Luận văn Xây dựng qui trình phát hiện escherichia coli trong thực phẩm bằng phương pháp pcr (polymerase chain reaction) và thử nghiệm ứng dụng

BỘ GIÁO DU ÏC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ M IN H ĐOÀN THỊ NGO ÏC TUYỀN X ÂY DỰN G QUI TRÌNH PHÁT HIỆN ESCHERICHIA COLI TRONG THỰC PHẨM BẰN G PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION ) VÀ THỬ N GHIỆM ỨNG DỤNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2005 Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước Đoàn Thị Ngọc Tuyền LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn thầy Trần Linh Thước và thầy Nguyễn Tiến Dũng đã tận tình hướng dẫn em thực hiện luận văn này. Cảm ơn tất cả các thầy cô Khoa Sinh Trường Đại học sư phạm và Trường Đại học Khoa học tự nhiên (Đại học quốc gia Tp Hồ Chí Minh) đã tận tâm giảng dạy trong suốt thời gian em học tập tại nhà trường. Cảm ơn các bạn Huệ, Na, Phượng, Thanh, Ánh và tất cả các bạn của Phòng thí nghiệm Công nghệ Gen - Vi sinh Trường Đại học Khoa học tự nhiên đã tận tình hỗ trợ tôi về mặt cơ sở vật chất cũng như về mặt kĩ thuật. Cảm ơn gia đình đã hỗ trợ vật chất và động viên tinh thần cho con trong suốt thời gian học tập xa nhà. Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước Đoàn Thị Ngọc Tuyền DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AOAC : Assciation of Official Analytical Chemist (Hiệp hội các nhà phân tích nhà nước) bp : Base pair - cặp base CEN : European Committee for Normalization (Hội đồng Châu Âu về chuẩn hóa) dH 2O : Nước cất DNA : Deoxyribonucleic acid d NTP : 3'- Deoxynucleoside - 5' triphosphate ELIS A : Enzyme linked immunosorbent assay (Thử nghiệm hấp thu miễn dịch gắn enzyme) FDA : Food and Drug Administration (Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm) FP : False positive (dương tính giả) FN : False negative (âm tính giả) KDa : Kilo Dalton (1000Da, đơn vị khối lượng protein) RA : Relative accuracy (độ chính xác tương đối) RS-P : Relative sensitivity (độ nhạy tương đối) RS-N : Relative specificity (độ đặc hiệu tương đối) ISO : International Standards Organisation (Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế) Nordval : Nordic Committee on Food Analysis (Hội đồng phân tích thực phẩm Bắc Âu) PCR : Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi tổng hợp nhờ polymerase) TAE : Tris acetic acid – EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) TE : Tris - EDTA Taq : Thermus aquaticus UV : Ultraviolet (tia tử ngoại) WHO : World Health Organization Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước Đoàn Thị Ngọc Tuyền ĐẶT VẤN ĐỀ Vấn đề vệ sinh thực phẩm luôn được đặt lên hàng đầu trong những chương trình phát triển của các quốc gia. Trong những năm gần đây, tình hình ngộ độc thực phẩm có xu hướng gia tăng cả về số lượng lẫn qui mô tác hại ở nhiều nước. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), có đến hơn 50% các vụ ngộ độc thực phẩm là do tác nhân vi sinh vật gây ra [20]. Hiện nay, xuất khẩu thực phẩm đang chiếm tỷ trọng quan trọng trong kinh tế xuất khẩu của nước ta. Sự hội nhập kinh tế theo xu hướng toàn cầu hóa có tác động rất lớn đến các tiêu chuẩn về chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm. Việc đẩy mạnh xây dựng qui trình, cải tiến các trang thiết bị được xem là giải pháp đóng vai trò quyết định, giúp nâng cao năng lực kiểm soát chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm. Về mặt này việc kiểm tra sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm như E. coli, Samonella, Shigella, Virio… có vai trò rất quan trọng. E. coli được xem là vi sinh vật chỉ thị nhiễm khuẩn thực phẩm, là loài vi khuẩn gây bệnh cơ hội có thể gây viêm ruột và tiêu chảy ở trẻ nhỏ, tiêu chảy hội chứng lỵ hay tiêu chảy hội chứng tả. Ngoài ra, E. coli còn gây bệnh viêm đường niệu, viêm khuẩn bàng quang, thận, tuyến tiền liệt, ống dẫn trứng... Qui trình kiểm tra E. coli gây bệnh trong thực phẩm bằng phương pháp truyền thống thường chậm, tốn thời gian (kéo dài 3 - 4 ngày) và độ nhạy thấp. Trong khi đó các phương pháp chẩn đoán phân tử dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử như lai phân tử, PCR... có khả năng khắc phục được các nhược điểm này, đang được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới. Từ bối cảnh nêu trên, thực tiễn sản xuất ở nước ta đã đặt ra yêu cầu cần có phương pháp phát hiện nhanh E. coli gây bệnh trong thực phẩm, thay thế các phương pháp truyền thống, cho phép giám sát tính an toàn và giảm tối đa nguy cơ gây bệnh từ nhóm vi khuẩn này trong thực phẩm. Do vậy, mục tiêu của đề tài luận văn này là thiết lập qui trình phát hiện E. coli trong thực phẩm bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) để thay thế các phương pháp truyền thống. Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước Đoàn Thị Ngọc Tuyền PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. NGỘ ĐỘC TH ỰC PHẨM VÀ VI SINH VẬT GÂY BỆNH QUA THỰC PHẨM 1.1. Mo ät số khái niệm li ên quan Trong lĩnh vực thực phẩm hiện nay, có hai khái niệm đang được sử dụng rộng rãi là vệ sinh thực phẩm và an toàn thực phẩm và một số khái niệm quan trọng khác cần được phân biệt. - Vệ sinh thực phẩm (food hygiene) [7,9] : là khái niệm để biểu thị thực phẩm không chứa vi sinh vật gây bệnh và không chứa độc tố. Khái niệm này cũng bao hàm tình trạng vệ sinh trong khi vận chuyển, chế biến và bảo quản thực phẩm. - An toàn thực phẩm (food safety) [7, 9]: là khả năng không gây ngộ độc của thực phẩm đối với con người bởi vi sinh vật hoặc bởi hóa chất, các yếu tố vật lý. Theo nghĩa rộng, khái niệm này còn được hiểu là khả năng cung cấp đầy đủ và kịp thời về số lượng và chất lượng thực phẩm khi một quốc gia gặp thiên tai hoặc một lý do nào đó. Mục đích của an toàn thực phẩm là việc bảo đảm được thực phẩm không bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh, không chứa độc tố sinh học, độc tố hoá học và các yếu tố khác có hại cho sức khoẻ người tiêu dùng trong các quá trình sản xuất, vận chuyển, chế biến và bảo quản thực phẩm. - Ngộ độc thực phẩm [6,17]: dùng để chỉ tất cả các bệnh gây ra bởi các mầm bệnh có trong thực phẩm. Ngộ độc thực phẩm được chia thành 2 nhóm: + Ngộ độc do chất độc của vi sinh vật tạo ra trong nguyên liệu hoặc hóa chất từ quá trình chăn nuôi, trồng trọt bảo quản, chế biến… Các độc chất này đã có trong thực phẩm trước khi được tiêu thụ. + Ngộ độc do nhiễm trùng: là trường hợp vi khuẩn gây bệnh theo thực phẩm vào cơ thể bằng đường tiêu hóa và tác động tới cơ thể do sự hiện diện của bản thân vi khuẩn hoặc do độc tố của vi khuẩn . - Độc tố [7, 8]: là các hợp chất hóa học có trong nguyên liệu, sản phẩm thực phẩm ở một hàm lượng có thể gây ngộ độc khi được tiêu thụ bởi người hay động vật. Độc tố có thể tồn Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước Đoàn Thị Ngọc Tuyền tại ở nhiều trạng thái khác nhau và được tạo ra trong thực phẩm bằng nhiều con đường khác nhau. Độc tố có nguồn gốc từ vi sinh vật được tạo ra bằng 2 con đường cơ bản sau: + Tế bào vi sinh chứa thành phần có độc tính. Vi sinh vật tăng trưởng thành mật độ cao trong thực phẩm, khi tế bào bị chết đi, độc tố được phóng thích vào thực phẩm. Loại độc tố này được gọi là nội độc tố (endotoxin). + Tế bào vi sinh tổng hợp các protein có độc tính được tiết ra ngoài tế bào. Loại độc tố này được gọi là ngoại độc tố (exotoxin). Nội độc tố và ngoại độc tố khác nhau nhiều về bản chất hóa học, các đặc tính hóa học và phương thức hoạt động. Bảng 1 so sánh một số đặc trưng của hai loại độc tố này. Bảng 1. S o sánh một số đặc điểm c ủa ngoại độc tố và nội độc tố của vi khuẩn [7, 2 6] Ngoại độc tố (exotoxin) Nội độc tố (endotoxin) - Do vi khuẩn còn sống tiết ra - Có ở vi khuẩn Gram dương và Gram âm - Bản chất là protein - Không bền với nhiệt - Độc lực cao - Triệu chứng bệnh đặc hiệu, không gây sốt - Do vi khuẩn chết phóng thích - Có ở vi khuẩn Gram âm, ít ở vi khuẩn Gram dương - Bản chất là lipopolysaccharide - Tương đối bền với nhiệt - Tương đối ít độc - Triệu chứng bệnh không đặc hiệu, hay gây sốt, choáng. 1.2. Những vi sinh vật gây bệnh tr ong thực phẩm thường gặp - Coliform [10]: Coliform và Feacal coliform (coliform phân) là nhóm các vi sinh vật dùng để chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Nhóm coliform gồm những vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý, Gram âm, không sinh bào tử, hình que, lên men đường lactose và sinh hơi trong môi trường nuôi cấy lỏng. Dựa vào nhiệt độ tăng trưởng, nhóm này lại được chia thành 2 nhóm nhỏ là coliform và coliform phân có nguồn gốc từ phân của các loài động vật. Coliform phân có nguồn gốc từ ruột người và các động vật máu nóng bao gồm các giống Escherichia, Klebsiella và Enterobacter. Trong các thành viên của Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước Đoàn Thị Ngọc Tuyền nhóm coliform phân thì E. coli là loài được sự quan tâm nhiều nhất về vệ sinh an toàn thực phẩm. - Escherichia coli [1,10]: vi khuẩn hiện diện trong ruột người và động vật, được thải ra ngoài thiên nhiên theo đường phân nên thường gặp trong đất và nước. Năm 1971 E. coli được xếp vào nhóm các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm và là một vi sinh vật chỉ thị nhiễm khuẩn thực phẩm. Loài này là trực khuẩn Gram âm mang đầy đủ tính chất cơ bản của vi khuẩn đường ruột. Khả năng gây bệnh của E. coli rất đa dạng và tùy thuộc vào vị trí xâm nhập. Đối với nhiễm khuẩn ngoài đường ruột, E. coli gây nhiều bệnh khác nhau với các triệu chứng không đặc trưng và được xem là những vi khuẩn gây bệnh cơ hội (như viêm đường niệu, viêm nhiễm bàng quang, thận, tuyến tiền liệt, ống dẫn trứng hay nhiễm trùng máu). Ngoài ra E. coli còn có thể gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh. Đối với nhiễm khuẩn đường ruột, E. coli gây các bệnh viêm ruột, tiêu chảy ở trẻ nhỏ, tiêu chảy hội chứng lỵ hay tiêu chảy hội chứng tả. - Salmonella [7,10]: là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy ý, không sinh bào tử, di động bằng chu mao. Vi khuẩn này chịu nhiệt kém nhưng chịu được một số hóa chất như brilliant green, sodium lauryl sulfate, selenite, tetrathionate. Người ta đã phân lập được 2324 chủng Salmonella khác nhau. Ngoài nội độc tố Salmonella có thể tạo ra hai loại ngoại độc tố là độc tố ruột (enterotoxin) và độc tố tế bào (cytotoxin). Dựa vào cấu trúc kháng nguyên O và H, người ta chia Salmonella gây bệnh ra thành 3 nhóm: nhóm chỉ gây bệnh cho người, nhóm gây bệnh cho động vật và nhóm gây bệnh cho người và động vật. Ở người Salmonella có thể gây sốt thương hàn (do S. typhi hay S. typhi A, B,C), nhiễm trùng máu (S. cholera-suis), rối loạn tiêu hoá (S. typhimurinum, S. enteritidis). Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể bằng đường miệng qua thức ăn. Vào ruột non, vi khuẩn tăng trưởng xâm nhập vào máu và các cơ quan khác gây viêm . Ngộ độc thực phẩm do nội độc tố của Salmonella gây ra các triệu chứng như nôn mữa, đau đầu, ớn lạnh, tiêu chảy. Sốt xuất hiện vào 12 – 24 giờ sau khi ăn thức ăn có chứa 1 – 10 triệu tế bào Salmonella/g thức ăn. Bệnh kéo dài 2 – 3 ngày, phần lớn bệnh nhân tự phục hồi nhưng cũng có trường hợp tử vong, đặc biệt là người già, trẻ sơ sinh và người suy yếu hệ miễn dịch. - Shigella [7,10]: là trực khuẩn Gram âm, không di động, không sinh bào tử, kỵ khí tùy ý, tăng trưởng ở nhiệt độ từ 10 – 40C, pH 6 – 8, có kháng nguyên O, một số có kháng nguyên K, không có kháng nguyên H. Shigella gồm có 4 loài: S. dysenteriae, S. flexneri, S. boyalia, S. Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước Đoàn Thị Ngọc Tuyền sonnei. Trong đó S. dysenteriae type 1 tạo độc tố thần kinh có độc lực rất cao, đã từng gây những dịch lớn. Tỉ lệ tử vong của bệnh do Shigella cao hơn bệnh do Salmonella. Nhiễm khuẩn Shigella chỉ giới hạn ở đường tiêu hóa chỉ cần 10 – 100 tế bào cũng đủ gây bệnh. Vi khuẩn này tạo hai dạng độc tố. Nội độc tố lipopolysaccharide có ở thành tế bào vi khuẩn gây kích thích thành ruột. Ngoại độc tố vừa tác động lên ruột vừa tác động lên hệ thần kinh trung ương gây các triệu chứng tiêu chảy, ức chế hấp thu đường, axit amin ở ruột non, nếu tác động lên hệ thần kinh có thể gây tử vong. Vi khuẩn sẽ tấn công niêm mạc ruột già tạo vết loét rồi hoại tử. Khi ruột già bị tổn thương gây đau bụng quặn dữ dội, đi tiêu nhiều lần, phân nhầy nhớt và có máu được gọi là hội chứng lỵ Shigella. - Vibrio [6,10]: là phẩy khuẩn, Gram âm, di động nhờ tiên mao ở một đầu, hiếu khí hoặc yếm khí không bắt buộc. Vibrio thường gặp trong thực phẩm, nhất là trong hải sản, gồm khoảng 28 loài, trong đo có 4 loài gây bệnh là V. parahaemolyticus, V. cholerae,V. vulnificus và V. alginolyticus. + V. cholerae là loài vi khuẩn phổ biến trong thiên nhiên gây dịch tả ở người sử dụng nước bẩn và thực phẩm bị nhiễm. Bệnh tả xuất hiện khi V. cholerae xâm nhập vào đường tiêu hóa, qua được hàng rào axit của dịch vị, kết dính vào màng nhầy biểu mô của ruột và tiết ra độc tố ruột. Độc tố ruột V. cholerae là một protein không bền nhiệt, cấu tạo bởi đơn vị A và B. Phần B giúp độc tố gắn vào thụ thể trên bề mặt tế bào ruột là GM1. Tiểu đơn vị A vào ruột tăng hoạt động của adenylcylase khiến tế bào sản xuất cAMP quá nhiều làm tăng tiết ồ ạt nước và chất điện giải từ tế bào thượng bì vào lông ruột gây tiêu chảy. Virio còn có thể tạo hemolysin (chủng Eltor), mucinase làm tróc niêm mạc thượng bì ruột, neuramirdase làm tăng thụ thể tiếp nhận độc tố. + V. parahaemolyticus đa số gây độc trong thức ăn làm viêm ruột. + V. vulnificus hiện diện rộng rãi ở nước biển, hải sản, có khả năng tổng hợp độc tố cytotoxin, hemolysin, cytolysin. Tỉ lệ tử vong bởi độc tố của vibrio thường rất cao. + V. alginolyticus ít gặp và được phát hiện gây bệnh lần đầu tiên vào năm 1971. Vi khuẩn này có khả năng tạo độc tố ruột. Khi vào cơ thể, chúng phát triển rất nhanh trong máu và gây bệnh. Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước Đoàn Thị Ngọc Tuyền - Yersinia [7,10]: là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy ý, không tạo bào tử, tạo độc tố ruột chịu nhiệt. Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể qua da (vết bọ chét cắn), niêm mạc (kết mạc, niêm mạc hầu trong, đường hô hấp). Khi vào cơ thể Yersinia sinh sản rất nhanh, biểu hiện lâm sàng là các hạch trên cơ thể. Vi khuẩn đi vào máu và xâm nhập vào các phủ tạng gây xuất huyết. Thời gian ủ bệnh là 2 – 7 ngày. Sau đó có thể sốt cao và đột ngột, hạch to dần gây đau đớn. Trường hợp nhiễm độc thần kinh, người bệnh cảm thấy bứt rứt, lo âu. Trường hợp nhiễm trùng máu sớm có thể kèm theo nôn mữa, tiêu chảy, nếu nhiễm muộn thì đông máu nội hạch, hạ huyết áp, người trở nên lừ đừ, suy thận, suy tim. - Proteus [8,10]: là vi khuẩn có trong tự nhiên, trong đường tiêu hóa của người và động vật. Thực phẩm bị nhiễm Proteus chủ yếu từ nguồn nước hay từ dụng cụ vật liệu chế biến thực phẩm không được xử lý tốt. Proteus chỉ gây độc khi lượng tế bào trong cơ thể đủ lớn. Độc tố chỉ đóng vai trò phụ trợ để làm tăng khả năng thẩm thấu của niêm mạc ruột, giúp vi khuẩn xâm nhập vào máu nhanh và nhiều hơn. Thời gian ủ bệnh tương đối ngắn (khoảng 3 giờ, đôi khi kéo dài 16 giờ). Khi bị nhiễm khuẩn, người bệnh bị nôn mữa, tiêu chảy cấp, viêm dạ dày, ruột. Nhiệt độ cơ thể tăng. Bệnh xuất hiện rất nhanh nhưng cũng khỏi nhanh. Cơ thể sẽ phục hồi sau 1 – 3 ngày và không gây tử vong. - Staphylococcus [6,10]: là cầu khuẩn Gram dương, tế bào bình thường liên kết với nhau hình thành chùm, thường sống ở da người, đường hô hấp, đường tiêu hoá, quần áo , đồ vật... Staphylococcus tạo 9 loại độc tố chịu nhiệt (A, B, C1, C2, C3, D, E, G, H) và các enzyme có khả năng hỗ trợ cho độc tố gây độc ở người. Nếu bị ngộ độc chỉ sau 1- 8 giờ người bệnh sẽ buồn nôn, ói mữa, tiêu chảy dữ dội, không sốt và phục hồi. Lượng độc tố có thể gây ngộ độc cho người là 2mg. - Clotridium [6,10]: là những trực khuẩn Gram âm, yếm khí, tạo bào tử, nhiệt độ phát triển tối ưu 43 – 47C. Hai chủng gây ngộ độc thực phẩm là: + C. botulium lần đầu tiên được ghi nhận gây ngộ độc vào năm 1973 và có 6 người chết do nhiễm độc. C. botulium có khả năng tạo độc tố thần kinh và rất nhiều độc tố khác nhau (A, B, F, G, G2, D và G). Độc tố thường có độc lực rất cao. + C. perfringens phát triển ở nhiệt độ từ 12 - 50C, bị ức chế ở nồng độ muối NaCl 6%. Phần lớn trường hợp ngộ độc thực phẩm do C. perfringens khi mật độ tế bào trên 106 tế bào/gam Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước Đoàn Thị Ngọc Tuyền thực phẩm. Thời gian ủ bệnh là 8 – 24 giờ. Triệu chứng là đau bụng, tiêu chảy, sốt, buồn nôn. Độc tố của C. perfringens bị bất hoạt ở 60C trong 10 phút. - Listeria [6,10]: loài gây bệnh chủ yếu là L. monocytogenes, là vi khuẩn ưa lạnh, có thể phát triển ở nhiệt độ 2,5 - 44C, thường hiện diện trong trong sữa, thịt, cá, rau và cả nước bề mặt. Triệu chứng bệnh là tiêu chảy, sốt nhẹ. Trường hợp nặng, chủng gây bệnh có thể sinh sản trong các đại thực bào gây nhiễm trùng máu, tác động lên hệ thần kinh trung ương, tim, mắt và có thể xâm nhập vào bào thai trong bụng mẹ gây sẩy thai , đẻ non hoặc nhiễm trùng thai nhi. Ngoài các vi khuẩn thường gặp kể trên còn có nhiều vi khuẩn khác có vai trò nhất định trong việc gây bệnh cho người từ thực phẩm như Bacillus cereus, Campylobacter jejuni, Corynebacterium, Aeromonas hydrophila... - Virus [6,10]: là nhóm vi sinh vật gây bệnh có kích thước nhỏ nhất, thay đổi từ 5- 20nm. Virus gây bệnh ở thực phẩm ít được nghiên cứu do khó nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy thông thường. Có rất nhiều vụ dịch hay ca bệnh từ thực phẩm do virus gây ra nhưng trong nhiều trường hợp người ta không phát hiện được nguồn gốc gây bệnh. Thực phẩm đóng vai trò môi trường lan truyền mầm bệnh. Một số virus trong thực phẩm gây bệnh ở người đã biết là virus Fadeno serotype 40 và 41 g