Luận văn Vi khuẩn oxy hóa fe(ii) và khử nitrate ở Việt Nam: tính đa dạng và tiềm năng ứng dụng

®¹i häc quèc gia hµ néi Tr­êng ®¹i häc khoa häc tù nhiªn -------------------- NguyÔn ThÞ TuyÒn Vi khuÈn oxy hãa fe(ii) vµ khö nitrate ë viÖt nam: tÝnh ®a d¹ng vµ tiÒm n¨ng øng dông LuËn v¨n th¹c sÜ khoa häc Hµ Néi - 2009 ®¹i häc quèc gia hµ néi Tr­êng ®¹i häc khoa häc tù nhiªn -------------------- NguyÔn ThÞ TuyÒn Vi khuÈn oxy hãa fe(ii) vµ khö nitrate ë viÖt nam: tÝnh ®a d¹ng vµ tiÒm n¨ng øng dông Chuyªn ngµnh: Vi sinh vËt häc M· sè: 60 42 40 LuËn v¨n th¹c sÜ khoa häc Ng­êi h­íng dÉn khoa häc: ts. ®inh thóy h»ng Hµ Néi - 2009 Lêi c¶m ¬n §Ò tµi luËn v¨n ®­îc thùc hiÖn víi sù hç trî kinh phÝ tõ ®Ò tµi §Æc biÖt cÊp §¹i häc Quèc gia Hµ Néi, m· sè QG.07.23. §Ó cã thÓ hoµn thµnh luËn v¨n nµy, tr­íc tiªn, t«i muèn bµy tá láng biÕt ¬n s©u s¾c tíi TiÕn sÜ §inh Thóy H»ng, Tr­ëng phßng Sinh th¸i Vi sinh vËt, ViÖn Vi sinh vËt vµ C«ng nghÖ Sinh häc, §¹i häc Quèc gia Hµ Néi ®· ®Þnh h­íng nghiªn cøu, trùc tiÕp h­íng dÉn vµ chØ b¶o tËn t×nh cho t«i trong suèt thêi gian nghiªn cøu. T«i còng mong muèn ®­îc göi lêi c¶m ¬n ch©n thµnh nhÊt tíi Ban l·nh ®¹o vµ c¸c c¸n bé ViÖn Vi sinh vËt vµ C«ng nghÖ Sinh häc, §¹i häc Quèc gia Hµ Néi ®· t¹o ®iÒu kiÖn thuËn lîi vÒ trang thiÕt bÞ vµ c¬ së vËt chÊt cho t«i hoµn thµnh nghiªn cøu nµy. Qua ®©y, t«i còng muèn ®­îc bµy tá lßng biÕt ¬n ch©n thµnh tíi c¸c thÇy c« gi¸o, c¸n bé Khoa Sinh häc, Tr­êng §¹i häc Khoa häc Tù nhiªn, §¹i häc Quèc Gia Hµ Néi ®· gióp ®ì vµ trang bÞ nh÷ng kiÕn thøc h÷u Ých cho t«i trong suèt thêi gian häc tËp t¹i tr­êng. Cuèi cïng, t«i xin bµy tá lßng biÕt ¬n s©u s¾c tíi gia ®×nh, b¹n bÌ th©n thiÕt, nh÷ng ng­êi ®· lu«n cæ vò, ®éng viªn t«i v­ît qua mäi khã kh¨n trong qu¸ tr×nh häc tËp vµ nghiªn cøu. Hµ Néi, ngµy th¸ng n¨m Häc viªn NguyÔn ThÞ TuyÒn môc lôc Më ®Çu 1 Ch­¬ng 1- Tæng quan tµi liÖu 3 1.1. Qu¸ tr×nh oxy hãa Fe(II) nhê vi khuÈn 3 1.1.1. LÞch sö nghiªn cøu vi khuÈn oxy hãa Fe(II) (FOM) 3 1.1.2. Vai trß cña vi khuÈn trong chu tr×nh oxy hãa - khö s¾t 4 1.1.3. Vi khuÈn hiÕu khÝ oxy hãa Fe(II) ë pH trung tÝnh 5 1.1.4. Vi khuÈn quang hîp kþ khÝ oxy hãa Fe(II) 6 1.1.5. Vi khuÈn kþ khÝ oxy hãa Fe(II) 6 1.2. Khö nitrate nhê vi khuÈn 7 1.3. Vi khuÈn oxy hãa Fe(II), khö nitrate 8 1.4. C¬ chÕ ph©n tö cña qu¸ tr×nh oxy hãa Fe(II) vµ c¸c gen liªn quan 9 1.5. ¶nh h­ëng cña « nhiÔm nitrate vµ thõa s¾t trong nguån n­íc sinh ho¹t 12 1.5.1. ¶nh h­ëng cña nitrate ®Õn søc kháe con ng­êi 12 1.5.2. ¶nh h­ëng cña thõa s¾t ®Õn søc kháe con ng­êi 14 1.6. ý nghÜa cña viÖc nghiªn cøu tÝnh ®a d¹ng di truyÒn vµ tiÒm n¨ng øng dông cña c¸c vi khuÈn oxy hãa Fe(II), khö nitrate 15 1.7. C¸c ph­¬ng ph¸p sinh häc ph©n tö hiÖn ®¹i ®­îc sö dông trong c¸c nghiªn cøu vÒ tÝnh ®a d¹ng vµ cÊu tróc di truyÒn cña quÇn x· vi khuÈn 15 1.7.1. DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) 15 1.7.2. FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) 16 1.7.3. ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) 17 Ch­¬ng 2 - Nguyªn vËt liÖu vµ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu 18 2.1. Nguyªn vËt liÖu 18 2.1.1. §èi t­îng nghiªn cøu 18 2.1.2. Hãa chÊt 18 2.1.3. ThiÕt bÞ, dông cô sö dông trong nghiªn cøu 19 2.2. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu 19 2.2.1. X¸c ®Þnh sè l­îng vi khuÈn oxy hãa Fe(II), khö nitrate 21 2.2.2. Ph©n lËp vi khuÈn kþ khÝ oxy hãa Fe(II), khö nitrate 23 2.2.3. T¸ch DNA tæng sè tõ mÉu bïn vµ trÇm tÝch vµ chñng ®¬n 23 2.2.4. Ph©n tÝch ®a d¹ng di truyÒn c¸c chñng ®¬n b»ng ph­¬ng ph¸p ARDRA 24 2.2.5. Ph­¬ng ph¸p ®iÖn di biÕn tÝnh DGGE 25 2.2.6. Gi¶i tr×nh tù gen 16S rDNA vµ dùng c©y ph©n lo¹i 27 2.2.7. Ph­¬ng ph¸p FISH 27 2.2.8. §Þnh l­îng Fe(II), Mn(II) vµ nitrate 29 Ch­¬ng 3 - KÕt qu¶ vµ th¶o luËn 33 3.1. X¸c ®Þnh sè l­îng vi khuÈn oxy hãa Fe(II), khö nitrate t¹i c¸c m«i tr­êng sinh th¸i kh¸c nhau 33 3.2. Ph©n tÝch cÊu tróc quÇn x· vi khuÈn b»ng ®iÖn di biÕn tÝnh (DGGE) 34 3.3. §¸nh gi¸ ®a d¹ng di truyÒn vi khuÈn trong c¸c m«i tr­êng nghiªn cøu b»ng ph­¬ng ph¸p FISH 36 3.4. Møc ®é oxy hãa Fe(II) vµ khö nitrate cña vi khuÈn trong c¸c mÉu nghiªn cøu 37 3.5. Ph©n lËp vi khuÈn oxy ho¸ Fe(II), khö nitrate tõ c¸c mÉu nghiªn cøu 38 3.6. §¸nh gi¸ tÝnh ®a d¹ng di truyÒn cña c¸c chñng vi khuÈn oxy hãa Fe(II), khö nitrate b»ng ph­¬ng ph¸p ARDRA 40 3.7. Nghiªn cøu ®Æc ®iÓm sinh lý, ph©n lo¹i vµ ho¹t tÝnh sinh häc cña c¸c chñng vi khuÈn ®¹i diÖn 43 KÕt luËn 49 h­íng nghiªn cøu tiÕp theo 50 Tµi liÖu tham kh¶o 51 Phô lôc 62 danh môc c¸c ch÷ viÕt t¾t ARDRA Amplified ribosomal DNA Restriction Analysis bp Base pair BSA Bovin serum albumin DNA Deoxyribonucleic acid CI Chloroform-isoamyl alcohol CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide DAPI 4’6-diamidino-2-phenylindole ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FISH Fluorescence in situ hydridization MQ Mili-Q MPN Most probable number OD Optical density PBS Phosphate-buffered saline PCI Phenol-Chloroform-isoamyl alcohol PCR Polymerase chain reaction rDNA Ribosomal deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris-Acetic-EDTA (®Öm) TE Tris-EDTA (®Öm) Taq Thermus aquaticus DNA UV Ultraviolet Më ®Çu S¾t lµ mét trong nh÷ng kim lo¹i phæ biÕn trªn tr¸i ®Êt. Th«ng th­êng s¾t tån t¹i ë d¹ng Fe2O3 Ýt tan trong n­íc vµ cã mµu vµng n©u. Trong m«i tr­êng pH trung tÝnh, d¹ng hßa tan trong n­íc, Fe(II), chØ tån t¹i ë ®iÒu kiÖn kh«ng cã oxy, vÝ dô nh­ ë ®¸y c¸c thñy vùc, n¬i oxy hßa tan trong n­íc ®· bÞ c¸c vi sinh vËt hiÕu khÝ sö dông ®Ó ph©n hñy c¸c hîp chÊt h÷u c¬. Víi hiÖu ®iÖn thÕ oxy hãa khö Fe(III)/Fe(II) t¹i pH 7 vµo kho¶ng +200 mV, ion Fe(II) cã thÓ trë thµnh nguån ®iÖn tö cho c¸c qu¸ tr×nh h« hÊp kþ khÝ, ®iÓn h×nh lµ khö nitrate thµnh N2 do mét sè nhãm vi khuÈn ®¶m nhiÖm (Straub vµ cs, 1996; Benz vµ cs, 1998; Weber vµ cs, 2006 c). Qu¸ tr×nh oxy hãa Fe(II), khö nitrate ®­îc tãm t¾t nh­ sau: 10 Fe2+ + 2 NO3( + 24 H2O = 10 Fe(OH)3 ↓ + N2 ↑ + 9 H2 ↑ Trong tù nhiªn, qu¸ tr×nh oxy hãa Fe(II) víi chÊt nhËn ®iÖn tö lµ nitrate chñ yÕu diÔn ra ë ranh giíi hiÕu khÝ (cã oxy) vµ kþ khÝ (kh«ng cã oxy) trong líp trÇm tÝch ë ®¸y c¸c thñy vùc. Oxy hãa Fe(II) kÕt hîp víi khö nitrate cã thÓ ®ãng vai trß quan träng trong m«i tr­êng « nhiÔm víi nång ®é Fe(II) cao (do thiÕu oxy) vµ nitrate cao (do chÊt h÷u c¬ bÞ ph©n hñy t¹o thµnh) (Weber vµ cs, 2006 c). C¸c loµi vi khuÈn víi kh¶ n¨ng tiÕn hµnh ph¶n øng oxy hãa khö nµy cã thÓ cïng mét lóc thùc hiÖn ®­îc hai nhiÖm vô, thø nhÊt lµ chuyÓn Fe(II) hßa tan trong n­íc vÒ d¹ng Fe(III) kÕt tña, vµ hai lµ lo¹i bá nitrate, chuyÓn thµnh d¹ng N2 kh«ng ®éc h¹i. Vi khuÈn dïng ion Fe(II) lµm nguån cho ®iÖn tö ®Ó khö nitrate ®­îc ph©n lËp ®Çu tiªn tõ c¸c líp trÇm tÝch ao, hå n­íc ngät t¹i Bremen, §øc n¨m 1996 (Straub vµ cs, 1996). Mét sè c«ng tr×nh nghiªn cøu tiÕp sau cho thÊy sù cã mÆt kh¸ phæ biÓn cña nhãm vi khuÈn nµy víi mËt ®é kh¸ cao (106 tÕ bµo/g trÇm tÝch) trong c¸c ®iÒu kiÖn m«i tr­êng kh¸c nhau, bao gåm c¶ n­íc ngät, n­íc lî vµ n­íc mÆn vµ t¹i nhiÒu vi trÝ ®Þa lý kh¸c nhau trªn thÕ giíi (Straub vµ Buchholz-Cleven, 1998). C¸c loµi vi khuÈn phæ biÕn nhÊt trong nhãm nµy ®­îc biÕt ®Õn hiÖn nay lµ c¸c loµi thuéc chi Chromobacterium vµ Klebsiella (Benz vµ cs, 1998; Senko vµ cs, 2005; Weber vµ cs, 2006 b). C¸c nghiªn cøu vÒ nhãm vi khuÈn nµy ë ch©u ¢u víi ®iÒu kiÖn sinh th¸i hoµn toµn kh¸c biÖt víi n­íc ta. HiÖn nay, ë ViÖt Nam còng nh­ trªn thÕ giíi, t×nh tr¹ng « nhiÔm c¸c kim lo¹i nÆng vµ nit¬ trong nguån n­íc sinh ho¹t vµ n­íc th¶i ®ang lµ vÉn ®Ò ®­îc quan t©m hµng ®Çu. Nång ®é ammonium hay nitrate cao trong n­íc uèng còng nh­ n­íc th¶i cã thÓ g©y ra nhiÒu vÊn ®Ò nghiªm träng liªn quan ®Õn m«i tr­êng sinh th¸i vµ søc kháe céng ®ång (Avery, 1999; Lundgerg vµ cs, 2004; Tricker vµ Preussmann, 1991). Thõa s¾t trong c¬ thÓ ®­îc cho lµ mét trong nh÷ng nguyªn nh©n g©y ra c¸c bÖnh vÒ thÇn kinh vµ ung th­ (Moon, 2008). C¸c kü thuËt sinh häc ph©n tö øng dông trong nghiªn cøu sinh th¸i vi sinh vËt ®· cã nhiÒu b­íc tiÕn ®¸ng kÓ trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y. Trong sè c¸c ph­¬ng ph¸p ®ã, cã thÓ kÓ ®Õn PCR-DGGE vµ FISH (kh«ng cÇn ph©n lËp vµ nu«i cÊy) hay ARDRA vµ gi¶i tr×nh tù gen (th«ng qua b­íc ph©n lËp vµ nu«i cÊy) lµ c¸c ph­¬ng ph¸p h÷u hiÖu ®­îc sö dông phæ biÕn trong ®¸nh gi¸ tÝnh ®a d¹ng, ph©n tÝch cÊu tróc di truyÒn c¸c nhãm loµi cña c¸c vi sinh vËt trong c¸c m«i tr­êng sinh th¸i kh¸c nhau. Tõ nh÷ng thùc tÕ kÓ trªn chóng t«i tiÕn hµnh thùc hiÖn ®Ò tµi: “Vi khuÈn oxy hãa Fe(II) vµ khö nitrate ë ViÖt Nam: TÝnh ®a d¹ng vµ tiÒm n¨ng øng dông” víi môc ®Ých ®¸nh gi¸ tÝnh ®a d¹ng di truyÒn cña vi khuÈn oxy hãa Fe(II), khö nitrate ë ViÖt Nam vµ t×m hiÓu kh¶ n¨ng øng dông cña chóng trong xö lý nguån n­íc nhiÔm ion s¾t kim lo¹i vµ c¸c hîp chÊt chøa nit¬. Ch­¬ng 1- Tæng quan tµi liÖu 1.1. Qu¸ tr×nh oxy hãa Fe(II) nhê vi khuÈn 1.1.1. LÞch sö nghiªn cøu vi khuÈn oxy hãa Fe(II) (FOM) Kh¸i niÖm vi sinh vËt liªn quan ®Õn oxy hãa s¾t cã tõ nöa ®Çu thÕ kØ 19, khi Ehrenberg cho r»ng c¸c quÆng s¾t cã thÓ ®­îc h×nh thµnh do kÕt qu¶ cña ho¹t ®éng sinh häc. Vi khuÈn liªn quan trùc tiÕp ®Õn s¾t oxit, Gallionella ferruginea, còng ®· ®­îc «ng m« t¶ mét c¸ch chi tiÕt (Ehrenberg, 1919). Trong suèt thêi gian sau ®ã, nhiÒu ®èi t­îng vi sinh vËt ®· ®­îc sö dông ®Ó chøng minh r»ng vi khuÈn cã kh¶ n¨ng oxy hãa s¾t ë pH trung tÝnh vÝ dô nh­ Leptothrix ochracea (Kützing, 1919). Tuy nhiªn vµo thêi ®iÓm ®ã c¸c b»ng chøng ®­a ra vÉn ch­a ®­îc hoµn toµn x¸c thùc. Còng vµo thêi ®iÓm nµy, Harder, mét gi¸o viªn ®Þa chÊt ng­êi Mü ®· c«ng bè mét c«ng tr×nh nghiªn cøu vÒ vi khuÈn s¾t (Harder, 1919), trong ®ã vi khuÈn ®­îc chøng minh lµ mét trong c¸c yÕu tè ®Þa hãa cña chu tr×nh s¾t. Nh÷ng vi khuÈn mµ Harder ®Ò cËp nµy sau ®ã ®­îc ph¸t hiÖn trong mét vµi m«i tr­êng n­íc ngät vµ ph­¬ng ph¸p lµm giµu còng ®­îc sö dông ®Ó cung cÊp c¸c b»ng chøng cô thÓ vÒ h×nh thøc sinh tr­ëng tù d­ìng v« c¬ cña nhãm vi khuÈn nµy. Tuy nhiªn vµo thêi ®iÓm ®ã, chñng ®¬n vÉn ch­a ph©n lËp ®­îc. 75 n¨m sau ®ã, nhiÒu nghiªn cøu ®· cung cÊp c¸c hiÓu biÕt vÒ tËp tÝnh cña vi sinh vËt oxy hãa Fe(II) (FOM- Ferrous oxidizing Microbiology) còng nh­ vai trß quan träng cña chóng trong ph¶n øng ®Þa hãa vµ ¨n mßn sinh häc. MÆc dï vËy sè chñng ph©n lËp ®­îc cßn giíi h¹n, do ®ã møc ®é ®a d¹ng, ph©n lo¹i, h×nh th¸i còng nh­ sinh lý cña nhãm vi khuÈn nµy vÉn ch­a ®­îc m« t¶ chi tiÕt (Emerson, 2000). N¨m 1984, tæng quan cña Ghiorse ®· th¶o luËn nhiÒu vÊn ®Ò vÒ ph¸p danh vµ ph©n lo¹i cña nhãm vi khuÈn nµy (Ghiorse, 1984). Qu¸ tr×nh oxy hãa Fe(II) kþ khÝ míi ®­îc biÕt ®Õn nhê viÖc ph©n lËp ®­îc vi khuÈn tÝa quang hîp kh«ng l­u huúnh, cã kh¶ n¨ng sö dông Fe(II) lµm chÊt cho ®iÖn tö (Widdel vµ cs, 1993). TiÕp sau ®ã, vµo n¨m 1996 Straub vµ céng sù lÇn ®Çu tiªn ph©n lËp ®­îc vi khuÈn kþ khÝ oxy hãa Fe(II), khö nitrate (Straub vµ cs, 1996). N¨m 1997 lÇn ®Çu tiªn vi khuÈn vi hiÕu khÝ ë pH trung tÝnh cã kh¶ n¨ng oxy hãa Fe(II) ®­îc ph©n lËp vµ m« t¶ ®Æc ®iÓm bëi Emerson vµ Moyer n¨m 1997 (Emerson vµ Moyer, 1997). Cho ®Õn nay nhiÒu nghiªn cøu tËp trung vÒ nhãm vi khuÈn cã kh¶ n¨ng oxy hãa Fe(II) cho thÊy chóng cã mÆt phæ biÕn ë hÇu hÕt c¸c m«i tr­êng tõ n­íc ngät, n­íc lî ®Õn n­íc mÆn, trong ®Êt, n­íc vµ trÇm tÝch, ë pH acid ®Õn pH trung tÝnh víi sè l­îng t­¬ng ®èi lín (Ehrenreich vµ Widdel, 1994; Straub vµ cs, 1996, 1998; Emerson vµ Moyer, 1997; Benz vµ cs, 1998; Heising vµ cs, 1999; Hauck vµ cs, 2001; Ratering vµ Schnell, 2001; Edwards vµ cs, 2003; Emerson vµ Weiss, 2004; Weber vµ cs, 2006 b, c). 1.1.2. Vai trß cña vi khuÈn trong chu tr×nh oxy hãa - khö s¾t Qu¸ tr×nh oxy hãa - khö gi÷a Fe(II) vµ Fe(III) (h×nh 1) cã vai trß thiÕt yÕu trong chu tr×nh sinh ®Þa hãa m«i tr­êng vµ lµ qu¸ tr×nh sinh ®Þa hãa quan träng cã mÆt tõ rÊt sím trªn tr¸i ®Êt. Fe(II) lµ thµnh phÇn cña c¸c d¹ng kho¸ng phæ biÕn nh­ siderite (kho¸ng chÊt cã chøa FeCO3), vivianite (Fe3(PO4)2.8H2O) hoÆc Pyrite (FeS2) trong m«i tr­êng kþ khÝ cã tÝnh acid yÕu ®Õn m«i tr­êng trung tÝnh (Straub vµ cs, 2001). Tr­íc khi ph¶n øng oxy hãa khö nhê vi khuÈn ®­îc ph¸t hiÖn ra th× c¬ chÕ v« sinh ®· ®­îc cho lµ chi phèi qu¸ tr×nh oxy hãa khö s¾t trong m«i tr­êng. Tuy nhiªn, ®Õn nay th× râ rµng lµ sù chuyÓn hãa s¾t chñ yÕu lµ do vi khuÈn ®iÒu khiÓn trong hÇu hÕt c¸c ®iÒu kiÖn m«i tr­êng. NhiÒu loµi vi khuÈn, kÓ c¶ vi khuÈn cæ, cã kh¶ n¨ng sö dông thÕ oxy hãa khö cña cÆp Fe(II)/Fe(III) (+770 mV ®èi víi m«i tr­êng acid; +200 mV ®èi víi m«i tr­êng trung tÝnh) vµ c¸c cÆp oxy hãa - khö kh¸c ®Ó trao ®æi ®iÖn tö, t¹o n¨ng l­îng. ë ®©y, Fe(II) ®­îc sö dông nh­ lµ chÊt cho ®iÖn tö ®Ó cung cÊp ®­¬ng l­îng khö cho c¸c qu¸ tr×nh ®ång hãa carbon thµnh sinh khèi nhê c¸c vi khuÈn oxy hãa Fe(II) trong c¶ ®iÒu kiÖn kþ khÝ vµ hiÕu khÝ, cßn Fe(III) cã thÓ ®­îc sö dông nh­ lµ chÊt nhËn ®iÖn tö cuèi cïng trong ®iÒu kiÖn kþ khÝ cho c¸c vi khuÈn tù d­ìng v« c¬ vµ tù d­ìng h÷u c¬ khö Fe(III) (Weber vµ cs, 2006 a). MÆc dï vai trß cña qu¸ tr×nh chuyÓn hãa s¾t nhê vi khuÈn trong m«i tr­êng lµ rÊt lín nh­ng nh÷ng hiÓu biÕt cña chóng ta vÒ sinh lý, sinh hãa cña chóng vÉn cßn giíi h¹n. HÇu hÕt c¸c nghiªn cøu vµ c«ng bè vÒ qu¸ tr×nh oxy hãa Fe(II) ®Òu tËp trung vµo c¸c vi khuÈn hiÕu khÝ, ­a acid nh­ Thiobaccillus ferrooxidans (Temple vµ Colmer, 1951; Yamanaka vµ Fukumori, 1995), lµ vi khuÈn ph¸t triÓn trong m«i tr­êng cã pH 1-2 vµ tån t¹i Fe(II) vµ Fe(III) ë d¹ng ion hßa tan. Tuy nhiªn, ë pH trung tÝnh c¬ chÊt vµ s¶n phÈm cña qu¸ tr×nh chuyÓn hãa s¾t l¹i Ýt hßa tan, ®iÒu nµy g©y khã kh¨n cho viÖc nghiªn cøu (Straub vµ cs, 2001).
H×nh 1. Chu tr×nh s¾t trong tù nhiªn (Ehrlich vµ Newman, 2008). 1 - Vi sinh vËt trong m«i tr­êng acid; 2 - Vi sinh vËt kþ khÝ ë m«i tr­êng trung tÝnh (khö nitrate, quang hîp kþ khÝ); 3 - Qu¸ tr×nh hãa häc trong m«i tr­êng trung tÝnh víi nång ®é O2 cao; 4 - Qu¸ tr×nh hãa häc; 5 - Qu¸ tr×nh sinh häc; 6 - H2S tõ vi sinh vËt; 7 - +O2, qu¸ tr×nh sinh häc hoÆc hãa häc; 8 - +CO32−, qu¸ tr×nh hãa häc; 9 - chuyÓn H+, qu¸ tr×nh sinh häc hoÆc hãa häc; 10 - Qu¸ tr×nh sinh häc hoÆc hãa häc. 1.1.3. Vi khuÈn hiÕu khÝ oxy hãa Fe(II) ë pH trung tÝnh Sù c¹nh tranh cña c¸c vi khuÈn hiÕu khÝ cã kh¶ n¨ng oxy hãa Fe(II) (FOM) víi ®éng häc cña qu¸ tr×nh oxy hãa v« sinh Fe(II) b»ng O2 ®· ®­îc chøng minh lµ gãp phÇn hoµn thiÖn chu tr×nh s¾t trong m«i tr­êng hiÕu khÝ (Emerson vµ Moyer, 1997; Sobolev vµ Roden, 2001; Edwards vµ cs, 2003). Qu¸ tr×nh oxy hãa Fe(II) nhê vi khuÈn ®i kÌm víi khö oxy ë pH trung trÝnh vµ acid ®· ®­îc biÕt ®Õn trong h¬n mét thÕ kû nay. ë thêi ®iÓm ®Çu vai trß cña oxy hãa Fe(II) ë pH trung tÝnh nhê vi khuÈn hiÕu khÝ ®· bÞ xem nhÑ v× ph¶n øng hãa häc oxy hãa Fe(II) b»ng oxy kh«ng khÝ x¶y ra rÊt nhanh. Cho ®Õn nay, møc ®é ®a d¹ng cña FOM trong m«i tr­êng hiÕu khÝ ®· ®­îc nghiªn cøu chi tiÕt, c¸c loµi ®­îc ph¸t hiÖn ®Òu thuéc 3 chi Gallionella, Leptothrix vµ Marinobacter (Kützing, 1919; Ehrenberg, 1919). Mét sè FOM hiÕu khÝ ­a pH trung tÝnh gÇn ®©y ®· ®­îc x¸c ®Þnh thuéc vµo c¸c ph©n líp α-, β-, γ- Proteobacteria (Edwaras vµ cs, 2003; Emerson vµ Weiss, 2004; Dhillon vµ cs, 2005; Rentz vµ cs, 2007). 1.1.4. Vi khuÈn quang hîp kþ khÝ oxy hãa Fe(II) Trong nh÷ng khu vùc cã ¸nh s¸ng, Fe(III) cã thÓ còng ®­îc t¹o thµnh th«ng qua ho¹t tÝnh oxy hãa Fe(II) cña vi khuÈn quang hîp cã kh¶ n¨ng sö dông Fe(II) nh­ mét nguån cho ®iÖn tö ®Ó t¹o c¸c ®­¬ng l­îng khö cho qu¸ tr×nh ®ång hãa carbon v« c¬ (Weber vµ cs, 2006 a). Vi khuÈn quang hîp kþ khÝ lµ vi khuÈn oxy hãa Fe(II) b»ng con ®­êng kþ khÝ ®­îc biÕt ®iÕn ®Çu tiªn (Widdel vµ cs, 1993). Vi khuÈn nµy phæ biÕn ®­îc biÕt ®Õn hiÖn nay thuéc c¸c chi Chlorobium, Rhodobacter, Thiodictyon, Rhodovulum, Rhodomicrobium (Ehrenreich vµ Widdel, 1994; Heising vµ Schink, 1998; Heising vµ cs, 1999; Straub vµ cs, 1999; Kappler vµ Newman, 2004; Miot vµ cs, 2009). Nh÷ng nghiªn cøu gÇn ®©y ®· chØ ra r»ng vi khuÈn quang hîp oxy hãa Fe(II) kh«ng cã kh¶ n¨ng sö dông Fe(II) ë d¹ng kho¸ng mµ chØ cã thÓ oxy hãa Fe(II) ë d¹ng ion hßa tan (Kappler vµ Newman, 2004), do ®ã chóng chØ ®ãng vai trß nhá trong qu¸ tr×nh oxy hãa - khö s¾t vµ sù phong hãa s¾t trong m«i tr­êng trªn c¹n. 1.1.5. Vi khuÈn kþ khÝ oxy hãa Fe(II) GÇn ®©y, viÖc x¸c ®Þnh ®­îc c¸c vi khuÈn kþ khÝ oxy hãa Fe(II) ®· lÊp ®Çy chç trèng trong bøc tranh tæng thÕ vÒ chu tr×nh oxy hãa - khö s¾t nhê vi sinh vËt (Widdel vµ cs, 1993; Straub vµ cs, 1996). C¸c b»ng chøng gÇn ®©y còng ®· chØ ra r»ng vi khuÈn kþ khÝ oxy hãa Fe(II) cã thÓ ®ãng vai trß quan träng trong chu tr×nh oxy hãa - khö s¾t (Senn vµ Hemond, 2002; Straub vµ cs, 2004; Weber vµ cs, 2006 c), trong chu tr×nh sinh ®Þa hãa ®Êt, trÇm tÝch, kho¸ng hãa, vµ qu¸ tr×nh cè ®Þnh c¸c chÊt phãng x¹ vµ kim lo¹i nÆng (Chaudhuri vµ cs, 2001; Weber vµ cs, 2001; Lack vµ cs, 2002; Weber vµ cs, 2006 c). Trong m«i tr­êng kh«ng cã oxy, qu¸ tr×nh oxy hãa Fe(II) nhê vi khuÈn ®· ®­îc chøng minh lµ th­êng ®i kÌm víi qu¸ tr×nh khö perchlorate, chlorate vµ ®Æc biÖt lµ nitrate (Straub vµ cs, 1996; Bruce vµ cs, 1999; Weber vµ cs, 2006 c). Khö nitrate nhê vi khuÈn H×nh 2. Chu tr×nh nit¬ trong tù nhiªn. Nguån nit¬ chñ yÕu cho qu¸ tr×nh ®ång ho¸ ë c¸c sinh vËt tù d­ìng vµ dÞ d­ìng lµ ammonium vµ nitrate (®­îc khö thµnh ammonium tr­íc khi sö dông). Trong tÕ bµo, nit¬ tËp trung ë thµnh phÇn cña protein (c¸c axit amin) vµ ®­îc chuyÓn ho¸ thµnh d¹ng v« c¬ th«ng qua qu¸ tr×nh oxy ho¸ hoÆc khö nhãm amin (-NH2) trong axit amin thµnh ammonium. Ngoµi tù nhiªn, ammonium tån t¹i ë d¹ng NH3 t¹i pH kiÒm vµ ë d¹ng NH4+ t¹i pH acid vµ trung tÝnh. Cè ®Þnh nit¬ kh«ng khÝ chuyÓn thµnh ammonium lµ qu¸ tr×nh tiªu tèn nhiÒu n¨ng l­îng. Trong tù nhiªn chØ cã mét sè loµi vi khuÈn vµ t¶o lam cã kh¶ n¨ng thùc hiÖn ph¶n øng nµy nhê s¶n sinh ra enzyme nitrogenase. C¸c loµi vi khuÈn cè ®Þnh nit¬ ®­îc chia vµo hai nhãm (1) c¸c loµi sèng céng sinh trong nèt sÇn ë rÔ cña thùc vËt (Rhizobium) vµ (2) c¸c loµi sèng tù do trong ®Êt, tËp trung quanh vïng rÔ thùc vËt (Azotobacter) (Shapleigh, 2000). Nitrate ho¸ lµ qu¸ tr×nh chuyÓn ho¸ ammonium thµnh nitrate do hai nhãm vi khuÈn riªng biÖt ®¶m nhiÖm. Nhãm thø nhÊt lµ c¸c loµi thuéc chi Nitrosomonas (vµ mét sè chi kh¸c nh­ Nitrospira, Nitrococcus, Nitrosolobus vµ Nitrosovibrio) oxy ho¸ ammonium thµnh nitrite: NH4+ + 1,5 O2 → NO2− + 2 H+ + H2O. Nhãm thø hai ®¹i diÖn lµ chi Nitrobacter tiÕp tôc oxy ho¸ nitrite thµnh nitrate: NO2− + 0,5 O2 → NO3−. Ngoµi ra hai chi Nitrospira vµ Nitrococcus thuéc nhãm thø nhÊt còng cã kh¶ n¨ng tham gia b­íc ph¶n øng oxy ho¸ nitrite thµnh nitrate (Shapleigh, 2000). Khö nitrate thµnh khÝ nit¬ lµ qu¸ tr×nh diÔn ra trong ®iÒu kiÖn kh«ng cã oxy, trong ®ã nitrate ®­îc vi sinh vËt sö dông lµm chÊt nhËn ®iÖn tö cuèi cïng khÐp kÝn chuçi h« hÊp trong tÕ bµo. Khö nitrate diÔn ra qua mét sè b­íc trung gian, mçi b­íc do mét lo¹i enzyme lµm chÊt xóc t¸c: NO3− → NO2− → NO → N2O → N2. C¸c nghiªn cøu vÒ ®a d¹ng vµ sinh th¸i cho thÊy phæ biÕn nhÊt trong c¸c m«i tr­êng ®Êt, n­íc vµ n­íc th¶i lµ c¸c loµi thuéc chi Pseudomonas (P. fluorescens, P. aeruginosa, P. denitrificans) vµ Acaligenes (Shapleigh, 2000). Trong tù nhiªn, vi khuÈn cã kh¶ n¨ng sinh tr­ëng b»ng c¸ch khö nitrate t­¬ng ®èi ®a d¹ng, thuéc nhiÒu nhãm ph©n lo¹i kh¸c nhau (Shapleigh, 2000). Nguån ®iÖn tö cho nhãm vi khuÈn nµy sö dông ®Ó khö nitrate còng rÊt phong phó, bao gåm c¸c acid h÷u c¬, cacbuahydro m¹ch th¼ng hay m¹ch vßng, kÓ c¶ mét sè chÊt khã ph©n hñy (Shapleigh, 2000). Trong m«i tr­êng n­íc ngät nitrate lµ chÊt nhËn ®iÖn tö quan träng thø hai sau oxy, v× thÕ nhãm vi khuÈn khö nitrate ë ®©y còng ®a d¹ng h¬n so víi m«i tr­êng n­íc lî vµ n­íc mÆn, n¬i cã vi khuÈn khö sulfat chiÕm ­u thÕ do ¶nh h­ëng cña nång ®é sulfate (SO42-) cao tõ n­íc biÓn. 1.3. Vi khuÈn oxy hãa Fe(II), khö nitrate ë pH trung tÝnh, oxy hãa Fe(II) hßa tan vµ Fe(II) ë d¹ng kho¸ng nhê vi khuÈn kþ khÝ kh«ng phô thuéc ¸nh s¸ng x¶y ra ®ång thêi víi qu¸ tr×nh khö nitrate ®· ®­îc chøng minh trong c¸c m«i tr­êng n­íc mÆn vµ n­íc ngät kh¸c nhau, bao gåm c¶ ®Êt ruéng, ao, suèi, m­¬ng, ph¸ n­íc lî, hå, ®Çm lÇy, líp ngËp n­íc, thñy nhiÖt, trÇm tÝch ®¸y biÓn (S