieát ôn saâu saéc em xin chaân thaønh caûm ôn thaày Nguyeãn Vaên Haûo, ngöôøi ñaõ taän tình chæ baûo, höôùng daãn vaø giaûi ñaùp nhöõng vaán ñeà khoù khaên vaø taïo ñieàu kieän toát nhaát ñeå hoaøn thaønh luaän vaên toát nghieäp. Em xin caûm ôn Anh Ngoâ Xuaân Tuyeán, chò Trì Thanh Thaûo, anh Cao Thaønh Trung, anh Chu Quang Troïng ñaõ nhieät tình höôùng daãn, trôï giuùp em veà nguyeân vaät lieäu, duïng cuï trong suoát thôøi gian em thöïc hieän ñeà taøi naøy. Em xin caûm ôn anh chò laøm vieäc taïi Trung Taâm Quoác Gia Quan Traéc Caûnh Baùo Moâi Tröôøng vaø Phoøng Ngöøa Dòch Beänh Thuyû Saûn Vieän Nghieân Cöùu Nuoâi Troàng Thuûy Saûn II, phoøng lab DNA TRung Taâm Chaån Ñoaùn YKhoa Hoaø Haûo, caùc anh chò ôû Traïi Thöïc Nghieäm Thuû Ñöùc, ñaõ quan taâm giuùp ñôõ, taïo ñieàu kieän cho em hoaøn thaønh ñeà taøi naøy. Böôùc ñaàu laøm quen vôùi coâng taùc nghieân cöùu khoa hoïc, baûn khoaù luaän naøy khoâng traùnh khoûi nhöõng khieám khuyeát nhaát ñònh, raát mong söï giuùp ñôõ chæ baûo cuõng nhö caùc yù kieán ñoùng goùp cuûa quyù thaày coâ, anh chò vaø caùc baïn sinh vieân. Sau cuøng, em xin caûm ôn gia ñình cuøng beø baïn ñaõ quan taâm, giuùp ñôõ, ñoäng vieân em hoaøn thaønh toát ñeà taøi. TpHCM, thaùng 8 naêm 2005 Sinh vieân Phaïm Duy Laõm iv TÓM TẮT Tôm càng xanh là một trong những đối tƣợng nuôi quan trọng của ngành nuôi trồng thủy sản. Ở Châu Á tôm càng xanh đƣợc mở rộng và tăng cƣờng nuôi với qui mô công nghiệp ở một số nƣớc nhƣ Ấn Độ, Đài Loan, Trung Quốc, Thái Lan, các nƣớc này chiếm sản lƣợng lớn tôm càng xanh của cả thế giới. Sự mở rộng và tăng cƣờng nuôi tôm càng xanh đã làm phát sinh nhiều bệnh mới. Một trong những bệnh mới đƣợc ghi nhận gần đây xuất hiện trong những bể ƣơng tôm càng xanh gây thiệt hại cho ngành công nghiệp nuôi trồng thủy sản ở Ấn Độ, sau đó xuất hiện ở Đài Loan và 5 tỉnh thuộc Trung Quốc. Bệnh này có biểu hiện hơi trắng ở đuôi nên đƣợc gọi là “bệnh trắng đuôi ”. Tác nhân gây bệnh chính là phức hợp hai loại virus Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV). Hiện nay, trong các bể ƣơng tôm càng xanh ở Việt Nam xuất hiện dấu hiệu lâm sàng hơi trắng ở đuôi, các bể này có tỷ lệ chết rất cao. Để xác định nguyên nhân gây chết trong các bể ƣơng có phải là do MrNV và XSV gây ra hay không. Chúng tôi tiến hành thử nghiệm qui trình Single - Step PCR của Widada và Sahul Hameed để xác định có hay không sự hiện diện MrNV và XSV trong mẫu bệnh nghi ngờ là bệnh trắng đuôi. Những kết quả thử nghiệm qui trình Single - Step PCR mà chúng tôi đạt đƣợc có kết quả nhƣ sau:  Xác định đƣợc sự hiện diện đồng thời MrNV và XSV trong mẫu tôm thịt bệnh trắng đuôi đƣợc cung cấp từ Ấn Độ bằng qui trình Single - Step RT - PCR  Khảo sát đƣợc hai qui trình tách chiết bằng AquaPure RNA Isolation Kit và Trizol trên mẫu tôm thịt bệnh trắng đuôi Ấn Độ bằng qui trình Single - StepRT - PCR.  Khảo sát đƣợc nồng độ mồi của hai virus cho phản ứng Single - Step RT- PCR là 20 mol cho MrNV và 20 mol cho XSV.  Khảo sát đƣợc nhiệt độ lai tối ƣu của hai virus cho phản ứng Single - Step PCR là 550C.  Ứng dụng qui trình khảo sát đƣợc trên 50 mẫu tôm càng xanh thu từ thực địa, kết quả phát hiện đƣợc 6 mẫu tôm mẹ, 1 mẫu tôm postlarvae có sự hiện diện đồng thời của MrNV và XSV trong mẫu tôm bệnh trắng đuôi. v ABSTRACT Freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii) plays an economically important role in aquaculture. However, The recent report of new disease in freshwater prawn hatcheries, this disease is responsible for mortalities in hatchery - reared Freshwater Prawn which losses aquaculture industry in India. The disease was reported in Guadeloupe and Martinique (India) subsequently in the five provinces of China. The clinical sign of disease is whitish appearance of the tail and has given rise to the name “White tail disease”. Lately, scientists have been detected a nodavirus - like particles from freshwater prawn suffering from White tail disease (WTD), named Macrobrachium rosenbergii nodavirus. Subsequently a second virus - like particle, named XSV. XSV has always been found associated with the MrNV. Untill, The relationships between these two viruses remain unknown. Although White tail disease (WTD) caused by Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and virus-like particle (XSV) which hasn’t reported in Viet Nam. Therefore In this study, process of Single - Step RT - PCR of Widada and Sahul Hameed. et al was use to identify whether this disease existed in Viet Nam. To optimal of Single - Step RT-PCR of Widada and Sahul Hameed. et al for the laboratory, positive control from India was used. We experimented successful process of Single-Step RT-PCR of Widada and Sahul Hameed. The suitable condition for a Single-Step RT-PCR RT-PCR reaction is 1,5 mM Mg 2+ , 20 mol primer and 55 0 C annealing temperature. Based on this method, 50 samples of freshwater prawn collected in the Thu Duc and other provinces in Mekong Delta were extracted RNA and amplified with two couples of primer MrNV-RNA2-F, MrNV-RNA2-R for MrNV and XSV-F, XSV-R for XSV. Seven samples were confirmed to be infected by MrNV and XSV. In short, MrNV and XSV have been detected in Viet Nam. It is essential to carry out further studies to identify the outbreak conditions and to suggest the treatment methods so that the freshwater prawn farming can be developed. vi Mục lục Lời cảm ơn ....................................................................................................................... iii Abstract ............................................................................................................................ iv Tóm tắt ............................................................................................................................. v Mục lục ............................................................................................................................ vi Danh mục các hình và các bảng ....................................................................................... ix Danh mục các từ viết tắt .................................................................................................. x PHẦN 1. LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 3 2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT GIỐNG TÔM CÀNG XANH TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM .......................................... 3 2.1.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tôm càng xanh trên thế giới ........... 3 2.1.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tôm càng xanh ở Việt Nam ............ 3 2.2. MỘT SỐ BỆNH TRÊN ẤU TRÙNG TÔM CÀNG XANH ............................... 5 2.2.1. Bệnh hoại tử cơ ......................................................................................... 5 2.2.2. Bệnh giữa chu kỳ ấu trùng ........................................................................ 5 2.2.3. Bệnh hoại tử do vi khuẩn .......................................................................... 5 2.2.4. Bệnh phát sáng .......................................................................................... 5 2.2.5. Bệnh lột xác dính vỏ ................................................................................. 6 2.2.6. Bệnh do Protozoa ...................................................................................... 6 2.2.7. Bệnh virus ................................................................................................. 6 2.2.8. Bệnh trắng đuôi ........................................................................................ 6 2.3. NHỮNG PHƢƠNG PHÁP DÙNG TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH TRẮNG ĐUÔI DO VIRUS GÂY RA TRÊN TÔM CÀNG ........................................................................ 10 2.3.1. Phƣơng pháp mô học ................................................................................ 10 2.3.2. Phƣơng pháp lai Dot-lot............................................................................ 10 2.3.3. Phƣơng pháp lai tại chỗ (in situ hybridization) ........................................ 11 2.3.4. Phƣơng pháp Sandwich - ELISA (A sandwich enzyme linked immunosorbent assay) ................................................................................................. 12 2.3.5. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................... 12 2.3.6. Phƣơng pháp RT - PCR (Reverse Transcription Polymerase Reaction) ............... 15 vii PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. NỘI DUNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ................................ 18 3.2. VẬT LIỆU ........................................................................................................... 18 3.2.1. Mẫu tôm .......................................................................................................... 18 3.2.2. Mồi sử dụng cho qui trình ............................................................................... 18 3.2.3. Hạt Bead RT - PCR: Ready - To - Go (Chế phẩm sử dụng ngay) .................. 19 3.2.4. Bộ Kit AquaPure RNA Isolation Kit............................................................... 19 3.2.5. Thang DNA X174 RF Hae III (Boehringer Mannheim) .......................... 20 3.2.6. Hoá chất khác .................................................................................................. 20 3.2.7. Dụng cụ và thiết bị .......................................................................................... 21 3.3. PHƢƠNG PHÁP ................................................................................................. 21 3.3.1. Phƣơng pháp tách chiết RNA virus ................................................................ 21 3.3.1.1. Tách chiết RNA bằng Trizol ................................................................ 21 3.3.1.2. Tách chiết bằng AquaPure RNA Isolation kit (Bio-Rad) .................... 22 3.3.2. Phƣơng pháp Single - Step RT - PCR trên RNA của MrNV, XSV .............. 22 3.3.3. Phƣơng pháp điện di nucleic acid trên gel agarose .................................... 23 3.4. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM ........................................................................................ 24 3.4.1. Thử nghiệm qui trình Single - Step RT-PCR phát hiện MrNV, XSV từ mẫu tôm bệnh (chứng dƣơng) đƣợc cung cấp từ Ấn Độ ............................................ 24 3.4.2. Khảo sát một số điều kiện của qui trình Single - Step RT-PCR ................... 24 3.4.2.1. So sánh hai qui trình tách chiết RNA bằng Trizol (Peter Walker) và AquaPure RNA Isolation Kit (Bio-Rad)................................................................................. 24 3.4.2.2. Khảo sát nồng độ mồi ........................................................................ 25 3.4.2.3. Khảo sát nhiệt độ lai của mồi .............................................................. 25 3.4.3. Ứng dụng qui trình khảo sát đƣợc kiểm tra một số mẫu tôm càng xanh thu thực địa ......................................................................................................................................... 25 viii PHẦN 4. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR PHÁT HIỆN MrNV, XSV TỪ MẪU TÔM BỆNH ĐƢỢC CUNG CẤP TỪ ẤN ĐỘ. .................. 26 4.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN CỦA QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR ..................................................................................................................... 27 4.2.1. Kết quả so sánh hai qui trình tách chiết. .............................................. 27 4.2.2. Kết quả khảo sát nồng độ mồi .............................................................. 30 4.2.3. Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của mồi .................................................. 30 4.3. KẾT QUẢ ỨNG DỤNG QUI TRÌNH KHẢO SÁT ĐƢỢC KIỂM TRA MỘT SỐ MẪU TÔM CÀNG XANH THU THỰC ĐỊA ....................................................................................... 32 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận ............................................................................................................... 36 5.2. Tồn tại ................................................................................................................. 36 5.3. Đề xuất ................................................................................................................ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt .................................................................................................................. 38 Tiếng nƣớc ngoài ........................................................................................................ 39 ix Danh mục hình và các bảng Hình 2.1: Biểu hiện bệnh trắng đuôi ở tôm càng xanh ............................................. 8 Hình 2.2: Vị trí của MrNV trong họ gia đình Nodavirus ........................................... 8 Hình 2.3: Lai tại chỗ bằng cách sử dụng probes MrNV ............................................ 11 Hình 2.4: Phƣơng pháp Single - Step RT - PCR để khuếch đại RNA bằng PCR ........ 17 Hình 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm khuếch đại từ mẫu tôm càng xanh nhiễm MrNV, XSV ............................................................................................................................ 26 Hình 4.2: Kết quả điện di các sản phẩm RT - PCR từ mẫu chứng dƣơng đƣợc tách bằng bộ Kit và Trizol . .................................................................. 28 Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR từ mẫu chứng dƣơng ở các nồng độ mồi khác nhau ........................................................................................................... 29 Hình 4.4: Kết quả điện di khảo sát nhiệt độ lai của mồi trên hai virus MrNV, XSV ............................................................................................................ 30 Hình 4.5: Kết quả điện di phát hiện MrNV và XSV trên một số mẫu tôm càng xanh ..... 33 Hình 4.6: Kết quả điện di mẫu tôm mẹ thu tại Trại Thực Nghiệm Thủ Đức ........... 34 Biểu đồ 2.1: Số lƣợng trại giống và sản lƣợng tôm càng xanh ở ĐBSCL từ 1999 - 2003. ........ .4 Bảng 3.1: Các mồi sử dụng cho phản ứng RT- PCR ................................................. 18 Bảng 3.2: Thang DNA X174 RF Hae III ............................................................... 20 Bảng 3.3: Thành phần hai Mix sử dụng Single - Step RT - PCR ............................ 22 Bảng 3.4: Bảng khảo sát nhiệt độ lai của các mồi .................................................... 25 Bảng 3.5: Các loại mẫu tôm càng xanh thu ở các giai đoạn khác nhau ..................... 25 Bảng 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm RT - PCR đƣợc tách chiết bộ Kit và Trizol .................. 28 Bảng 4.2: Kết quả biểu hiện tín hiệu của sản phẩm của hai dãy nhiệt độ .................. 31 Bảng 4.3: Kết quả thực hiện phản ứng RT - PCR trên 50 mẫu tôm càng xanh ........ 35 x Danh mục các từ viết tắt DNA: Deoxyribonucleic acid ss-DNA: Single strand - Deoxyribonucleic acid RNA: Ribonucleic acid mRNA: Messenger ribonucleic acid cDNA: Complementary deoxyribonucleic acid Bp: Base pair (cặp base) dATP: 2’-deoxyadenosine-5’-triophosphate dCTP: 2’-deoxycytosine-5’-triophosphate dGTP: 2’-deoxyguanine-5’-triophosphate dTTP: 2’-deoxythymine-5’-triophosphate UV: Ultra Violet- tia cực tím TE: Tris-EDTA. DIG: Digoxigenin DEPC: Diethyl Prycacbonat ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long FAO: Food and Agrculture Organization NoV: Nodamura virus BoV: Boolaara virus AhNNV: Atlantic halibut nervous necrosis virus GGNNV: Greasy grouper nerous necrosis virus SJNNV: Striped jack nervous necrosis virus PaV: Pariacoto virus MrNV: Macrobrachium rosenbergii nodavirus XSV: Extra small virus PCR: Polymerase Chain Reaction RT-PCR: Reverse Transcription Polymerase Reaction RFLP: Restriction fragment lenght polymorphism S - ELISA: A sandwich enzyme linked immunosorbent assay Tm: Nhiệt độ lai của mồi 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Kể từ năm 1990 đến nay, bên cạnh sự phát triển của nghề nuôi tôm sú thì tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) đƣợc xác định là một trong những đối tƣợng nuôi thủy sản quan trọng đối với thủy vực nƣớc ngọt Việt Nam, đặc biệt là Đồng Bằng Sông Cửu Long, với lợi thế có diện tích mặt nƣớc ngọt gần 600.000 ha, nhiều sông ngòi, kênh rạch, ao, vƣờn, ruộng. ĐBSCL đƣợc xem là vùng có tiềm năng rất lớn cho nghề nuôi tôm càng xanh. Ở các tỉnh Trà Vinh, Bến Tre, Vĩnh Long, An Giang và Cần Thơ là những tỉnh có nghề nuôi tôm càng xanh phát triển. Theo số liệu thống kê của Bộ Thủy Sản năm 1999, ĐBSCL có 6000 ha diện tích nuôi tôm càng xanh với tổng sản lƣợng trên 2500 tấn và đến 2002 sản lƣợng tôm càng xanh đã tăng nhanh đáng kể với tổng sản lƣợng lên đến 10.000 tấn (Bộ Thủy Sản, 2003). Tuy nhiên, trở ngại lớn nhất hiện nay đối với nghề nuôi tôm càng xanh ở nƣớc ta nói chung và ĐBSCL nói riêng là vấn đề con giống. Từ lâu, ngƣời nuôi vẫn quen sử dụng nguồn giống tự nhiên đƣợc thu gom từ sông rạch, vì thế nguồn giống ngày càng khan hiếm, chất lƣợng không đảm bảo. Do đó, đã có nhiều công nghệ sản xuất giống tôm càng xanh đƣợc đẩy mạnh nhƣ: công nghệ sản xuất giống tôm càng xanh trong ao đất ở vùng nhiễm mặn, sản xuất giống nƣớc xanh và nƣớc xanh cải tiến ở vùng nội đồng, sản xuất tôm càng xanh toàn đực bằng con cái giả thông qua kỹ thuật vi phẫu. Sau những thành công của các công nghệ sản xuất giống, nối tiếp là hàng loạt những trang trại sản xuất giống nuôi thâm canh ra đời, sự khai khác tối đa nguồn nƣớc tự nhiên, sự đáp ứng không đủ về mặt năng lực chuyên môn, nghiêm trọng hơn là áp dụng mô hình nuôi bừa bãi dẫn đến sự giảm thiểu về môi trƣờng, phá vỡ môi trƣờng sinh thái làm phát triển nhanh chóng sự lây lan dịch bệnh. Trong số những tác nhân gây bệnh tìm thấy trên tôm nuôi, virus là một tác nhân quan trọng nhất gây nên sự bùng nổ dịch bệnh (Lightner, 1993). Một trong những virus đƣợc ghi nhận gần đây xuất hiện đầu tiên ở Ấn Độ (Arcier và cộng sự, 1999) gây thiệt hại nghiêm trọng trên các đàn postlarvae ở các trại sản xuất giống (Bonami và cộng sự, 2005), tỷ lệ chết lên đến 100% (Vijayan và cộng sự, 2003). Bệnh do hai loại virus là Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) 2 (Vijayan và cộng sự, 2003) và Extra small virus (XSV)(Qian và cộng sự, 2003) gây bệnh trắng đuôi (White tail disease). Ở Việt Nam chƣa tìm thấy một công bố nghiên cứu nào về hai loại virus trên nhiễm trên tôm càng xanh. Chính vì vậy đƣợc sự đồng ý của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học