Luận văn Xác định các đột biến trên gen katG liên quan đến tính kháng thuốc I soniazid của một số chủng vi khuẩn lao tại Việt Nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Nhiễm vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) là một trong những nhiễm trùng phổ biến nhất ở loài người . Hiện nay tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lao được xác định là chiếm 1/3 dân số thế giới . Có khoảng 9 triệu người mắc lao mới và hơn 3 triệu người chết do lao mỗi năm . Tuy vậy tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tính . Vì vậy còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị và đang tiếp tục làm lây lan bệnh cho c ộng đồng . Hiện nay, bệnh lao đang trở nên nghiêm trọng hơn với đặc trưng là kháng đa thuốc. Trong các trường hợp bệnh lao kháng đa thuốc, khó khăn không chỉ là điều trị thất bại cao , dẫn đến lan truyền nhanh chóng vi khuẩn lao kháng đa thuốc mà còn chưa tìm ra được những thuốc thay thế hiệu quả và hợp lý , trong khi các thuốc chống lao thực sự có hiệu quả chỉ tập trung có 5 thuốc. Những bệnh nhân bị nhiễm các chủng vi khuẩn lao kháng đa thuốc rấ t khó điều trị. Do đó việc phát hiện sớm các chủng vi khuẩn lao kháng đa thuốc sẽ góp phần đáng kể trong điều trị bệnh lao . Để ch ẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc , hiện nay các cơ sở trong nước vẫn phải dựa vào nuôi cấ y vi khuẩn và làm kháng sinh đồ . Thời gian chuẩn đoán lao kháng thuốc cần ít nhất 4 – 6 tuần. Với thời gian dài như vậy sẽ khó khăn cho công tác điều trị , khó đáp ứng yêu cầu giám sát và thanh toán bệnh lao . Khắc phục nhữ ng nhược điểm đó , việc ứng dụng sinh học phân tử đang tạo ra những đột phá trong chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc . Thời gian chẩn đoán có thể rút ngắn xuống còn vài ngày , với độ nhậy và độ đặc hiệu cao, tạo điều kiện cho việc kiểm soát bệnh lao dễ dàng hơn . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 Các nghiên cứu về sinh học phân tử trong chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc đã chỉ ra rằng mỗi loại kháng thuốc là do các gen tương ứng chịu trách nhiệm . Ví dụ, nếu chỉ ra được độ t biến ở gen KatG cũng có nghĩa là chủng lao đó kháng isoniazid . Xuất phát từ những lý do trên , chúng tôi tiến hành đề tài : "Xác định các đột biến trên gen katG liên quan đến tính kháng thuốc i soniazid của một số chủng vi khuẩn lao tại Việt Nam". 2. Mục tiêu nghiên cứu 1. Nhân bản đoạn gen katG từ các chủng vi khuẩn lao nghiê n cứu. 2. Phát hiện đột biến trên gen katG liên quan đến tính kháng isoniazid ở các chủng vi khuẩn lao nghiê n cứu. 3. Nội dung nghiên cƣ́u - Nhân bản đoạn gen katG từ các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu . - Tạo vector tái tổ hợp và biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E. coli. - Tách dòng gen katG. - Giải trình tự gen katG. - Phát hiện, phân tích đột biến trên gen katG liên quan đến tính kháng thuốc isoniazid ở các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình bệnh lao 1.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế giới Bệnh lao gắn liền với sự phát triển xã hội loài người từ hàng ngàn năm nay, trên thế giới chưa bao giờ và không có một quốc gia nào, một khu vực nào, một dân tộc nào không có người mắc bệnh lao và chết do lao [1]. Do sự phát minh các thuốc hóa học chống lao khiến việc chữa lao đơn giản hơn và hiệu quả hơn, đồng thời đã phát sinh tâm trạng chủ quan của y giới, đã làm lãng quên căn bệnh nguy hiểm này. Ngày nay, bệnh lao đang xuất hiện trở lại và cùng với đại dịch HIV/AIDS trở thành một trong những căn nguyên gây mắc bệnh và tử vong chủ yếu, đặc biệt tại các nước đang phát triển. Năm 1993, Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) đã tuyên bố tình trạng khẩn cấp toàn cầu của bệnh lao và mối hiểm hoạ của nó trong tương lai là bệnh lao kháng thuốc [22]. Hiện nay, trên thế giới có khoảng 2,2 tỷ người đã nhiễm lao (chiếm 1/3 dân số thế giới). Theo số liệu công bố của TCYTTG (2004), ước tính trong năm 2003 có thêm khoảng 9 triệu người mắc lao mới và 2 triệu người chết do lao. Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do lao ở các nước có thu nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ ở độ tuổi lao động. Trong đó, có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao [1,22]. Hiện nay, tỷ lệ điều trị thành công trên toàn cầu đạt 82%, nhưng tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tính. Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị đang tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, và theo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 ước tính của TCYTTG, mỗi năm có thêm 1% dân số thế giới bị nhiễm lao (65 triệu người) [22]. Hơn 33% số bệnh nhân lao toàn cầu tại khu vực Đông nam Châu Á. Dưới đây là ước tính bệnh nhân lao mới mắc năm 2002 theo khu vực [22]. Bảng 1.1: Ƣớc tính bệnh nhân lao mới mắc năm 2002 theo khu vực Khu vực Số BN (nghìn) Tỷ lệ/100 000 Tử vong do lao (bao gồm cả nhiễm HIV) Các thể AFB (+) Các thể AFB (+) SL (nghìn) TL/100000 Châu Phi 2354 (26%) 1000 350 149 556 83 Châu Mỹ 370 (4%) 165 43 19 53 6 Trung Đông 622 (7%) 279 124 55 143 28 Châu Âu 472 (5%) 211 54 24 73 8 Đông nam Châu Á 2890 (33%) 1294 182 81 625 39 Tây Thái Bình Dương 2090 (24%) 939 122 55 373 22 Toàn cầu 8797 (100%) 3887 141 63 1823 29 Mức độ nặng nề của bệnh lao đã ảnh hưởng tới thu nhập quốc dân và chỉ số phát triển con người của các quốc gia. Các nghiên cứu về kinh tế y tế cho thấy, mỗi bệnh nhân lao sẽ mất trung bình 3-4 tháng lao động, làm giảm 20-30% thu nhập bình quân của gia đình. Những gia đình có người chết sớm vì bệnh lao có thể sẽ mất tới 15 năm thu nhập. Bệnh lao đã tác động mạnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 tới 70% đối tượng lao động chính của xã hội, làm lực lượng sản xuất bị giảm sút, năng suất lao động giảm và mùa màng, chợ búa sẽ không tham gia được. Diễn đàn các đối tác chống lao lần thứ nhất diễn ra năm 2001 tại trụ sở của ngân hàng thế giới ở Washington D.C với sự có mặt của đại diện cấp Bộ trưởng từ các quốc gia có tình hình bệnh lao nặng nề đã nhận định, bệnh lao là nguyên nhân chủ yếu làm nghèo đói dai dẳng và là trở ngại đối với sự phát triển kinh tế xã hội [22]. Bệnh lao là bệnh của người nghèo, lây lan nhanh trong cộng đồng có điều kiện sống chật chội, thiếu vệ sinh, thông khí và dinh dưỡng kém. Trên 95% số bệnh nhân lao, 98% số chết do lao trên toàn cầu thuộc các nước có thu nhập vừa và thấp, 75% số người mắc bệnh lao ở các lứa tuổi 14-55, là tuổi làm ra nhiều của cải nhất trong cuộc đời [1, 22]. Bệnh lao là kết quả của nghèo đói và nghèo đói lại là nguyên nhân làm cho bệnh lao phát triển. 1.1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam Ở nước ta, bệnh lao còn phổ biến và ở mức độ trung bình cao. Việt Nam đứng thứ 13 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu (TCYTTG, 2004). Trong khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung Quốc và Philipinnes về số lượng bệnh nhân lao lưu hành cũng như bệnh nhân lao mới xuất hiện hàng năm [1]. Năm 1995, trước những biến động xấu đi của tình hình dịch tễ bệnh lao toàn cầu, công tác chống lao thực sự bắt đầu phải đối mặt với những thách thức mới là bệnh lao kháng thuốc và Lao/HIV, Nhà nước và Bộ Y tế Việt Nam đã quyết định đưa Chương trình chống lao thành một trong những Chương trình y tế quốc gia trọng điểm. Cùng với sự đầu tư phát triển các Chương trình y tế quốc gia nói chung, Bộ Y tế và Chính phủ đã ưu tiên đầu tư đồng bộ lượng rất lớn cán bộ, kinh phí và trang thiết bị cho Chương trình Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 chống lao. Ban chỉ đạo Chương trình chống lao và chính quyền địa phương các cấp đã tham gia tích cực triển khai công tác này, cùng với sự hợp tác và giúp đỡ có hiệu quả về tài chính và kỹ thuật của các tổ chức quốc tế [4]. Năm 1996, Chương trình chống lao quốc gia (CTCLQG) với sự hỗ trợ về kỹ thuật và tài chính của Chính phủ Hà Lan, hiệp hội chống lao hoàng gia Hà Lan, uỷ ban hợp tác y tế Hà Lan - Việt Nam, CTCLQG đã hình thành và xây dựng kế hoạch phòng chống lao giai đoạn 1996-2000. Đến năm 1999, chiến lược DOTS (điều trị bằng hoá trị liệu ngắn ngày có kiểm soát trực tiếp) đã được bao phủ 100% số huyện trên cả nước [4]. Trong giai đoạn 1997-2002, CTCLQG đã phát hiện được 532.703 bệnh nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện đạt 82% số bệnh nhân ước tính (so với mục tiêu của TCYTTG là 70%), CTCLQG đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi AFB (+) với tỷ lệ khỏi là 92% [3]. Năm 2002, khu vực Tây Thái Bình Dương phát hiện 806.460 bệnh nhân lao các thể, 372.220 bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới. Trong đó, số bệnh nhân do CTCLQG Việt Nam phát hiện chiếm 12% bệnh nhân các thể và 15% số bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới [1]. Với những kết quả đạt được trong chỉ tiêu phát hiện và điều trị bệnh nhân, năm 1996, Việt Nam là nước đầu tiên ở Châu Á đã đạt được mục tiêu của TCYTTG. Việt Nam đã được TCYTTG và ngân hàng thế giới đánh giá cao thành tích đạt được trong mọi hoạt động chống lao. Từ năm 1997, TCYTTG và hiệp hội bài lao và bệnh phổi quốc tế cùng phối hợp với CTCLQG Việt Nam tổ chức 8 khoá học về quản lý Chương trình chống lao cho các học viên quốc tế tại Việt Nam. Mô hình hoạt động chống lao ở Việt Nam được xem là mô hình để học viên các nước học tập [4]. Vì là một trong số ít nước sớm nhất đạt được các mục tiêu phòng chống lao do TCYTTG đề ra, những kết quả đạt được có tính bền vững, nên tháng 10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 năm 2003 vừa qua CTCLQG Việt Nam đã nhận được giải thưởng của hội chống lao hoàng gia Hà Lan (KNCV) nhân lễ kỷ niệm 100 năm ngày thành lập tổ chức này. Nhân ngày thế giới chống lao, 24/3/2004, tại diễn đàn các đối tác chống lao lần thứ 2 do TCYTTG tổ chức tại New Dehli, CTCLQG Việt Nam là một trong 6 nước trên thế giới (bao gồm: Việt Nam, Peru, Madives, Cuba, Tunisia và Morocco) và là nước duy nhất trong 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao được nhận giải thưởng của TCYTTG về thành tích đã đạt được mục tiêu của TCYTTG và kết quả có tính bền vững trên 4 năm [4]. Hiện nay nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% (ở các tỉnh phía nam là 2%, ở các tỉnh phía bắc là 1%). Ước tính với dân số 70-80 triệu, hàng năm ở nước ta có một s ố lượng lớn người bị mắc lao mới . Số lượng người mắc lao mới được thể h iện qua bảng 1.2. Bảng 1.2: Bảng ƣớc tính số bệnh nhân mắc lao mới qua mỗi năm ở Việt Nam Số mới mắc lao (mọi thể): 130.000 Số lao phổi BK dương tính mới: 60.000 Tổng số trường hợp lao: 260.000 Tổng số lao phổi BK dương tính: 120.000 Nước ta thuộc loại trung bình về dịch tễ lao so với các nước vùng Tây Thái Bình Dương, vùng dịch tễ lao vào loại trung bình trên thế giới. Trên thực tế có thể chỉ số nguy cơ nhiễm lao hàng năm có thể cao hơn 1,5% như vậy các con số nêu trên có thể còn lớn hơn. Điều đó sẽ tăng thêm sự khó khăn đối với công tác chống lao không những trong những năm tới mà có thể còn trong thời gian khá dài, ngay cả khi đã bước sang thiên niên kỷ mới. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 1.1.3. Tình hình lao kháng thuốc Theo báo cáo dựa trên thăm dò lớn về lao kháng thuốc toàn cầu của TCYTTG công bố ngày 26/2/2008, tỷ lệ nhiễm lao kháng nhiều thuốc hiện nay ở mức cao chưa từng có. Mỗi năm có khoảng nửa triệu ca lao kháng đa thuốc, theo ước tính của TCYTTG, chiếm khoảng 5% trong số 9 triệu ca nhiễm lao hàng năm. Cũng trong báo cáo này, lần đầu tiên lao kháng thuốc cực mạnh được đề cập, đây là một dạng gần như không chữa lành được [5]. Theo TCYTTG, hiện nay bệnh lao kháng thuốc là một vấn đề toàn cầu, đặc biệt nghiêm trọng là tình hình kháng đa thuốc. Bệnh lao kháng thuốc xuất hiện khi có vi khuẩn lao kháng với một hoặc nhiều loại thuốc chống lao, nguyên nhân là do bệnh nhân không hợp tác, không tuân thủ đúng nguyên tắc điều trị được quy định của chương trình chống lao , một nguyên nhân khác hay gặp là do thầy thuốc kê đơn không đúng do không phối hợp đầy đủ các thuốc chống lao, liều lượng thuốc không đủ, hướng dẫn bệnh nhân không đúng cách, điều trị không đủ thời gian... Kết quả điều trị với bệnh nhân kháng thuốc thường không cao, nhất là đối với bệnh nhân kháng đa thuốc. Chi phí điều trị bệnh nhân lao kháng đa thuốc tăng lên 100 lần so với bệnh nhân lao không kháng thuốc và thậm chí không điều trị được ở một số trường hợp. Tỷ lệ kháng đa thuốc trong bệnh nhân lao mới ở khu vực Tây Thái Bình Dương dao động trong khoảng 1% đến 10,8% (theo một số nghiên cứu trong khu vực) [4]. Dự án nghiên cứu kháng t huốc lao trên cơ sở toàn c ầu được thực hiện từ năm 1995 với mục tiêu là xác định được tổng số bệnh nhân lao kháng thuốc trên thế giới bằng những phương pháp thống nhất thử độ nhạy với thuốc lao của vi khuẩn . Năm 1998, TCYTTG đã công bố kết quả khảo sát tình hình vi khuẩn lao kháng thuốc ở 35 nước và khu vực trên thế giới [6]. Theo công bố này , tỷ lệ kháng thuốc tiê n phát trung bình với riêng từ ng loại thuốc có khác nhau , cụ thể là : kháng isoniazid 3,2%, rifampicin 0,2%, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 ethambutol 0,3%, steptomycin 2,5% %, trong đó kháng steptomycin ở vùng Ivanovo (Nga) là nơi kháng đơn thuốc cao nhất . Tỷ lệ kh áng thuốc tiên phát trung bình là 9,9 % trong đó kháng 1 thuốc chiếm 6,6 %, kháng 2 thuốc chiếm 2,5 %, kháng 3 thuốc chiếm 0,6 %, kháng bốn thuốc chiếm 0,2 %, kháng đa thuốc trung bình là 1,4 %. Tỷ lệ kháng thuốc tiên phát cao n hất 40,6 % ở cộng hòa Dominica , thấp nhất là 2% ở cộng hòa Séc [6]. Tình hình kháng thuốc mắc phải với từng loại thuốc cũng khác nhau : kháng isoniazid trung bình 6,3 %, rifampicin 0,7 %, ethambutol 0,4 %, steptomycin 2,6 %. Kháng thuốc mắc phải với steptomycin ở Cuba có tỷ lệ cao nhất 57 %. Tỷ lệ kháng thuốc mắc phải trung bình trên toàn thế giới là 36 %, trong đó kháng 1 loại thuốc 12,2 %, 2 loại thuốc 9,7 %, 3 loại thuốc 5,4 %, 4 loại thuốc 4,4 %. Lao kháng đa thuốc mắc phải có tỷ lệ trung bình là 13 %. Kháng đa thuốc mắc phải cao nhất ở Latvia , có tỷ lệ 54 % [6]. Vi khuẩn lao kháng đa thuốc là một thách thức lớn , đe dọa công cuộc phòng chống lao trên toàn cầu , vì các thuốc chống lao có hiệu quả hiện nay đang bị vi khuẩn lao kháng lại nhất là kháng đa thuốc . Trong khi các thuốc chống lao hàng đầu chỉ có năm thuốc thì các thuốc chống lao loại hai lại thường có độc tính cao và giá thành đắt [5]. Việc nghiên cứu lao kháng thuốc ở Việt Nam được tiến hành khá sớm . Năm 1958 Phạm Ngọc Thạc h và cộng sự đã công bố t ỷ lệ kháng thuốc mắc phải v ới isoniazid là 53 %, với paraminosalicylic acid là 26 %, với steptomycin là 59 % [6]. Báo cáo của CTCLQG năm 1998 cho thấy tình hình kháng thuốc của vi khuẩn lao ở Việt Nam là một vấn đề đáng lo ngại . Tỷ lệ kháng thuốc tiên phát là 32,5 % đứng thứ tư trong khảo sát của TCYTTG sau Latvia (34%), Thái Lan (36,6%), và Cộng hòa Dominica (40,6%). Qua các nghiên cứu đã cho thấy Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ bệnh lao kháng thuốc cao trên thế giới [6]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 Nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc là nguyên nhân dẫn đến thấ t bại trong điều trị. Những bệnh nhân lao mới có thể chữa khỏi 95 – 100%. Nhưng bệnh nhân lao kháng thuốc mắc phải , tỷ lệ chữa khỏi chỉ 20 – 30% [22]. Kết quả còn thấp hơn nữa ở những trường hợp kháng đa thuốc mắc phải, thậm chí không chữa được. Nguy hiểm hơn là các bệnh nhân này có thể tiếp tục truyền bệnh cho người khác. Vì vậy việc phát hiện và ngăn chặn sự lan tràn của các chủng lao kháng đa thuốc là vấn đề quan trọng nhất trong chiến lược điều trị lao hiện nay. 1.2. Vi khuẩn lao 1.2.1. Đặc điểm phân loại Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria , ngành Actinobacteria , bộ Actinomycetales , phân bộ, họ Mycobacteriaceae, giống Mycobacterium [18]. Tên khoa học của vi khuẩn lao là: Mycobacterium tuberculosis. Các chủng vi khuẩn lao được chia làm 2 nhóm : Mycobacterium tuberculosis gồm bốn loài có khả năng gây bệnh ở người , và nhóm Mycobacteria other than tuberculosis gồm nhiều loài không gây bệnh ở người [6,7]. 1.2.2. Đặc điểm hình thể Vi khuẩn lao có hình trực khuẩn , kích thước 2 – 4 μm, rộng 0,3 – 1,5 μm. Trực khuẩn thanh mảnh , đứng riêng lẻ hoặc xếp thành hình chữ N , Y, V hoặc thành dãy phân nhánh như cành cây . Vi khuẩn lao không di động , không sinh bào tử, khó bắt màu các thuốc nhuộm thông thường do có lớp sáp ở thành tế bào [7]. 1.2.3. Khả năng gây bệnh Các bệnh lý nhiễm trùng là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Không chỉ có những bệnh nhiễm trùng mới phát sinh mà những bệnh nhiễm trùng cũ gây chết người đã biết từ lâu cũng tái xuất hiện. Hơn nữa tỉ lệ vi khuẩn gây bệnh đề kháng kháng sinh ngày càng tăng cao là nguy cơ lớn cho sức khỏe cộng đồng. Những bằng chứng gần đây cho thấy các tác nhân gây bệnh mặc dù rất khác nhau đều sử dụng những phương thức chung để Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 phát động quá trình nhiễm trùng và gây bệnh. Những cơ chế này tạo nên độc lực của vi khuẩn. Tìm hiểu các cơ chế mà vi khuẩn sử dụng để xâm nhập và gây bệnh có ý nghĩa quan trọng trong cuộc chiến chống lại các tác nhân bé nhỏ này [7]. Độc lực của vi khuẩn lao có liên quan đến “Cord factor” (trehalose – 6,6’ – dimycolate) là chất gây ức chế hoạt động của tế bào bạch cầu , gây nên những u hạt mãn tính . Miễn dịch trong bệ nh lao ngày nay được xác định là đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào . Đáp ứng miễn dịch làm chậm sự nhân lên của vi khuẩn lao , gây hạn chế sự lan tràn của vi khuẩn lao , dẫn tới phá hủy tế bào vi khuẩn . Đáp ứng miễn d ịch trong bệnh lao phát sinh một phản ứng quá muộn . Một số trường hợp vi khuẩn lao có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt trở lại bạch cầu người và tồn tại dưới dạng ngủ trong các u hạt nên cơ thể không tiêu diệt được .