Luận văn Xác định quy trình ly trích dna từ lông heo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG HEO Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ NHA TRANG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG HEO Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS. TS. TRẦN THỊ DÂN NGUYỄN THỊ NHA TRANG KS. NGUYỄN VĂN ÚT Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM ƠN Kính dâng Bố và Mẹ, ngƣời đã sinh thành, dạy dỗ và luôn động viên con để có đƣợc kết quả hôm nay. Cảm ơn Anh hai đã hỗ trợ và động viên em trong suốt quá trình học tập. Cảm ơn gia đình thân yêu của tôi! iv LỜI CẢM ƠN Đặc biệt xin chân thành cảm ơn: * PGS. TS. Trần Thị Dân, KS. Nguyễn Văn Út đã hƣớng dẫn tận tình cho em trong suốt quá trình thực tập và giúp em hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn: * Ban giám hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng Quý thầy cô đã tạo điều kiện tốt đẹp cũng nhƣ truyền đạt kiến thức trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. * Ban giám đốc cùng tập thể cán bộ nhân viên Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. * Xin cảm ơn KS. Lê Thị Thu Hà cùng các anh chị trong phòng Công Nghệ Sinh Học - Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ trong thời gian làm quen với thao tác phòng thí nghiệm và trong quá trình làm đề tài. * Tập thể cán bộ thú y và các cô chú tại lò mổ tập trung huyện Dĩ An – Bình Dƣơng đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình lấy mẫu. Sinh viên thực hiện NGUYỄN THỊ NHA TRANG v TÓM TẮT KHÓA LUẬN Đề tài “XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG HEO” đƣợc tiến hành từ ngày 10 – 03 – 2007 đến ngày 10 – 07 – 2007 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Hƣớng dẫn đề tài: 1. PGS. TS. Trần Thị Dân 2. KS. Nguyễn Văn Út Việc ly trích DNA từ mẫu máu, mẫu da, mẫu cơ đã trở nên quen thuộc trong các thí nghiệm sinh học phân tử trƣớc đây và hiện nay. Tuy nhiên, nhiều khi chúng ta không thể có những loại mẫu đó, ví dụ trong khoa học hình sự, trong khảo cổ học, hay khi nghiên cứu về những loài tiệt chủng hay loài quý hiếm, ta chỉ có đƣợc mẫu lông hay tóc. Do đó, việc lấy mẫu lông hay tóc và ly trích DNA từ loại mẫu này trở nên rất cần thiết trong những trƣờng hợp này. Ngoài ra, việc thu thập mẫu lông dễ dàng hơn thu thập các loại mẫu khác (nhƣ máu, da, cơ…) trên thú sống. Chúng ta có thể nhổ hoặc cắt một vài lông trên thú một cách dễ dàng mà không phải giết mổ hay gây ra stress cho thú sống. Việc ly trích DNA từ lông sẽ mở rộng ra cho ly trích DNA từ các cấu trúc tƣơng tự lông nhƣ móng, mỏ, da, xƣơng… Với mục đích tìm một quy trình tối ƣu cho ly trích DNA từ nhiều nguồn lông, từ nhiều vị trí trên sợi lông và xác định sự xuất hiện của gen halothane, đề tài đƣợc tiến hành trên lông heo. Kết quả ly trích đƣợc đánh giá dựa vào tỷ số OD của mẫu DNA và hiệu suất thành công của PCR với đoạn mồi phát hiện gen halothane. Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau: 1. Sử dụng buffer ly trích chứa proteinase K ở các nồng độ 0,8 mg/ml, 1 mg/ml và 1,2 mg/ml đều cho chất lƣợng DNA tốt với tỷ số OD từ 1,75 – 1,84. 2. DNA đƣợc ly trích với DTT ở nồng độ 50 mM khá tinh sạch (OD = 1,65) và thành công khi đƣợc dùng làm nguồn mẫu cho phản ứng PCR. vi 3. Sử dụng CTAB 0,2% cho DNA tinh sạch (tỷ số OD trung bình là 1,80) và phản ứng PCR khuếch đại đƣợc gen halothan ở nồng độ CTAB 0,2%. 4. Vị trí gốc lông cho DNA ly trích tinh sạch nhất (OD = 2,05), tiếp theo là vị trí thân lông (OD = 1,84), cả sợi lông (OD = 1,75) và vị trí ngọn lông (OD = 1,4). Phản ứng PCR khuếch đại gen halothane cho tỷ lệ thành công cao nhất đối với mẫu gốc lông (70%), tiếp theo là mẫu thân lông (60%) và cả sợi lông (50%). Phản ứng PCR không thành công đối với mẫu ngọn lông. vii MỤC LỤC TRANG Lời cảm ơn ..................................................................................................................... iii Tóm tắt khóa luận ............................................................................................................ v Mục lục ......................................................................................................................... vii Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................... x Danh sách các bảng ....................................................................................................... xi Danh sách các hình và biểu đồ ..................................................................................... xii PHẦN I. MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu và yêu cầu .................................................................................................. 2 1.2.1. Mục tiêu ............................................................................................................. 2 1.2.2. Yêu cầu .............................................................................................................. 2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3 2.1. Cấu trúc của lông ...................................................................................................... 3 2.1.1. Cấu trúc tổng quan ............................................................................................. 3 2.1.2. Cấu trúc của melanin ......................................................................................... 4 2.1.3. Cấu trúc của keratin ........................................................................................... 4 2.1.4. Các liên kết trong lông ...................................................................................... 5 2.1.4.1. Liên kết cuộn xoắn A ............................................................................... 5 2.1.4.2. Liên kết trong protein keratin ................................................................... 6 2.1.4.3. Liên kết hydrogen ..................................................................................... 6 2.1.4.4. Liên kết muối ............................................................................................ 6 2.1.4.5. Liên kết cystine ......................................................................................... 6 2.1.4.6. Liên kết đƣờng .......................................................................................... 6 2.1.5. Chu kỳ phát triển của lông heo .......................................................................... 6 2.2. Những công trình tách chiết DNA từ lông ............................................................... 7 2.2.1. Những công trình tách chiết DNA từ lông ở nƣớc ngoài ................................. 7 viii 2.2.2. Những công trình tách chiết DNA từ lông ở trong nƣớc .................................. 9 2.3. Phản ứng PCR (polymerase chain reaction) ........................................................... 10 2.3.1. Nguyên tắc cơ bản của PCR ............................................................................ 10 2.3.2. Những thành phần tham gia vào phản ứng PCR ............................................. 10 2.4. Gen halothane ......................................................................................................... 11 2.4.1. Khái quát về gen halothane ............................................................................. 11 2.4.2. Ảnh hƣởng của gen halothane ......................................................................... 12 2.4.2.1. Ảnh hƣởng của gen halothane đến năng suất sinh sản ........................... 12 2.4.2.2. Ảnh hƣởng của gen halothane đến sinh trƣởng và phẩm chất thịt ......... 13 2.5. Những công trình nghiên cứu về halothane............................................................ 13 2.5.1. Nguyên tắc xác định gen halothane ................................................................. 13 2.5.2. Những công trình nghiên cứu halothane ở nƣớc ngoài ................................... 14 2.5.3. Những công trình nghiên cứu halothane trong nƣớc ....................................... 14 PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................... 16 3.1. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 16 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành .............................................................................. 16 3.3. Vật liệu ................................................................................................................... 16 3.3.1. Nguồn mẫu chiết xuất DNA ............................................................................ 16 3.3.2. Đoạn mồi ......................................................................................................... 16 3.3.3. Hóa chất ........................................................................................................... 16 3.3.4. Dụng cụ và thiết bị dùng trong đề tài .............................................................. 17 3.3.4.1. Dụng cụ................................................................................................... 17 3.3.4.2. Thiết bị .................................................................................................... 17 3.4. Phƣơng pháp tiến hành ........................................................................................... 18 3.4.1. Lấy và trữ mẫu ................................................................................................. 18 3.4.2. Tách chiết DNA ............................................................................................... 19 3.4.2.1. Thiết lập quy trình ly trích DNA từ lông heo ........................................ 19 3.4.2.2. Áp dụng quy trình ly trích DNA lên các vị trí khác nhau của lông heo 20 3.4.3. Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế .............................................................. 21 ix 3.4.4. Thực hiện phản ứng PCR ................................................................................ 21 3.4.5. Điện di và quan sát kết quả .............................................................................. 22 3.4.5.1. Chuẩn bị gel agarose ............................................................................. 22 3.4.5.2. Đọc kết quả ............................................................................................ 22 3.5. Xử lý số liệu ........................................................................................................... 22 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 23 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ proteinase K ....................................................... 23 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ DTT .................................................................... 26 4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ CTAB ................................................................. 27 4.4. Thí nghiệm 4: Áp dụng quy trình ly trích DNA lên các vị trí lông heo ................. 29 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 30 5.1. Kết luận ................................................................................................................... 30 5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 30 VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 31 x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp base pair cs cộng sự DNA deoxyribonucleic acid OD optical density DTT Dithiothreitol CTAB Cetyltrimetylamonium bromide PCR polymerase chain reaction PSE Pale, soft, exudative Taq Thermus aquaticus Tỷ số OD tỷ số OD260 nm /OD280 nm UI unit international UV ultra violet W wave KAP keratin associated proteins HP halothane positive HN halothane negative xi DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 2.1. Đặc điểm các lớp của lông ............................................................................. 3 Bảng 3.4. Thành phần hỗn hợp PCR xác định gen halothane ...................................... 21 Bảng 3.5. Chu kỳ nhiệt trong PCR xác định gen halothane ......................................... 22 Bảng 4.1. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ proteinase K ............... 23 Bảng 4.2. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ DTT............................ 24 Bảng 4.3. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ CTAB ......................... 25 Bảng 4.4a. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các vị trí của lông heo .................. 26 Bảng 4.4b. Kết quả PCR ứng với các vị trí lông heo .................................................... 27 xii DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ TRANG Hình 3.4. Phân chia các vị trí lấy mẫu trên sợi lông heo ............................................... 18 Hình 4.1. Kết quả PCR mẫu gốc lông ở 3 nồng độ proteinase K .................................. 24 Hình 4.2. Kết quả PCR mẫu gốc lông ở 3 nồng độ DTT .............................................. 25 Hình 4.3. Kết quả PCR mẫu gốc lông ở 3 nồng độ CTAB .......................................... 26 Hình 4.4a. Kết quả PCR vị trí gốc lông ........................................................................ 28 Hình 4.4b. Kết quả PCR vị trí thân lông ....................................................................... 28 Hình 4.4c. Kết quả PCR vị trí cả sợi lông ..................................................................... 29 Biểu đồ 4.1. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ proteinase K ........... 23 Biểu đồ 4.2. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ DTT ....................... 24 Biểu đồ 4.3. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ CTAB..................... 25 Biểu đồ 4.4. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các vị trí của lông ....................... 27 1 PHẦN I. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Công nghệ sinh học đang ngày càng thể hiện tầm quan trọng trong rất nhiều ngành khoa học, trong đó có ngành chăn nuôi. Việc áp dụng kỹ thuật gen trong nghiên cứu di truyền đã làm tăng hiệu quả của việc cải thiện giống vật nuôi. Một vấn đề đặt ra cho những kỹ thuật gen này là khả năng tách chiết DNA từ nhiều nguồn mẫu khác nhau để đảm bảo độ tinh sạch và giữ nguyên cấu trúc DNA. Tách chiết DNA từ máu, thịt, cơ… rõ ràng không phức tạp và dễ thành công. Các loại mẫu này thƣờng đƣợc dùng trong hầu hết các nghiên cứu. Tuy nhiên, một số nguồn mẫu khác nhƣ lông, da, xƣơng, móng… cũng cần đƣợc quan tâm. Lông có thể là nguồn DNA cho những nghiên cứu không ảnh hƣởng đến cơ thể sống. Tuy nhiên, lông chứa một lƣợng rất nhỏ DNA, do đó tìm ra một phƣơng pháp để tách chiết DNA từ lông là hết sức quan trọng. Vấn đề quan tâm nhất hiện nay đối với mẫu lông là nó có lƣợng nhỏ DNA, chứa nhiều protein ức chế và quy trình tách chiết không đặc hiệu. Do đó, hoàn thiện quy trình tách chiết DNA từ lông cho những thí nghiệm xa hơn là cần thiết. Từ việc thử nghiệm những quy trình ly trích, một bộ kit có thể đƣợc tạo ra sẽ giúp việc tách chiết đƣợc thực hiện nhanh và có thể đƣợc thƣơng mại hóa. Sự phát triển của ngành chăn nuôi hiện nay đặt ra những vấn đề nóng bỏng và cấp bách. Đó là ảnh hƣởng của điều kiện nuôi lên năng suất vật nuôi, chất lƣợng sản phẩm chăn nuôi, nhu cầu ngày càng tăng của con ngƣời, vấn đề lợi nhuận… Để đáp ứng yêu cầu trên, các biện pháp chọn lọc và phối giống đã không ngừng đƣợc áp dụng. Tuy nhiên, trong quá trình chọn lọc, một tình trạng cần quan tâm đó là hội chứng nhạy cảm với stress. Hội chứng này đƣợc điều khiển bởi gen halothane, chi phối nhiều tính trạng về tăng trƣởng, phẩm chất quầy thịt, năng suất sinh sản… đã gây nhiều thiệt hại cho nhà chăn nuôi. Heo nhạy cảm stress có ƣu điểm là tỷ lệ nạc cao, mỡ lƣng thấp, hệ số chuyển biến thức ăn tốt nhƣng có nhƣợc điểm là khả năng sinh sản kém, tỷ lệ thịt PSE cao và tỷ lệ chết sau vận chuyển cao. Nhƣ vậy, một gen chi phối nhiều tính trạng, vừa có lợi vừa không có lợi. Tùy mục đích sử dụng mà ngƣời ta sẽ loại bỏ hay giữ lại 2 gen này. Cho nên, việc phát hiện sớm, nhanh chóng, chính xác gen halothane ở thú trƣớc khi đƣa vào sử dụng là rất cần thiết. Đƣợc sự chấp thuận của Bộ môn Công nghệ sinh học - Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM và sự hƣớng dẫn của PGS. TS. Trần Thị Dân và KS. Nguyễn Văn Út, tôi đã tiến hành đề tài “ Xác định quy trình ly trích DNA từ lông heo”. 1.2. Mục tiêu và yêu cầu 1.2.1. Mục tiêu - Xác định quy trình tách chiết DNA từ lông heo. - Tìm ra vị trí tốt nhất trên sợi lông heo để ly trích DNA. 1.2.2. Yêu cầu - Khảo sát nồng độ các hoá chất để cải tiến quy trình ly trích DNA từ lông heo. - Kiểm tra hiệu quả quy trình ly trích thông qua đo OD và phản ứng PCR. - Áp dụng quy trình ly trích DNA lên các vị trí khác nhau của sợi lông heo. 3 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Cấu trúc của lông 2.1.1. Cấu trúc tổng quan Lông gồm 3 lớp chính: lớp tủy ở trung tâm, lớp vỏ ở giữa và lớp sừng bao bên ngoài. Mỗi lớp gồm những tế bào đƣợc phân hóa từ tế bào mầm trong nang lông. Mỗi lớp của lông đƣợc mô tả theo bảng 2.1. Bảng 2.1. Đặc điểm các lớp của lông Đặc điểm Lớp tuỷ Lớp vỏ Lớp sừng Trọng lƣợng (so với trọng lƣợng sợi lông) <2% 88% 10% Dạng protein chính Trichohyalin Sợi keratin xoắn α, protein liên kết keratin (KAP) Trichohyalin, protein liên kết keratin (KAP) Dạng amino acid chính Glutamate, leucine, glutamine, citrulline Cysteine, serine, glutamate Cysteine, serine, proline, glycine, glutamate Liên kết protein Glutamyl- lysine Cầu nối disulfide, gốc kỵ nƣớc Cầu nối disulfide, nối isopeptide (Nguồn: McNevin và cs, 2005) Trong lớp tủy và lớp vỏ có những hạt sắc tố dạng trứng gọi là melanin. Melanin không tách khỏi DNA bởi những quy trình ly trích thông thƣờng, nó đƣợc biết là yếu tố ức chế phản ứng PCR (theo McNevin và cs, 2005). Yếu tố cấu trúc chính của lông là keratin. Xét theo chiều dài, lông là một cấu trúc bị keratin hoá từ gốc dần lên ngọn. Càng đi xa khỏi gốc thì mức độ keratin hoá càng mạnh, các tế bào mất dần DNA của mình và trở thành một chuỗi protein ở phần ngọn. Phần gốc lông còn chứa nhiều tế bào còn sống (Frandson và ctv, 1969; dẫn liệu từ Nguyễn Văn Út, 2005). Ở độ ẩm thấp, lông chứa hơn 90% dạng protein này. Trong lớp vỏ, những sợi keratin đƣợc gắn với nhau bởi những protein liên kết keratin nhiều 4 sulfur (KAP). Có 2 loại protein keratin biểu hiện ở thú: loại 1 chứa chuỗi polypeptide axit và loại 2 chứa chuỗi polypeptide bazơ. 2.1.2. Cấu trúc của melanin Có 2 loại melanin: melanin nâu đen gọi là eumelanin; melanin đỏ vàng gọi là pheomelanin. Melanin đƣợc tổng hợp từ tyrosine. Eumelanin từ lâu đƣợc nghĩ gồm các polymer nhƣ 5,6–dihydroxyindol acid (DHI) và 5,6–dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA) liên kết chéo với nhau. Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây về đặc tính dẫn điện của melanin chỉ ra rằng melanin có thể gồm nhiều oligomer cơ bản bám dính theo một vài cơ chế nào đó. Vì vậy, cấu trúc phân tử tự nhiên chính xác của melanin vẫn còn là chủ đề đang đƣợc nghiên cứu.